辛伐他汀对体外培养人脐静脉血内皮祖细胞扩增及黏附能力的影响

背景:他汀类药物可促进急性缺血后的血管新生、加速球囊损伤血管的再内皮化并减少新内膜下组织的增生,且这两个作用均与血管内皮祖细胞密切相关.目的:通过体外培养人脐静脉血血管内皮祖细胞,观察辛伐他汀对血管内皮祖细胞扩增及黏附能力的影响.设计、时间及地点:以细胞为观察对象,分组对比实验,于2006-02/10在吉林大学基础医学院病理生理教研室完成.材料:人脐静脉血采集来源于吉林大学第二临床医学院妇产科6名正常足月顺产健康产妇.方法:密度梯度离心法分离培养人脐静脉血血管内皮祖细胞.通过免疫荧光法观察内皮细胞吸收乙酰化低密度脂蛋白和荆豆凝血素Ⅰ情况,流式细胞仪定量检测血管内皮祖细胞表面CD133、CD34和KDR抗原表达阳性率来鉴定血管内皮祖细胞.倒置显微镜下观察血管内皮祖细胞形态学变化,计数细胞并绘制生长曲线.实验按M199培养基含辛伐他汀纯品浓度不同分5组,分别为0, 0.01,0.1,1,10 μmol/L 辛伐他汀组,其中0 μmol/L作对照.四甲基偶氮唑盐比色法观察血管内皮祖细胞增殖情况,计数贴壁细胞数法评价血管内皮祖细胞的黏附程度.主要观察指标:原代培养血管内皮祖细胞形态变化;各组细胞增殖及黏附能力.结果:①培养细胞呈长梭形,接种2～4 d 梭形形态细胞较少,为细胞生长的潜伏期;6～10 d 贴壁梭形细胞逐渐增多,为对数增殖期;10～14 d 细胞融合呈集落样生长,梭形细胞明显增多,进入生长平台期.②激光共聚焦显微镜鉴定乙酰化低密度脂蛋白、荆豆凝血素Ⅰ双染阳性的细胞为正在分化的血管内皮祖细胞.③流式细胞仪检测细胞表达CD133、CD34和KDR抗原的阳性率分别为(7.30±2.71)%、(42.00±6.42)%,(89.30±10.45)%.④四甲基偶氮唑盐比色结果表明各浓度组血管内皮祖细胞增殖活力、贴壁的血管内皮祖细胞数均较对照组增强(P < 0.05);但以1 μmol/L 浓度下血管内皮祖细胞增殖活力最强.结论:辛伐他汀能增强体外培养血管内皮祖细胞的扩增及黏附能力.     

兔骨髓源性血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

本研究探讨兔骨髓源性血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)的分离、培养及鉴定方法。抽取兔骨髓细胞,用梯度密度离心法获得单个核细胞,以内皮细胞培养液培养,通过细胞形态观察、免疫组织化学试验、流式细胞术以及内皮祖细胞吞噬功能进行鉴定。结果表明,新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养48小时后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接呈梭形的内皮样细胞。内皮祖细胞免疫组织化学检测结果显示CD133(+),CD34(+),Ⅷ因子(++),KDR(++);流式细胞术鉴定结果显示CD133的阳性率为(18.23±7.12)%,CD34的阳性率为(47.71±14.85)%,CD31的阳性率为(71.61±13.51)%,KDR的阳性率为(87.24±11.40)%。细胞吞噬功能鉴定说明超过80%的贴壁细胞都特异性地摄取了Dil-acLDL和FITC-UEA-1。结论:密度梯度离心法体外分离兔骨髓源的单个核细胞,在一定的诱导培养条件下能分化成为血管内皮祖细胞。     

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养与鉴定

背景：内皮祖细胞参与血管新生,但其分离、培养、鉴定方法目前并不统一。目的：探索大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养及鉴定方法。方法：使用密度梯度离心法及差速贴壁法联合的方法培养内皮祖细胞,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化,使用Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1双荧光染色、流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD133表达情况。结果与结论：培养前4d细胞增殖不明显,第5～10天迅速增殖,并可见细胞集落及线状结构形成。培养第7天的内皮祖细胞具有吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1的功能。流式细胞仪检测体外培养第10天的细胞,CD133＋细胞占19.2%,CD34＋细胞占28.7%,CD34＋/CD133＋细胞占19.1%。说明密度梯度离心法联合差速贴壁法可在体外有效分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞。     

