rAAV2载体介导G卯基因转染树突状细胞

目的：在诱导人骨髓CD34^＋细胞分化成树突状细胞（dendritic cells，DCs）的基础上，探讨2型重组腺相关病毒（Type 2 recombinant adeno-associated virus，rAAV2）载体介导绿色荧光蛋白（green fluo-rescent protein，GFP）基因转染DCs的条件。方法：采用免疫磁珠法分离纯化人骨髓来源的CD34^＋细胞。在含有IL-4和GM-CSF的培养体系中体外诱导CD34^＋细胞生成DCs，于第5天加入TNF-α诱导DCs成熟，在不同时间用rAAV2载体介导GFP基因转染未成熟和成熟的DCs。通过电子显微镜和流式细胞仪鉴定树突状细胞，荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP的表达。结果：人骨髓CD34^＋细胞经诱导分化后，在光镜及透射电镜下均可观察到DCs的形态特征，流式细胞仪检测到DCs表型；荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞培养第3天、第5天和加入TNF-α后的rAAV2-GFP转染率分别为0．45％，13．54％和0．25％。结论：本实验中所采用的培养体系可成功将人骨髓CD34^＋细胞诱导分化成DCs，rAAV2／GFP转染DCs效率随细胞诱导分化时间的延长而增高，且转染未成熟DCs的效率高于转染成熟DCs。     

重组腺病毒介导MRP反义RNA逆转人肝癌细胞多药耐药表型的体外实验研究

目的探讨重组腺病毒介导的多药耐药相关蛋白（MRP）反义RNA对阿霉素诱导的人肝癌耐药细胞株SMMC-7721／ADM多药耐药表型的体外逆转作用。方法应用自行构建的携带反义MRP的重组腺病毒（Ad—Asmrp）,在体外转染人肝癌耐药细胞,测定转染后细胞对阿霉素（ADM）及柔红霉素（DNR）的半数致死量（IC50）并计算耐药倍数（RF值）;在转染后不同时间点用流式细胞仪动态测定细胞对DNR摄取的变化及细胞膜表面P。。表达、并用RT—PCR反映细胞MRP之mRNA水平的变化。结果携带MRP反义RNA的重组腺病毒转染后的人肝癌耐药细胞对ADM、DNR的IC50分别为0．487μg／ml、0．328μg／ml,RF值分别为97．4、109．3,RF值分别下降36．8和35．4。在转染后24h,MRPmRNA水平开始下降并呈持续下降趋势（P〈0．01）,48h后伴有P190蛋白表达的持续下降（P〈0．01）,二者趋势一致。转染后48h,经流式细胞仪测得细胞内DNR浓度明显上升（P〈0．01）。结论重组腺病毒介导的MRP反义RNA可有效封闭MRP基因表达,在体外实验中能增加人肝癌耐药细胞株对化疗药物的敏感性,对肝癌耐药细胞的MDR表型有较好的逆转作用。     

1型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染人脐静脉内皮细胞的体外研究

目的 评价1型重组腺相关病毒(rAAV1)作为新生血管性角膜病变基因治疗载体的可行性.方法 rAAV1-EGFP按转染倍数(MOI)5×103,5×104,5×105转染ECV304细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察ECV304细胞中GFP阳性表达情况和细胞生长形态特点等,流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对EVE304细胞的转染效率.MTT法检测rAAV1-EGFP对EVC304细胞增殖的影响.结果 转染后2 d,MOI=5×105组细胞中的GFP开始表达;表达强度随MOI值的增高而增强,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强,转染后第7天达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对ECV304细胞的转染率分别为45.90％(MOI=5×103),58.56％(MOI=5×104),68.31％(MOI=5×105).AAV1-EGFP转染ECV304细胞后.细胞生长及形态正常.MTT法显示转染后72、96 h各转染组与未转染组之间A值无显著性差异.结论 rAAV1-EGFP对ECV304细胞转染稳定、有效,重组腺相关病毒对细胞增殖无明显抑制,重组腺相关病毒可作为基因治疗角膜新生血管性病变的载体.     

