组织工程软骨体外构建的相关实验研究

目的 探索组织工程软骨体外构建技术体系可行性.方法 种子细胞选用胎儿软骨细胞(口服药物流产胎儿,胎龄3～6个月).酶消化法获得第1代细胞,以50×106/ml浓度均匀接种于经聚乳酸(PLA)包埋聚乙醇酸(PGA)高分子聚合物支架,形成细胞-支架复合体,在体外静态培养.分别于2周、4周、8周进行大体观察、扫描电镜及组织学检测.结果 体外构建的组织工程软骨,随培养时间延长,色泽由2周时的乳白色逐渐呈现半透明,8周时接近正常软骨外观.扫描电镜显示软骨细胞与材料具有良好相容性,培养7天PGA纤维之间有基质沉积.HE染色示2周有大量软骨陷窝形成和均匀嗜碱性基质分泌,Safranin'O染色示基质有酸性蛋白多糖分布,Massons's trichome染色示基质有胶原成分,但含量较少,经免疫组织化学检测为特异Ⅱ型胶原.培养4周胶原成分开始明显增多,软骨陷窝形态接近成熟,8周细胞外基质蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量丰富且分布均匀.结论 以成熟软骨细胞为种子细胞,运用组织工程技术在体外能构建出具有正常软骨组织结构特征的人组织工程软骨.     

胶原涂层聚羟基丁酸羟基戊酸酯体外构建组织工程半月板

目的观察Ⅰ型胶原涂层的聚羟基丁酸羟基戊酸酯（PHBV）对半月板纤维软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响，评价其作为半月板组织工程支架的可行性及价值。方法构建Ⅰ型胶原涂层的PHBV半月板假体，将体外培养的兔半月板纤维软骨细胞吸附于该支架上三维立体培养。通过相差倒置显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架对半月板纤维软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。结果PHBV能制成具有一定力学强度的半月板假体。通过Ⅰ型胶原涂层后增强了其细胞吸附能力，半月板纤维软骨细胞在支架孔壁贴附良好。维持表型稳定，分泌胞外基质。结论Ⅰ型胶原涂层的PHBV支架细胞相容性良好，能按半月板的大小、形状制成有一定力学强度的半月板假体，是比较理想的半月板组织工程支架材料。     

离心力在体外构建组织工程软骨中的作用

目的探讨离心力对软骨细胞功能表达和组织工程软骨结构的影响。方法采用组织化学和免疫组织化学观察组织工程软骨结构以及Ⅱ型胶原表达情况,应用DMMB分光法测定组织工程软骨硫酸化糖胺多糖(GAG)的含量。结果体外培养2、4、8周时,静态培养的组织较离心培养的组织Ⅱ胶原免疫组织化学染色弱;并且其GAG含量低于离心培养组织GAG含量,各组差异均有统计学意义(F分别为12.3、10.2、9.1,P<0.05)。离心培养的组织工程软骨GAG含量于第4周达到高峰,均值为(7.60±0.79)%。结论离心力刺激软骨细胞分泌GAG和Ⅱ型胶原,并且影响组织工程软骨结构的排列。     

人组织工程软骨的实验研究

目的　了解组织工程研究的基本原理 ,完善制作组织工程化人软骨的技术方法 ,探讨天然可吸收材料组织 ,引导再生胶原膜作为人软骨细胞体外培养支架的可行性 ,为广泛开展组织工程的研究与应用开辟新的途径。方法　利用组织工程技术制作人组织工程化软骨 ,并应用组织学方法 ,对获得的人组织工程化组织形态和功能进行表征。结果　培养的软骨细胞均匀沉降于医用组织引导再生胶原膜上 ,1周后形成一层乳白色软骨样组织 ;植入 8周后从裸鼠体内获得软骨样组织 ,组织学检测证实软骨细胞的存在 ,软骨细胞可以分泌硫酸软骨素。结论　医用组织引导再生胶原膜以其特有的三维结构和细胞网结功能 ,可以作为组织工程技术应用研究中软骨细胞培养的支架 ;利用组织工程技术 ,能够完成人组织工程化软骨的制作。     

