骨髓间充质干细胞自体移植促进兔缺血肢体的血管生成

背景：常规药物治疗、介入或血管旁路移植手术对下肢动脉闭塞症的远期疗效均不理想。近年来采用干细胞的血管再生疗法在梗死部位修复或重新建立有效侧支循环逐渐成为可能。 目的：验证骨髓间充质干细胞自体移植对兔缺血后肢血管再生的促进作用。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-08/2006-11在江苏省血吸寄生虫病防治研究所完成。 材料：选用新西兰大白兔8只，制备兔后肢缺血模型。按随机数字表法分为2组，实验组及对照组各4只。 方法：分离培养实验组兔骨髓间充质干细胞，5-溴-2-脱氧尿苷标记，将骨髓间充质干细胞制成悬液注射于实验组兔后肢缺血部位；对照组注射等量生理盐水。 主要观察指标：2 周后行兔股动脉二维及彩色多普勒超声检测，观察移植前后的血管内径、血流峰值速度及血流加速时间等；取缺血部位肌肉组织，通过免疫荧光及苏木精-伊红染色观察移植细胞分布及血管生成情况。 结果：细胞移植2周后实验组兔的股动脉内径、血流峰值速度均大于对照组(P < 0.01)，血流加速时间短于对照组(P < 0.01)。免疫荧光染色结果显示实验组兔移植部位有抗5-溴-2-脱氧尿苷染色阳性细胞存在；苏木精-伊红染色结果显示实验组缺血部位血管密度高于对照组。 结论：骨髓间充质干细胞具有促进血管生成的作用，自体移植可望成为一种简单的、有效的治疗下肢缺血的方法。     

人脐带间充质干细胞移植改善糖尿病兔下肢缺血

背景：将骨髓和自体外周血干细胞移植到糖尿病下肢缺血患者的下肢肌肉内后,可促进血管再生,改善和恢复糖尿病下肢缺血患者的患肢血流,但采集风险较大,对患者年龄、身体条件、心理接受程度要求较高。与骨髓和自体外周血干细胞相比,脐带资源丰富,细胞采集简单,免疫原性弱。 目的：探讨人脐带间充质干细胞移植改善糖尿病兔下肢缺血的可行性。 方法：建立糖尿病兔动物模型,结扎双后肢股动脉及分支制备下肢缺血动物模型。取经DIL染料标记的人脐带间充质干细胞悬液分15点(每点平均细胞数约为1.67×106)注射于左后肢缺血部位,右后肢缺血部位注射生理盐水,分别于第2,4周后取双侧后肢内收肌和腓肠肌标本,病理切片观察血管新生程度,CD31免疫组化检测毛细血管密度并进行皮温测定。 结果与结论：病理切片显示移植组较对照组侧支血管明显增多,CD31免疫组化标记移植组较对照组毛细血管密度增加,移植组皮温比对照组明显增高,差异有显著性意义(P ≤ 0.05)。实验结果表明人脐带间充质干细胞移植是改善糖尿病下肢缺血的一种有效手段。     

大鼠自体骨髓间充质干细胞移植诱导缺血肢体血管生成：血浆及缺血组织中单核细胞趋化蛋白1变化的意义

目的：观察大鼠自体骨髓间充质干细胞移植诱导缺血肢体血管生成过程中,缺血组织单核细胞趋化蛋白1的变化。 方法：雄性SD大鼠20只,随机分为模型组、细胞移植组,10只/组。抽取大鼠股骨骨髓,percoll密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞,取传至第3或4代的细胞用于移植。两组大鼠均建立急性双下肢缺血模型,造模后2 h,细胞移植组于双下肢缺血部位缓慢注射1×1011 L-1骨髓间充质干细胞,模型组同法注射等量磷酸盐缓冲液。血管造影和组织学毛细血管密度检查侧支血管形成情况;免疫组化法检查CD68+的巨噬细胞浸润情况;ELISA法检测血浆及缺血组织单核细胞趋化蛋白1蛋白的表达;RT-PCR法检测缺血组织单核细胞趋化蛋白1 mRNA的表达。 结果：移植后28 d,细胞移植组缺血下肢可见明显侧支血管形成,且免疫组化显示CD68+巨噬细胞的浸润少于模型组;与模型组比较,细胞移植组血浆、缺血组织单核细胞趋化蛋白1的蛋白浓度和mRNA表达水平均明显降低(P < 0.05)。 结论：骨髓间充质干细胞移植后,单核细胞趋化蛋白1可能在缺血诱导血管生成的过程中起重要作用,提示其可成为一个调节骨髓间充质干细胞移植炎性血管生成的靶分子。     