病毒及非病毒载体对U937单核细胞的转染效果

目的：比较研究腺病毒、慢病毒和Lipofectamine 2000 3种方法转染U937细胞的效果差异,以寻找一种简便、高效转染U937细胞的方法。方法：分别采用Lipofectamine 2000介导质粒载体（pGPHI/GFP/Neo）,腺病毒（Adv-GFP-NC）和慢病毒（LV-GFP-NC）3种方法转染U937细胞,于脂质体转染48 h后、腺病毒和慢病毒转染96 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）表达情况,并收集细胞以流式细胞仪检测GFP阳性细胞的比例。台盼蓝染色法计数不同转染方法对细胞活力的影响。结果：Lipofectamine 2000介导质粒载体转染组、腺病毒转染组GFP阳性细胞极少,流式细胞仪检测GFP阳性细胞均＜4%;慢病毒转染组GFP阳性细胞满视野,感染复数=100时,GFP阳性细胞约占90%。台盼蓝染色法显示腺病毒、慢病毒组活细胞率明显高于脂质体组,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论：慢病毒不仅使Lipofectamine 2000和腺病毒能有效地将外源基因导入U937细胞内表达,也是转染U937细胞的理想载体。     

人bFGF重组慢病毒转染BMSCs的实验研究

目的探讨携带人bFGF和GFP基因慢病毒（1enti—bFGF—GFP）转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）及不同MOI（multiplicity of infection）的转染效率。方法实验组：带有bFGF和GFP基因慢病毒感染的BMSCs（bFGF—GFP—BMSCs）。空载体组：带GFP基因慢病毒感染的BMSCs（GFP—BMSCs）。空白组：未经感染的BMSCs;ELISA、RT—PCR检测各组细胞培养72h后bFGF的表达。MOI分别为10、30、50转染BMSCs的转染率。结果bFGF—GFP—BMSCs组表达bFGF蛋白量经ELISA、RT—PCR检测均明显高于GFP—BMSCs组和BMSCs组。MOI为10、30、50、的转染效率分别为36．6％、84．2％、98．5％。结论带有bFGF和GFP基因慢病毒成功转染骨髓间质干细胞并表达,为bFGF基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤奠定了基础。MOI为50时,BMSCs的转染率超过85．0％。     

rAAV-LyoVec载体介导血管抑素及野生型P53治疗C6胶质瘤

目的探讨重组腺病毒相关病毒(recombinant adenovirus-associated virus,rAAV)-阳离子脂质体(LyoVec)载体介导血管抑素(Angiastain)及野生型P53(wild typeP53)联合基因治疗C6胶质瘤。方法构建新型载体rAAV-LyoVec,建立裸鼠C6胶质瘤模型,观察各组不同时间肿瘤体积变化,免疫组织化学分析血管抑素、野生型P53及相关蛋白产物的表达情况,RT-PCR确认血管抑素基因在分子水平表达,电镜观察C6细胞凋亡、病毒转染、组织坏死等,从组织,细胞,蛋白,分子水平研究rAAV-LyoVec载体介导血管抑素及野生型P53联合治疗C6胶质瘤的有效性。结果rAAV-LyoVec载体介导血管抑素及野生型P53基因联合治疗C6胶质瘤,对比血管抑素及野生型P53单基因治疗效果显著(P<0.05),免疫组织化学检测各组细胞P53、VEGF及CD34蛋白均有不同程度的表达。RT-PCR法检测血管抑素在rAAV-angiastain-LyoVec组及rAAV-P53-LyoVec+rAAV-angiastain-LyoVec组表达。结论联合基因治疗是治疗脑胶质瘤的有效...     

siRNA沉默平滑肌细胞Cx43的表达及对细胞增殖的影响

目的通过siRNA介导的RNA干扰技术沉默平滑肌细胞缝隙连接蛋白Cx43的表达，观察其对平滑肌细胞增殖的影响。方法应用阳离子脂质体转染的方法，将化学合成的特异性378siRNA转染平滑肌细胞设为特异性siRNA组，并以转染非特异性siRNA和空白作为对照，半定量RT-PCR法分析转染不同时间（24、48、72、96h）细胞Cx43mRNA表达水平的变化；同时噻唑蓝（MTT）比色法检测平滑肌细胞增殖，观察转染不同浓度（50、100、150、200 nmol／L）378siRNA对细胞增殖的影响。结果半定量RT-PCR结果显示与非特异性siRNA组及空白对照组相比，转染特异性378siRNA后Cx43mRNA表达水平显著地下调并呈时间依赖性特点。MTT结果显示与空白对照组相比，转染低浓度（50nmol／L）378siRNA早期（24、48h）OD值开始降低，但差异无统计学意义（P〉0．05），随着特异性siRNA浓度的升高，0D值显著降低（P〈0．05）。200nmol／L378 siRNA转染72、96h对细胞的增殖抑制率分别为32．51％、42，67％（P〈0．01），并呈浓度依赖性特点；而作为阴性对照的siRNA转染后则无上述作用。结论转染特异性378siRNA可有效沉默平滑肌细胞缝隙连接Cx43mRNA的表达并抑制平滑肌细胞的增殖。     