Ⅰ型胶原半月板支架负载纤维软骨细胞体外培养

[目的]观察Ⅰ型胶原半月板支架对纤维软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响，评价其作为半月板组织工程支架的可行性及价值。[方法]构建Ⅰ型胶原半月板支架，将体外培养的兔半月板纤维软骨细胞吸附于该支架上三维立体培养，通过相差倒置显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架对半月板纤维软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。[结果]Ⅰ型胶原能制成理想大小、形状的三维立体多孔半月板支架，纤维软骨细胞在支架孔壁贴附良好，维持表型稳定，分泌胞外基质。[结论]Ⅰ型胶原半月板支架细胞相容性良好，但力学性能相对较差，通过与其它生物材料复合以提高其机械力学强度，可望制得理想的半月板组织工程支架。     

组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的初步研究

目的 探讨运用组织工程软骨植入修复兔胫骨平台外侧髁全关节软骨浅层缺损的可行性。方法 取2周龄乳兔软骨细胞体外培养传代至第3代后，与人胎盘I型胶原蛋白海绵复合后植入成年兔的胫骨体平台外侧髁浅层完全软骨缺损区，并设立空白对照组，分别于术后4、12和24周取材，观察修复效果。结果 实验组术后4周缺损表面未见明显的新生软骨形成；12周，缺损表面有少量的新生软骨形成，组织学切片上可见软骨细胞呈边缘不规则的，小蜂窝状结构，软骨细胞周围有软骨陷窝形成；24周，缺损表面的新生软骨较4、12周的新生软骨明显，表面光滑，且与周围组织结合紧密，但仍存在部分缺损尚未修复。组织学切片上可见软骨陷窝形成，并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质。面对照组则均未见明显的修复。结论 制成的组织工程软骨对兔胫骨平台软骨浅层完全缺损有修复作用，但不能完全修复缺损。     

胶原-透明质酸-硫酸软骨素复合三维支架体外构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨以胶原(collagen,Col)透明质酸(hyaluronic acid,HA)硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)为支架材料构建组织工程软骨的可行性.方法以乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐为交联剂通过冷冻干燥的方法制备Col-HA-CS复合支架及单纯Col支架.通过扫描电镜、HE染色对Col-HA-CS复合支架材料形态进行观察.分离培养幼兔关节软骨细胞,将体外扩增的软骨细胞接种在两种支架上,通过组织学、扫描电镜观察软骨细胞在支架上的生长形态;通过生物化学功能检测细胞-支架复合物中DNA、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量;RTPCR方法检测在Col HA CS复合支架上的软骨细胞ColⅡ的表达情况.结果软骨细胞在Col-HA-CS复合支架材料上增殖分化良好,并保持软骨细胞特异的分化ColⅡ表型,培养21 d后已有软骨样组织形成,出现软骨陷窝.DNA和GAG含量测定显示软骨细胞在复合支架上随时间增加逐渐扩增并分泌大量的GAG,含量明显高于单纯Col支架材料,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Col-HA-CS复合支架材料可为软骨细胞生长分化及组织形成提供一个良好的环境,在软骨组织工程的支架材料领域有较广泛的应用前景.     

动态监测组织工程软骨的体外构建及三维静态培养

目的采用荧光蛋白标记技术,对组织工程软骨的体外构建及三维静态培养进行连续观测,从而确定适宜的体外培养时间。方法将人间充质干细胞进行荧光蛋白标记,以2×107个/ml的细胞密度与可吸收性软骨支架材料在体外构建细胞材料复合体,再进行三维静态培养,通过倒置荧光显微镜对于接种后4d、1、2、3和4周的培养物,分别进行荧光强度观察和细胞数量分析。结果逆转录病毒载体pLEGFPN1成功标记种子细胞;采用沉淀法构建细胞材料复合体时,容易出现细胞在材料内分布不均匀的缺陷;连续培养复合体时其整体荧光强度会逐渐降低,单个复合体内的细胞数量在4d时为(1.90±0.12)×106,到第4周时降至(0.70±0.06)×106,差异有统计学意义(P<0.01)。结论体外静态培养组织工程软骨在4～7d时其中的细胞数量最高,适时翻转培养物有助于稳定细胞数量。     