兔自体骨髓间充质干细胞移植联合激光心肌血运重建治疗急性心肌缺血

背景：应用骨髓间充质干细胞移植修复坏死心肌，改善心脏功能已受到广泛关注。最近有报道指出激光具有促进骨髓间充质干细胞治疗心肌缺血的作用。 目的：观察兔自体骨髓间充质干细胞移植联合激光心肌血运重建治疗急性心肌缺血的效果。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006-01/07在安贞医院外科实验室完成。 材料：成年雄性新西兰大白兔32只，随机分为4组：模型对照组、细胞移植组、激光组、联合组，8只/组。 方法：造模前3 d，经兔双侧胫骨穿刺抽取骨髓，经密度梯度离心和换液法分离纯化骨髓间充质干细胞，并行BrdU标记。各组兔均在全麻下结扎冠状动脉前降支建立急性心肌缺血模型，2周后，模型对照组在标记部位分3点注射0.6 mL α-MEM培养基；细胞移植组同法注射等量第4代骨髓间充质干细胞悬液，细胞总数约3×106个；激光组应用高功率CO2治疗仪进行激光心肌打孔3个，功率为5 J；联合组在标记点先行激光打孔，再在孔道周围心肌中层注射等量细胞悬液。 主要观察指标：治疗4周后取出心脏，采用抗BrdU及抗肌钙蛋白T双重免疫组化染色检测骨髓间充质干细胞在梗死区心肌存活及分化情况，采用抗CD146免疫组化染色测定毛细血管密度，通过超声测定左室射血分数，通过计算心尖部位位移趋势及运动速度(应变)评价心肌阶段运动功能。 结果：细胞移植组、联合组均检出岛状分布的双染阳性细胞，胞核呈黑色、胞浆呈棕色。与模型对照组比较，细胞移植组、激光组、联合组治疗区血管密度均显著增加(P均< 0.05)，且联合组增加幅度明显高于细胞移植组、激光组(P均< 0.05)，细胞移植组、激光组血管密度基本相似。与治疗前比较，治疗后4周细胞移植组、联合组左室射血分数、心尖段位移和应变值均明显改善(P < 0.05)，且与模型对照组、激光组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。 结论：兔自体骨髓间充质干细胞可在心肌微环境内存活并分化为心肌样细胞，移植后联合激光心肌血运重建在增加心肌毛细血管密度方面优于单纯细胞移植或激光心肌血运重建治疗，在提高心脏功能方面的优势尚需进一步分析。     

骨髓间充质干细胞移植联用氨基胍对大鼠脊髓损伤修复的影响*

背景：体内实验发现,骨髓间充质干细胞可在体内神经组织中分化为神经元样细胞,表达神经元抗原,并且骨髓间充质干细胞的存在对神经元的损伤有保护作用,这可能与骨髓间充质干细胞分泌的活性物质有关。 目的：观察骨髓间充质干细胞移植联用诱导型一氧化氮合酶抑制剂-氨基胍对大鼠脊髓损伤修复的影响。 设计、时间及地点： 随机对照动物实验,细胞学观察,于2006-07/2008-02在河北工程大学附属医院外科实验室和中心实验室完成。 材料：Wistar大鼠36只随机分成对照组、骨髓间充质干细胞组、联合移植组,每组12只。氨基胍由美国Sigma公司提供。 方法：采用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,以Brdu标记细胞核。对照组：制备脊髓半切损伤模型不做处理。骨髓间充质干细胞组：制备脊髓半切损伤模型后,损伤上下各 1 mm处移植骨髓间充质干细胞悬液共2 μL。联合移植组：制备脊髓半切损伤模型后,损伤上下各 1 mm处移植骨髓间充质干细胞悬液8 μL,同时局部给予氨基胍100 mg/kg。 主要观察指标：术后采用斜板试验及改良Tarlov评分评价动物后肢运动功能恢复情况。术后2个月,显微镜下观察移植后脊髓形态结构变化及移植物存活情况。神经微丝和胶质原纤维酸性蛋白免疫组织化学评价移植对脊髓再生的影响。 结果：下肢运动功能评价联合移植组优于骨髓间充质干细胞组,骨髓间充质干细胞组优于对照组。免疫组织化学检测发现,脊髓损伤区有新生束状轴突伸向断端,嗜银染色可见脊髓断端的再生轴突长入断端间组织中,部分连接两端面。损伤阶段脊髓内可见Brdu标记阳性骨髓间充质干细胞存活,灰质分布较白质多,以注射部位向周围损伤组织迁移,联合应用氨基胍组Brdu标记阳性骨髓间充质干细胞存活多。联合移植组术后2个月神经微丝和胶质原纤维酸性蛋白免疫阳性反应的面积比均高于其他各组。 结论：骨髓间充质干细胞联合氨基胍移植促进大鼠半横断脊髓结构和功能恢复的效果明显优于单纯细胞移植组,两者联用具有协同效应。     