2型腺相关病毒转导人骨髓CD34+细胞与间充质干细胞

目的:探讨2型重组腺相关病毒(AAV2)载体能否有效转导人骨髓CD34 细胞与间充质干细胞。方法:构建、包装、纯化携带绿色荧光蛋白基因的2型重组腺相关病毒(rAAV22/GFP),转染骨髓CD34 造血干/祖细胞和间充质干细胞,转导后48 h在荧光显微镜下观察GFP的表达,并比较羟基脲(HU)处理前后rAAV2/GFP对CD34 细胞的转染效率。结果:rAAV2/GFP对CD34 细胞的转染效率为5.3%±1.7%。经羟基脲预处理后达13.2%±2.8%,rAAV2/GFP对间充质干细胞的转染效率为23%±3.6%。结论:rAAV2对间充质干细胞的转染效率高于骨髓CD34 细胞,羟基脲预处理可以明显提高rAAV2对CD34 细胞的转染效率。     

ANG-1基因重组腺相关病毒获取及转染猪骨髓干细胞的研究

目的：构建携带血管形成素-1（ANG—1）基因腺相关病毒（AAV）载体,通过病毒包装和纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,并转染到乳猪骨髓干细胞中,获得有效表达,为进行血管再生的基因治疗研究奠定基础。方法：利用PCR技术,获取目的基因ANG-1,通过重组DNA技术得到ANG-1与pUC119的重组质粒,采用SalⅠ和BglⅡ双酶将pUCll9中的目的基因ANG-1基因片断切出,再克隆到质粒pSNAV2．0中。用Lipofeetamine将pSNAVANG-1质粒转染293细胞后,用G418选择培养获得293／AAV：ANG—1细胞株,产生了有传染性的病毒颗粒,纯化并进行病毒DNA颗粒滴度测定。分别将绿色荧光蛋白（GFP）基因重组腺相关病毒（rAAV。GFP）及rAAV2 ANG—1感染猪骨髓干细胞,并对转染效率及转染后表达情况进行初步研究。结果：测序证实ANG—1与GenBank提供的原始序列完全-致。重组载体经酶切鉴定与PCR筛选证实重组质粒和预期结果完全-致,在新的重组质粒中,ANG-1有-套CMV启动子和PolyA终止子系统。293细胞包装病毒效果良好,携带ANG-1的感染性AAV滴度为9&#215;10^11v．g／ml,用Western杂交法检测显示猪骨髓干细胞中表达ANG—1。1&#215;10^6v．g／mlrAAV2GFP感染CD34阳性细胞48h后55％左右的细胞有明显的荧光。结论：ANG-1基因AAV构建成功,并能在骨髓干细胞中有效表达,为严重缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础。     

脂质体方法转染人骨髓基质细胞的影响因素

目的探讨用脂质体介导的方法转染人骨髓基质细胞的影响因素。方法构建真核表达载体pcDNA3-sFlt-1D4，脂质体方法转染人骨髓基质细胞，流式细胞仪检测转染率，ELISA、MTT法检测转基因蛋白sFlt-1D4的浓度及功能。结果转染率为9．27％。ELISA法检测转染后24、48h及4周转基因骨髓基质细胞培养上清中sFlt-1D4蛋白的表达浓度分别为（0．104±0．078）μg／L、（0．158±0．022）μg／L和（0．171±0．069）μ5／L。ELISA法证实转基因组培养上清中血管内皮生长因子（VEGF）含量降低。MTr法证实转染24、48h及4周的转基因产物对K562细胞的抑瘤率分别为（9．41±4．71）％、（23．63±7．50）％和（33．13±6．93）％。结论血清、细胞铺板密度、转染后细胞筛选的方式等是影响转染质量的主要因素。转基因方法可以获得sFlt-1D4蛋白的表达，转基因蛋白具有抑制K562细胞生长的作用。     

乙型肝炎病毒 P区RNA干扰抑制2.2.15细胞乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原分泌的实验研究