自体软骨组织工程的实验研究

OBJECTIVE: To engineer diversified shapes of neocartilage from auto-cartilage and provide a new method to reconstruct cartilage. METHODS: Cartilage obtained from the ear of 5-week-old New Zealand rabbits was cut into pieces of 0.5 mm x 0.5 mm, which were seeded onto the three-dimensional polylactic acid foams. The cartilage-polymer construct was implanted into a subcutaneous pocket of the donor rabbit. Animals were sacrificed at 3rd, 6th month after implantation. The retrieved implants in each animal were used for gross measurement and histological analysis. RESULTS: Gross examinations of the specimens at 6 months after implantation revealed that there was neocartilage formation; the maxim size was 8 mm x 8 mm. The cartilage showed no signs of resorption. Histological evaluation confirmed the generation of cartilage. The polymer substrate support cell proliferation. The extracellular matrix stained strongly positive for S-GAGs with Alcian blue staining. CONCLUSION: Neocartilage can be created using free auto-cartilage transplantation on appropriate polymer templates.     

胶原在软骨组织工程中的应用

软骨组织工程的出现,为解决软骨修复这个临床难题提供了新的方法.然而寻找一种合适的生物载体材料是目前软骨组织工程的热点.胶原是一种天然支架材料,具有良好的生物相容性、可降解性和生物活性,可作为细胞三维生长支架,并且有维持种子细胞增殖、黏附和分化的能力.本文就胶原及其复合材料在软骨组织工程方面的应用状况与前景作一综述.     

应用可注射性生物材料再生自体组织工程化软骨组织的实验研究

目的探讨自体组织工程化软骨在动物自体内形成的最佳细胞浓度,为临床应用提供理论依据.方法取贵州香猪部分耳廓软骨组织,于体外消化分离软骨细胞,与可注射性生物材料PluronicF127混合形成复合物,浓度为10,20,30,40,50,60和70×106/ml,并将其接种于猪自体腹外侧壁皮下,于第6周取材,分别进行大体、组织学、氨基糖氨多糖(GAG)和Ⅱ型胶原含量检测,对再生软骨组织进行评价.结果细胞浓度为50×106/ml时,再生的软骨组织,软骨细胞均匀分布,包埋在软骨陷窝内,与正常软骨组织有相似的组织学特征.而细胞浓度为10×106/ml、30×106/ml则形成软骨组织不完全,软骨细胞散在分布,并被未降解的生物材料分隔.对所有样本称重,在30～110mg之间,各样本GAG含量在5.8%～9.2%之间,正常耳软骨含量为9.2%.WesternBlot证实所有样本都有Ⅱ型胶原.结论利用组织工程技术可在具有免疫功能的自体动物内形成软骨组织,并确定了软骨组织形成的最佳细胞接种浓度为50×106/ml.     

脂肪来源细胞体外构建组织工程软骨的初步探索

目的 探讨脂肪来源细胞(adipose-derived cells,ADCs)在体外构建特定形态软骨的可行性.方法 脂肪组织由整形外科吸脂术获得.酶消化法分离抽吸物中细胞,体外扩增.以第3代细胞接种PLGA生物支架,在成软骨培养基中体外诱导4周,大体观察、组织学检测构建组织的成软骨能力.结果 大体观察见诱导组能维持圆柱形态.非诱导组失去原有形态,单纯支架组完全塌陷.组织学上诱导组局部检测到软骨陷窝包埋于嗜碱性基质中,Massens's染色和Safranin'O染色示胶原、蛋白多糖呈阳性,免疫组织化学染色示Ⅱ型胶原轻度阳性;非诱导组呈典型的疏松结缔组织结构,组织学特殊染色均呈阴性.结论 脂肪来源细胞虽为多种细胞混合群体,但作为构建特定形态软骨的种子细胞,具有可行性.     