骨髓间充质干细胞移植修复肾损伤

背景：研究发现外源性骨髓间充质干细胞能够定居于肾脏并且分化为肾脏细胞，参与损伤肾组织的修复，但对其修复作用途径尚无公认。 目的：探讨外源性骨髓间充质干细胞移植对肾损伤的可能治疗作用。 设计、时间及地点：细胞学体内实验，于2007-03/09在南昌大学泌尿外科研究所完成。 材料：清洁级SD大鼠56只。雄鼠8只用于制备骨髓间充质干细胞，雌鼠48只随机分为细胞移植组、模型对照组、假手术组，16只/组。荧光染料DAPI为Biotium Inc产品，蓖麻血凝素为Vector Laboratories产品，BrdU为Sigma产品。 方法：以密度梯度离心法分离鼠骨髓间充质干细胞，加入DAPI进行标记，调整细胞数为1.5×1010 L-1。细胞移植组、模型对照组建立缺血再灌注肾损伤模型，假手术组开腹后不予结扎肾血管。缺血45 min后，细胞移植组经下腔静脉注入用DAPI标记的骨髓间充质干细胞悬液1 mL，模型对照组、假手术组输入1 mL无菌生理盐水。移植后各组每天腹腔注射BrdU，其后留取血标本和肾组织。 主要观察指标：荧光显微镜及免疫组织化学染色观察移植细胞在肾组织中的分布，采用能与肾小管内腔壁特异结合的蓖麻血凝素鉴定移植细胞的分化，以免疫组化方法检测Brdu反映肾组织细胞的增殖状况，检测血清肌苷、尿素氮水平。 结果：移植后第3天可见少量DAPI阳性细胞，第4天DAPI阳性细胞数明显增加（P < 0.05），且多数DAPI标记细胞能结合蓖麻血凝素，DAPI阳性细胞主要分布于肾脏外髓质肾小管中，肾皮质和内髓质阳性细胞很少，而肾小球内则未见DAPI阳性细胞。假手术组肾组织细胞增殖非常弱，移植后第4天Brdu阳性细胞数明显低于模型对照组（P < 0.05）；移植后第2，3，4天细胞移植组Brdu阳性细胞均明显多于模型对照组（P < 0.05），其分布类似于DAPI阳性细胞。与模型对照组比较，细胞移植组大鼠血清尿素氮水平移植后第1，2天明显降低（P < 0.05）；细胞移植组大鼠血清肌苷水平移植后第1，2，3天均显著降低（P < 0.05）。 结论：移植的外源性骨髓间充质干细胞能够迁移、定居于缺血再灌注损伤后的肾组织中并分化为肾小管上皮细胞；骨髓间充质干细胞移植可促进损伤肾脏本身的细胞增殖再生；对肾损伤后早期肌苷、尿素氮的升高具有一定抑制作用，这种早期对肾功能的保护与其迁移定居到肾脏局部、分化修复损伤的肾小管无关。     

自体骨髓间充质干细胞心肌移植后的分化及存活*☆

背景：骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后是否能迁移、分化及存活,目前尚不清楚。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后,在体内的迁移、分化及其存活。 方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,体外DAPI标记细胞。结扎兔左前降支制作急性心肌梗死模型,造模成功后30只新西兰大耳兔抽签法分为骨髓间充质干细胞组和对照组,每组15只。骨髓间充质干细胞组于冠状动脉结扎后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射自体骨髓间充质干细胞。对照组于相同部位注射等量生理盐水。每点注射体积30 μL。分别于移植后10 min,3 d,4周时各组各处死5只动物。取心脏行冰冻切片,荧光显微镜观察DAPI标记骨髓间充质干细胞的分布情况;免疫荧光法检测标记细胞是否表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ和α-肌动蛋白。 结果与结论：DAPI标记的骨髓间充质干细胞在兔急性心肌梗死模型心脏微环境中,蓝色细胞核分布广泛,呈椭圆形,似心肌细胞核,其排列方向与宿主心肌纤维方向一致,间接免疫荧光法检测胞浆心肌特异性蛋白肌钙蛋白Ⅰ、α-肌动蛋白均为阳性。说明缺血心肌内移植入骨髓间充质干细胞,可在局部微环境的刺激下向心肌细胞定向分化。     