目的观察针对乙型肝炎病毒（HBV）P区基因的RNA干扰（RNAi）表达载体pGE—HBVP在HepG2．2．15（2．2．15）细胞中抑制HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）的分泌效应,以阐明HBVP区小干扰RNA（siRNA）抑制HBV复制和蛋白表达的影响。方法构建并鉴定pGE—HBVP,将此载体转染至完整HBV复制模型2．2．15细胞,用化学发光免疫检测法检测并分析转染后不同时间段细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的含量变化,并用免疫细胞化学方法观察转染后细胞中HBsAg的表达变化。结果成功构建了5个针对HBVP区的RNAi表达载体pGE—HBVP1～pGE—HBVP5,其中pGE—HBVP1和pGE—HBVP2具有明显的HBsAg和HBeAg分泌抑制效应和表达抑制效应。抑制率最高的pGE—HBVP2在转染2．2．15细胞效率为30％～40％的基础上,转染后24、48、72和96h培养上清中的HBsAg分泌抑制率分别为28．88％、32．28％、29．10％和18．42％,HBeAg的分泌抑制率分别为38．33％、27．50％、33．41％和12．60％。细胞免疫细胞化学结果显示,pGE-1空载体转染后2．2．15细胞的HBsAg的表达阳性率约为82％,而pGE—HBVP2转染后2．2．15细胞的HBsAg的表达阳性率约为50％,和pGE-1空载体相比阳性率显著下降。结论针对HBVP区的RNAi可以抑制HBV病毒抗原的分泌和表达。     

乙肝病毒X基因对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 探讨乙肝病毒X基因(hepatitis B virus,HBX)对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响.方法 采用脂质体转染法将HBX真核表达载体pcDNA3.1-X转人人肝癌细胞HepG2中,建立表达HBX的HepG2/HBX细胞模型;以转染空载体pcDNA3.1的HepG2/pcDNA3.1细胞为对照,于转染后24、48、72、96 h收集细胞标本,行流式细胞术分析肝细胞凋亡率变化情况,RT-PCR、Western blot分别检测肝癌细胞内HBX和凋亡相关基因Fas、FasL表达以及JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平情况.结果 转染24 h后HepG2/HBX细胞中即检测出HBX表达,且其表达量随时间延长而逐渐增高(P＜0.05);对照组细胞中各时间点均无HBX的表达.转染后各时间点,HepG2/HBX细胞与对照组细胞相比,细胞凋亡率均升高(P＜0.05),Fas、FasL表达量和JNK、c-Jan蛋白磷酸化水平亦均增高(P＜0.05);且HBX mRNA表达量与细胞凋亡率、Fas和FasL表达量以及JNK、c-Jun的磷酸化水平均呈正相关(P＜0.05).结论 HBx可通过上调JNK、c-Jun蛋白磷酸化水平而促进FasL蛋白的表达,从而诱导HepG2细胞凋亡.     

一次大负荷军事训练对武警战士血清MMP-9的影响

【目的】观察一次大负荷军事训练对武警战士血清基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）的影响，探索诊断运动性肌肉损伤和组织修复的敏感标志物。[方法]130名武警战士进行一次大强度负重运动，于训练前、训练后即刻、训练后12、24、48、72和96h测定血清肌酸激酶（creatinekinase，CK）和MMP-9含量。【结果MI练后即刻血清CK显著升高（P〈0．01），24h达峰值（P〈0．01），随后开始下降，96h仍高于安静水平（P〈0．01）。血清MMP-9含量在训练后12h开始升高（P〈0．01），48h达峰值（P〈0．01），96h恢复至正常水平（P〉0．05）。【结论】血清MMP-9可能是运动性肌肉损伤后组织修复的重要标志物，对于训练负荷调控具有重要应用价值。     

miR-143在膀胱癌组织中的表达及意义

【目的】探讨miR-143在膀胱癌组织中的作用及机制,为膀胱癌的临床诊治提供参考。【方法】选用体外培养的T24细胞株作为研究对象,按照处理方式分为si-COX-2转染组、miRNA-143转染组、阴性对照组、空白对照组。Transwell趋化实验和3 H-thymidine 法检测 T24细胞增殖和迁移能力,免疫印迹法检测COX-2蛋白表达变化。【结果】miR-143和si-COX-2转染T24细胞48～72 h后,细胞增殖能力较正常T24细胞相比下降36％～49％（ P ＜0．01）,迁移能力下降81％。免疫印迹结果表明,si-COX-2或miR-143转染的T24细胞内源性COX-2表达水平显著减少至正常T24细胞表达水平的0．39和0．31倍（ P＜0．01）。【结论】miR-143可能通过COX-2通路发挥对膀胱癌 T24细胞的增殖和侵袭的抑制作用并抑制COX-2的表达。提示miR-143可作为膀胱癌的治疗候选药物。     