体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞及其生物学特性鉴定

背景:现阶段急需建立一种稳定的体外分离培养内皮祖细胞的方法,骨髓中内皮祖细胞的含量丰富,增殖能力强,而且容易获得,操作简单.目的:拟在体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞,并对其生物学特性进行鉴定.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-08/12在重庆医科大学附属第一医院中心实验室完成.材料:清洁级2周龄SD大鼠20只,由重庆医科大学实验动物中心提供.方法:无菌条件下分离大鼠股骨和胫骨,用预冷至4℃的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔,以密度梯度离心法收集单个核细胞层,含体积分数为20%胎牛血清的M199培养液重悬细胞,制成单细胞悬液后进行细胞计数,按1×109L-1浓度接种到预先用纤维连接蛋白包被的培养瓶中,37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度恒温培养.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态变化,免疫细胞化学检测内皮祖细胞表面特异性抗原CD133、内皮祖细胞表面抗原CD34和血管内皮生长因子受体KDR的表达,并进行流式细胞仪定量分析和细胞生长曲线分析.结果:新分离获得的骨髓单个核细胞为小圆形,培养4 d后贴壁细胞呈"集落"样生长,中间为圆形贴壁细胞,外周梭形细胞较多,传代后梭形细胞首尾相连,呈"毛细血管"样排列.培养第4,7,10,14天贴壁细胞CD34,KDR,CD133均呈阳性表达,CD133阳性细胞第10天时开始减少.流式细胞仪检测结果显示,CD133/KDR双阳性细胞率逐渐升高,10 d时达峰值,随后下降.KDR阳性细胞率随培养时间的延长而逐渐升高.原代细胞生长曲线显示细胞在第3～6天处于指数生长期,贴壁细胞大量增殖,呈"集落"样生长.结论:采用密度梯度离心法可成功从SD大鼠骨髓中分离获得内皮祖细胞,加入M199培养液后能够贴壁增殖,并可以分化为内皮细胞.     

人脐带血内皮祖细胞与血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共培养及其增殖和迁移能力

背景：目前组织工程心脏瓣膜再内皮化种子细胞主要来源于成熟内皮细胞,内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞越来越受到人们的关注。目的：分离和扩增人脐带血内皮祖细胞,观测其体外生物学特性。方法：密度梯度离心法分离新鲜的脐血中单个核细胞,在含血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的培养液中培养扩增,通过形态学、免疫荧光和流式细胞仪等对贴壁细胞进行鉴定;并与脐静脉内皮细胞进行增殖和迁移能力比较。结果与结论：随着培养和诱导时间延长,贴壁细胞形态发生明显的改变,从小圆形变成梭形,逐渐分化成典型成熟内皮细胞的鹅卵石样形态,并可形成特征性的克隆;体外诱导7d后90%以上贴壁细胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性;贴壁细胞流式细胞仪分析显示：培养7d的细胞VEGFR-2、CD34和CD133表达分别占（77.4±4.9）%、（52.4±6.6）%和（19.4±2.1）%,培养28d的细胞VEGFR-2和CD34表达分别占（81.1±7.4）%和（7.6±3.1）%,而未检测到CD133表达;人内皮祖细胞增殖和迁移能力明显高于人脐静脉内皮细胞（P〈0.05）,并且细胞数量可扩增达109L-1。结果显示用密度梯度离心法和贴壁筛选法,可从人脐带血分离、纯化内皮祖细胞;内皮祖细胞可诱导分化为内皮细胞,增殖和迁移能力都很强。     

人脐带血内皮祖细胞与血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共培养及其增殖和迁移能力

背景:目前组织工程心脏瓣膜再内皮化种子细胞主要来源于成熟内皮细胞,内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞越来越受到人们的关注。目的:分离和扩增人脐带血内皮祖细胞,观测其体外生物学特性。方法:密度梯度离心法分离新鲜的脐血中单个核细胞,在含血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的培养液中培养扩增,通过形态学、免疫荧光和流式细胞仪等对贴壁细胞进行鉴定;并与脐静脉内皮细胞进行增殖和迁移能力比较。结果与结论:随着培养和诱导时间延长,贴壁细胞形态发生明显的改变,从小圆形变成梭形,逐渐分化成典型成熟内皮细胞的鹅卵石样形态,并可形成特征性的克隆;体外诱导7d后90%以上贴壁细胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性;贴壁细胞流式细胞仪分析显示:培养7d的细胞VEGFR-2、CD34和CD133表达分别占(77.4±4.9)%、(52.4±6.6)%和(19.4±2.1)%,培养28d的细胞VEGFR-2和CD34表达分别占(81.1±7.4)%和(7.6±3.1)%,而未检测到CD133表达;人内皮祖细胞增殖和迁移能力明显高于人脐静脉内皮细胞(P<0.05),并且细胞数量可扩增达109L-1。结果显示用密度梯度离心法和贴壁筛选法,可从人脐带血分离、纯化内皮祖细胞;内皮祖细胞可诱导分化为内皮细胞,增殖和迁移能力都很强。     