骨髓间充质干细胞移植多器官功能不全综合征兔心、肝、肺器官中凋亡因子Apaf-1的表达*

背景：研究证明多器官功能不全综合征的发病及其器官组织损伤与细胞凋亡和坏死有关,而近年来骨髓间充质干细胞作为种子细胞在修复领域已初现成效。 目的：观察骨髓间充质干细胞移植对多器官功能不全综合征兔受累脏器组织细胞凋亡蛋白酶活化因子1表达的影响。 方法：实验组建立两次打击多器官功能不全综合征动物模型,进行兔自体骨髓间充质干细胞体外培养、扩增、鉴定,慢病毒转基因标记GFP,经股动脉移植,并设立模型对照组及正常组。组织切片观察骨髓间充质干细胞在多器官功能不全综合征动物模型宿主内的存活情况,RT-PCR测定骨髓间充质干细胞移植前后凋亡因子Apaf-1在心、肝、肺重要脏器中的表达。 结果与结论：实验组兔肝、肺脏器组织内有慢病毒转基因标记GFP的骨髓间充质干细胞存在。RT-PCR结果显示正常组织心、肝、肺中均有Apaf-1 mRNA表达,且模型对照组心、脾、肾Apaf-1 mRNA表达较正常组明显增加,而实验组兔心、脾、肾组织中Apaf-1 mRNA表达下降。说明骨髓间充质干细胞具有良好的生物学活性,移植后的骨髓间充质干细胞能够定植在多器官功能不全综合征兔的受损脏器组织内,并下调Apaf-1 mRNA的表达,提示骨髓间充质干细胞移植有望为多器官功能不全综合征提供新的治疗方法。     

骨髓间充质干细胞在心肌梗死犬心肌内分化及对心肌细胞凋亡的影响

背景：体内移植骨髓间充质干细胞对实验动物的心肌梗死和心力衰竭有较好的改善作用，但具体机制尚不清楚。 目的：观察骨髓间充质干细胞在心肌梗死犬梗死区的分化以及对心肌细胞凋亡的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-03/2007-12在美国Texas Heart Institute干细胞研究室进行骨髓间充质干细胞移植，在第三军医大学完成免疫组织化学染色。 材料：成年杂种犬，平均体质量25~35 kg。 方法：采用密度梯度离心法提取犬骨髓间充质干细胞，移植前以BrdU标记骨髓间充质干细胞。采用外科手术于近端冠状动脉左前降支植入布洛芬缩肌装置并结扎相连分支的方法制作犬心肌梗死模型。造模后分为实验组与对照组，实验组于损伤缺血部位注射同种异体骨髓间充质干细胞。对照组注射等量生理盐水。 主要观察指标：对移植BrdU标记的骨髓间充质干细胞的心肌梗死犬心肌梗死区组织细胞进行免疫组织化学染色，同时采用DeadEndTM Colorimetric TUNEL System对心梗标本进行凋亡细胞的染色观察。 结果： 注射骨髓间充质干细胞的心脏组织切片BrdU免疫组织化学染色可见大量细胞核呈现深褐色或黑色的阳性反应，在心脏组织的不同区域表现出不同的形态特征，其中大多数植入心肌细胞间的骨髓间充质干细胞，形态上与心肌细胞无异，而其他区域的骨髓间充质干细胞则与间质细胞较相似，无特定的形状。骨髓间充质干细胞移植组心肌梗死区凋亡的心肌细胞数少于未移植组。 结论：骨髓间充质干细胞心肌内移植后可在心肌梗死区分化成心肌细胞，并减轻犬心肌梗死后的细胞凋亡。     

兔心肌梗死后自体骨髓干细胞移植时机的确立*★

背景：心肌梗死发生后心肌组织将经历炎症反应、心肌纤维化等复杂病理过程，在此期间移植的骨髓干细胞其分化及存活情况均会受到影响。 目的：实验选择兔心肌梗死后不同时间点行自体骨髓干细胞移植，通过心脏病变区域组织学变化分析最佳移植时机。 设计、时间及地点：随机对照细胞观察，于2005-06/2006-04在东南大学试验动物中心完成。 材料：清洁级雄性青紫蓝兔36只，随机分成细胞移植组、模型对照组，每组又设立造模后即刻、造模后2周、造模后4周3个亚组，6只/时间点。 方法：两组兔均采用液氮冷冻法建立心肌梗死模型。细胞移植组自双侧髂骨抽取骨髓，FICOLL法分离骨髓单个核细胞，加入5-氮杂胞苷予以诱导，移植前行Brdu标记，分别于造模后即刻、2周、4周在心肌梗死部位与正常心肌交界处分4点注入制备好的骨髓干细胞悬液，细胞总数1.0×107个。模型对照组按同样方式于对应时间点注入等量DMEM培养液。 主要观察指标：移植后4周心肌组织病理学变化。 结果：免疫组织化学染色结果显示，造模后2周、4周细胞移植组均可见Brdu标记细胞，造模后即刻细胞移植组呈阴性。苏木精-伊红染色结果显示，造模后2周细胞移植组出现心肌样细胞，造模后即刻、4周细胞移植组均呈阴性。模型对照组于各时间点仅观察到瘢痕、纤维组织的出现，未见特异性结构。 结论：兔心肌梗死后第2周是比较适宜的移植时机，植入后的自体骨髓干细胞可向心肌样细胞方向分化。