靶向OPN的miRNA对人肺腺癌细胞株A549顺铂敏感性的影响

目的通过miRNA介导RNAi沉默OPN表达探讨其对人肺腺癌细胞株A549顺铂(DDP)敏感性的影响。方法利用体外构建的靶向OPN的miRNA表达质粒瞬时转染A549,酶联免疫吸咐法(ELISA)检测转染后48h细胞OPN蛋白表达;转染后24、48、72、96h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分别检测转染细胞和转染联合5μg/mL顺铂作用后细胞的增殖;于转染后24h联合不同浓度的顺铂作用48h,MTT法检测细胞增殖抑制率。结果(1)转染后48h,OPN蛋白表达水平下调了47.34%(P0.01)。(2)转染后24h细胞增殖开始受抑制(P0.05),48、72、96h细胞增殖被明显抑制,细胞增殖活性差异均有统计学意义(P0.01)。(3)转染联合顺铂作用24h细胞增殖开始受抑(P0.05),48、72、96h细胞增殖明显受抑,细胞增殖活性转染组与未转染组及非特异性转染组差异均有统计学意义(P0.01)。转染后24h联合不同浓度的顺铂作用48h,当顺铂浓度为2.5、5、10、20μg/mL时,细胞增殖被明显抑制,细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(P0.01)。结论靶向OPN的miR-NA抑制人肺腺癌细胞A549增殖,增强细胞对DDP的敏感性。     

肝细胞生长因子在人肝细胞中的表达及对肝细胞损伤的保护作用

目的　构建肝细胞生长因子 (HGF)真核细胞表达载体 ,并观察其在人正常肝细胞中的表达以及对细胞增殖和抗损伤能力的影响。方法　利用基因重组技术将HGF与绿色荧光蛋白 (GFP)融合并构建真核表达质粒 ,通过脂质体介导法 ,导入正常人肝细胞系中。用荧光显微镜以及免疫组织化学方法观察HGF表达情况。采用 [3 H] TdR掺入DNA法、PCNA免疫组织化学观察肝细胞DNA合成 ,了解肝细胞增殖能力的变化。用CCl4造成急性肝细胞损伤 ,通过测定细胞存活率、细胞内丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、K+ 的漏出量了解肝细胞的抗损伤能力。结果　酶切鉴定证实HGF片断已克隆到pEGFP N3 的BamHⅠ和SalⅠ位点之间 ,在转染人正常肝细胞后 ,利用荧光显微镜观察可见到绿色荧光蛋白的表达 ,用免疫组化方法进一步证实了HGF蛋白在细胞中的表达。 [3 H] T转导HGF的肝细胞的DNA合成明显增加 (转染 96h后 ,[3 H] TdR掺入量为对照组的 7倍 )。PCNA免疫组化结果显示转导HGF的肝细胞阳性率明显增加 ,肝细胞增殖活性增加。转导HGF的肝细胞抗CCl4损伤的能力明显增强 ,肝细胞存活率显著提高 (83%与 6 1% ,P <0 0 5 ) ,细胞内丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、K+ 的漏出显著降低 (分别为 35 16U·L-1与 6 5 31U·L-1,P <0 0 1,5 5 9mmol/L与 6 0 2mmol/L ,P     