体内外环境对组织工程软骨组织结构与力学性能的影响

目的 探讨体外构建组织工程化软骨在体、内外环境中力学性能及组织结构的变化,以及微环境对组织形成的影响,为工程化软骨构建提供适当参数。方法 体外培养扩增人胎儿关节软骨细胞,取第2代细胞以6×107个细胞/ml密度接种到聚羟基乙酸/聚乳酸(Polyglycolic acid/Polylactic acid,PGA/PLA)材料制成的圆柱形三维支架上,常规体外培养4周后,分为体内组(C、D组)和体外组（A、B组）,C、D组植于裸鼠皮下,A、B组继续常规培养液培养,于6、12周后取材,以正常软骨作为对照,行大体观察,以及组织学、组织化学、生物力学、超微结构等检测。结果 A、B、C、D4组均形成大体形态良好的透明软骨样组织。C、D组软骨呈乳白色,表面光滑,超微结构上胶原纤维排列致密而有规则,可形成有横纹的粗大胶原纤维,类似正常成人软骨;A、B组颜色偏黄,表面略粗糙,外观及超微结构近似半透明的胎儿关节软骨。工程化软骨植入体内12周后压缩弹性模量及胶原直径分别为（38.28±3.95）MPa和（41.58 ±2.78）nm,明显优于体外同时期组的(4.12±0.63) MPa和（15.83±1.70）nm(P ＜0.01)。结论 组织工程软骨的结构和功能在体内环境逐步成熟,体内组软骨超微结构上能形成粗大胶原纤维网络,胶原的交联增强可能是其力学性能较体外组明显提高的重要原因。     

Tissue-engineered cartilage using fibrin/hyaluronan composite gel and its in vivo implantation

The importance of scaffold biomaterials has been emphasized for in vitro culture of tissue-engineered cartilage in a three-dimensional (3D) environment. In this study, we examined the feasibility of fibrin glue, mixed with hyaluronic acid (HA) as a composite scaffold. Fibrin glue has been a useful cell delivery matrix for cartilage tissue engineering and HA is a key component of normal articular cartilage. Our hypothesis is that compared to fibrin itself, a fibrin/HA composite can have significantly enhanced properties, due mainly to the added benefits of HA in the matrix. Pieces of cartilage were isolated from rabbit knees and the chondrocytes were harvested through enzymatic digestion. Both fibrin and fibrin/HA composite were prepared and subsequently implanted in nude mice (n = 9, each group) for 1, 2, and 4 weeks, respectively. The retrieved specimens were then analyzed and the results were compared. Cartilage-like tissue formation was detected earlier with fibrin/HA specimens. They produced significantly higher amounts of the extracellular matrix (ECM) molecules, GAG, and collagen at each time point than those in fibrin. Interestingly, the fibrin/HA composite was also competent in maintaining its initial size. Histology--Safranin O/fast green and Alcian blue--of the retrieved specimens found more intense, uniform staining in the fibrin/HA composites. Analysis of the gene expression of the ECM molecules also confirmed the benefits of the composite with added HA in the maintenance of phenotypic stability. The present study suggests that fibrin/HA composite may serve as a dependable cell delivery vehicle as well as a structural basis for tissue-engineered cartilage.     

永生化软骨细胞为基础的工程化软骨修复软骨缺损的实验研究

目的探讨用永生化软骨细胞作为种子细胞修复羊关节软骨缺损的可行性.方法把人端粒酶催化亚基(hTERT)转染羊关节软骨细胞,筛选阳性克隆并通过旋转生物反应器-微载体技术进行大量扩增;将扩增的永生化软骨细胞与β-磷酸三钙复合并在体外培育后,植入羊前肢肱骨头关节面软骨缺损处;3和6个月取材,进行形态学和免疫组织化学评价.结果实验组,术后6个月,缺损区被新生的软骨组织所充填,Ⅱ型胶原染色呈强阳性,与对照组差别有显著性差异(P＜0.01).在材料组,缺损区边缘可见部分新生软骨组织;空白对照组,缺损区新生软骨组织形成.结论永生化软骨细胞在软骨组织工程中具有潜在的应用前景.     

利用脂肪干细胞构建软骨修复兔膝关节软骨缺损的初步研究

目的 利用兔同种异体软骨脱细胞基质支架和脂肪干细胞体外构建组织工程软骨,探讨其修复关节软骨损伤的可行性.方法 将新西兰大白兔的脂肪干细胞与软骨脱细胞基质支架复合,于软骨细胞方向诱导培养基中培养两周,构建组织工程软骨.兔24只随机分为A、B、C 3组, A组关节软骨缺损处置入经诱导的脂肪源干细胞复合软骨基质支架, B组缺损处只置入软骨基质支架, C组软骨缺损处不做任何处理.分别于术后第12周处死动物,修复处行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组化染色和透射电镜检测.结果 A组软骨缺损处被类软骨组织填充,修复区表面光滑;Ⅱ型胶原免疫组化染色和甲苯胺蓝染色阳性;电镜下可见软骨陷窝内有细胞结构存在,且有大量均匀颗粒状细胞分泌基质成分存在,细胞周围大量胶原纤维.B组软骨缺损处为纤维组织状物填充,C组软骨缺损处无修复组织填充.结论 脂肪干细胞与软骨脱细胞基质复合并向软骨诱导后可良好地修复关节软骨缺损,具有替代正常软骨的潜力.     