人脐血两种类型内皮祖细胞的体外分化研究

[目的]研究人脐带血中两种类型内皮祖细胞的体外分化特征.[方法]采用6%羟乙基淀粉沉降法和密度梯度离心法联合分离脐带血中单个核细胞,在含有VEGF和bFGF的培养基中培养.通过形态学、免疫荧光、RT-PCR和流式细胞分析细胞的生长特点和生物学特征.[结果]贴壁细胞分成两种类型的细胞,早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞;早期内皮祖细胞的形态从小的圆形细胞变成以集落为中心,周围呈发芽式向外生长的细胞群,晚期内皮祖细胞形成典型的"铺路石样".摄取DiI-acLDL及通过FITC-UEA-I染色初步鉴定内皮祖细胞.RT-PCR提示不同时间点内皮特异性基因表达变化,流式细胞分析不同时间点AC133、CD34、KDR的变化.[结论]在人的脐带血中获得两种类型的EPCs,为进一步研究EPCs提供实验基础.     

系统性硬皮病患者外周血内皮祖细胞数量及分化功能的研究

目的探讨系统性硬皮病（Systemic scleroderma,SSc）患者外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）数量和分化功能的变化。方法选取女性SSc患者及健康志愿者各20例,抽取外周血20 ml,密度梯度离心法分离单个核细胞,以CD133/CD34、CD133/VEGFR2双荧光标记鉴定细胞,CD34/CD133/VEGFR2三荧光标记流式检测EPCs数量;分别以PE标记抗人CD14,FITC标记抗人CD64,PerCP/Cy5.5标记抗人VEGFR2,流式细胞仪检测单阳性细胞率,进而比较分化功能。结果 SSc患者外周血EPCs表达阳性率（3.18±1.97）%,较健康对照的（20.56±4.37）%明显下降,差异有统计学意义（P〈0.01）;培养7天后,外周血单个核细胞表达单核细胞表面标志CD14＋、CD64＋细胞百分率（32.49±5.41）%、（30.57±4.83）%,与对照组的（14.76±2.37）%、（15.39±2.09）%比较明显增加,差异均有统计学意义（均P〈0.01）,而内皮细胞表面标记KDR＋细胞百分率（68.38±4.65）%与对照组的（89.81±5.13）%比较明显减低,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 SSc患者循环内皮祖细胞数量减少,分化功能降低。     

全骨髓培养法扩增小鼠内皮祖细胞

背景：对于小型实验动物,通过分离骨髓单个核细胞进行内皮祖细胞培养、扩增的方法较为繁琐。目的：探讨采用全骨髓培养方式扩增小型动物内皮祖细胞的可行性。方法：采用全骨髓培养分离C57BL/6小鼠内皮祖细胞,培养第7天行DiL-acLDL和FITC-UEA-1双荧光染色检测,并利用流式细胞仪检测其CD34、FLK-1表达情况。同时检测其体外血管生成能力,黏附、增殖和迁移能力。设立骨髓单个核细胞培养法为对照。结果与结论：全骨髓培养至第2天便可见早期内皮祖细胞集落形成,第7天时可见大量短梭状内皮祖细胞,其具有吞噬DiL-acLDL及结合FITC-UEA-1的能力,内皮祖细胞在基质胶上同样能够形成血管样结构,培养至第2周晚期内皮祖细胞集落出现,迅速生长形成典型的铺路石样,并能够在体外传代培养,细胞数量、细胞表面CD34、FLK-1表达、体外黏附、增殖和迁移能力及晚期集落出现时间与对照组差异无显著性意义（P〉0.05）。说明采用全骨髓培养的方式能够实现小型动物内皮祖细胞的筛选扩增,且操作简便。     

全骨髓培养法扩增小鼠内皮祖细胞☆

背景:对于小型实验动物,通过分离骨髓单个核细胞进行内皮祖细胞培养、扩增的方法较为繁琐.目的:探讨采用全骨髓培养方式扩增小型动物内皮祖细胞的可行性. 方法:采用全骨髓培养分离C57BL/6小鼠内皮祖细胞,培养第7天行DiL-acLDL和FITC-UEA-1双荧光染色检测,并利用流式细胞仪检测其CD34、FLK-1表达情况.同时检测其体外血管生成能力,黏附、增殖和迁移能力.设立骨髓单个核细胞培养法为对照. 结果与结论:全骨髓培养至第2天便可见早期内皮祖细胞集落形成,第7天时可见大量短梭状内皮祖细胞,其具有吞噬DiL-acLDL及结合FITC-UEA-1的能力,内皮祖细胞在基质胶上同样能够形成血管样结构,培养至第2周晚期内皮祖细胞集落出现,迅速生长形成典型的铺路石样,并能够在体外传代培养,细胞数量、细胞表面CD34、FLK-1表达、体外黏附、增殖和迁移能力及晚期集落出现时间与对照组差异无显著性意义(P>0.05).说明采用全骨髓培养的方式能够实现小型动物内皮祖细胞的筛选扩增,且操作简便.