bcr-abl融合基因特异性siRNA对K562细胞生物学特性的影响

目的 应用特异性siRNA(小干涉RNA)抑制慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因表达,观察其对K562细胞生物学特性的影响。方法 以慢性粒细胞白血病细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21ntsiRNA,应用Western blot法检测bcr-abl融合基因的表达;^3H-TdR掺入法检测K562细胞的增殖活性;Annexin V-FITC／PI染色法检测K562细胞的存活状况;流式细胞仪法检测K562细胞周期变化以及联苯胺染色法检测K562细胞的分化状况;应用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-xL／Bax的表达。结果 (1)RNA干涉组：K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降;(2)RNA干涉组的CPM值(每分钟脉冲数)在siRNA转染K562细胞第24h,48h,72h和96h均明显低于对照组(下降率依次为33．06％,52．25％,57．64％,70．87％),(3)RNA干涉组转染48h时有43．2％的K562细胞发生凋亡;(4)RNA干涉组：K562细胞凋亡相关蛋白Bcl-xL的表达水平下调,但Bax的表达无明显变化;(5)RNA干涉组：K562细胞联苯胺染色阳性比例增加,部分K562细胞向红系分化;(6)RNA干涉组K562细胞出现明显的G1期阻滞。结论 特异性siRNA分子可以显著抑制bcr-abl融合基因的表达,影响：K562细胞的基本生物学特性,最终导致K562细胞分化或凋亡。     

重组腺病毒介导的HSP70转染对肠上皮细胞缺氧再复氧损伤的防护作用

目的　研究重组腺病毒介导的热休克蛋白 70转染对肠上皮细胞缺氧再复氧损伤的保护作用。方法　将重组含人全长HSP70基因的腺病毒载体 (AdCMVHSP70 )转染体外培养的肠上皮细胞株IEC 6 ,检测转染细胞HSP70的基因表达水平。对照组 (转染空载体组 )、转染HSP70 2 4h、48h及72h组IEC 6细胞经缺氧再复氧处理后 ,分别对细胞的活力、凋亡及死亡水平进行检测分析。结果AdCMVHSP 70转染组细胞HSP70基因表达为阳性 ,对照组无表达。经缺氧再复氧处理后 ,AdCMVHSP70转染组细胞活力较对照组明显增强 (P <0 0 1 ) ,Annexin V Flous试剂盒检测死亡细胞明显减少 (P<0 0 1 ) ,凋亡有一定水平的抑制 (P <0 0 5)。结论　重组腺病毒介导的HSP70转染可保护肠上皮细胞抵抗缺氧再复氧损伤 ,具有明确的细胞保护作用。而其具体保护机制可能与抑制细胞凋亡有关     

急性有机磷农药中毒血清酶学动态变化与存活率关系的研究

目的：探讨急性有机磷农药中毒血清淀粉酶（ＡＭＹ）、肌酸激酶（ＣＫ）、及其同工酶（ＣＫ－－ＭＢ）、谷草转氨酶（ＧＯＴ）、谷转丙氨酸（ＧＰＴ）动态变化与存活率的关系。方法：对急性有机磷中毒８５例患者分别于中毒后３ｈ、６ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ、７ｄ,采取静脉血测定ＡＭＹ、ＣＫ、ＣＫ－－ＭＢ、ＧＯＴ、ＧＰＴ,并与６０名正常对照进行比较。结果：急性有机磷农药中毒患者血ＩＧＥ ＩＰＧＨＯＷ     

miR-146a在HepG2.2.15细胞中对c-Myc基因表达影响的研究

目的 构建has-miR-146a真核过表达载体pmR-146a,探究其在HepG2.2.15肝癌细胞中对c-Myc基因的表达调控作用.方法 PCR扩增has-miR-146a的前体基因片段(pre-has-miR-146a),双酶切后连接到pmR-mCherry载体上,通过菌落PCR、双酶切和测序验证重组载体的准确性;将重组载体转染到HepG2.2.15肝癌细胞中作为实验组,同时设空载体组(转染pmR-mCherry空质粒组),空白组(转染试剂Lipofectamin0 2000+ PBS),24、48 h后观察载体荧光蛋白表达量,qPCR检测各组细胞has-miR-146a表达情况;转染24、48 h后qPCR检测c-Myc基因mRNA表达量,48 h后Western blot检测c-Myc蛋白表达水平.结果 经菌落PCR、双酶切和测序证实,pre-has-miR-146a基因片段插入pmR-mCherry载体中;实验组和空载体组转染24、48 h荧光显微镜观察可见强荧光,与非荧光条件下作对比,转染效率在50％～60％;实验组has-miR-146a表达量明显高于空载体组和空白组(P＜0.01);转染24、48 h后实验组细胞c-Myc基因mRNA表达量较空载体组和空白组低(P＜0.05);转染48 h后,蛋白表达量较空载体组和空白组低(P＜0.01).结论成功构建has-miR-146a真核过表达载体pmR-has-146a,该重组载体可稳定表达has-miR-146a;has-miR-146a可以下调c-Myc癌基因的表达,可以作为治疗原发性肝癌的潜在靶点之一.