同种异体组织工程化软骨组织形成的初步研究

目的 探讨同种异体组织工程化软骨在动物体内形成。方法 取怀孕１００ｄ胚胎羊的关节软骨经体外消化分离软骨细胞,与可吸收生物材料Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７混合形成细胞－生物材料复合物,将细胞－生物材料复合物注射到异体羊腹壁皮下,每隔２周取材,连续半年对所取标本进行大体观察、称重,并作ＨＥ、Ｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色,对再生的软骨组织进行评价。结果 在同种异体动物体内     

应用比较蛋白质组学技术筛查组织工程化软骨力学性能相关蛋白

目的 应用比较蛋白质组学分析方法筛选组织工程化软骨成熟过程中变化显著的细胞外基质蛋白,通过线性相关分析,研究与软骨力学性能相关的蛋白.方法 分离人胎儿软骨细胞培养并扩增,接种到聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架材料,体外培养4周后随机分为3组,每组6例,A组继续体外培养6周、B组回植裸鼠体内培养6周、C组回植裸鼠体内培养12周.取材后进行大体观察、湿重及体积测定、组织学及生物力学等相关检测,比较体内外构建软骨与天然软骨形成质量上的差异.同时进行蛋白质组学分析,选择细胞外基质中比值大于2倍的蛋白与相应各组杨氏模量做相关性分析,根据相关系数筛选与软骨力学性能最相关的蛋白.结果 3组均能在体内外形成透明软骨样组织,C组和B组软骨外观近似天然成人软骨,组织学显示大量成熟软骨陷窝,而A组形成的软骨组织结构较松散,组织学可见不规则肥大软骨陷窝.C组湿重和生物力学检测分别为(372.5±35.4) mg和(8.68±2.65) MPa,明显高于B组的(346±34.5) mg和(3.25±1.24)MPa (P＜0.01),而A组为(184.4±12.28) mg和(0.7±0.23) MPa.应用蛋白质组学技术检测到细胞外基质中共44个差异蛋白,选择胞外基质中C组和A组之间差异最大的6个蛋白,与相应各组杨氏模量进行线性相关分析,发现核心蛋白聚糖(Decorin)、软骨粘附素(Chondroadherin)和纤调蛋白(Fibromodulin)与软骨力学性能变化显著相关(P＜0.05).结论 蛋白质组学技术能够提供大量的蛋白质信息,组织构建与比较蛋白质组学技术相结合,有利于进一步分析组织工程化软骨胞外基质蛋白与力学性能的关系.     

采用自体成熟关节软骨细胞的软骨组织工程修复

目的探讨使成熟软骨细胞转化成代谢活跃、增殖迅速的再生软骨祖细胞，而后利用这种细胞构建自体源性工程组织，修复成熟关节软骨的缺损。方法成熟兔关节软骨细胞进行普通单层培养和转化生长因子(TGF)-β1、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合诱导培养。培养细胞进行细胞计数、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测。将诱导培养的再生软骨祖细胞与聚乳酸载体(PDLLA)一道构建自体源性工程软骨，修复成熟关节软骨缺损。修复组织进行组织形态学和免疫组织化学研究。结果研究发现成熟关节软骨细胞在体外单层培养中增殖缓慢。而联合TGF-β1、bFGF诱导培养可促进成熟软骨细胞的增殖，10d内细胞增殖189倍。标准单层培养4～5代细胞经密集培养不表达Ⅱ型胶原。而联合细胞因子诱导培养6代的细胞在体外密集培养下，可很快恢复Ⅱ型胶原的表达。利用再生软骨祖细胞构建的自体源性工程软骨可修复软骨缺损。修复组织表达Ⅱ型胶原。结论成熟关节软骨细胞经TGF-β和bFGF联合诱导培养可形成再生软骨祖细胞，此细胞可用于构建自体源性工程组织，修复成熟关节软骨的缺损。