栝楼根提取物诱导 Hela 细胞凋亡的机制研究

目的：探讨栝楼根提取物（ EOT）诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的发生机制。方法采用流式细胞仪定量检测EOT诱导Hela细胞凋亡的发生率;应用Western blot 法和RT-PCR法观察Hela细胞Caspase-3酶原和mRNA表达的变化;用Caspase活性检测试剂盒检测Caspase-3,8,9的活性。结果同一浓度EOT分别作用Hela细胞12、24、36、48和60 h后,细胞凋亡率随着时间的延长而逐渐升高,但长时间（60 h）作用主要导致细胞坏死;在EOT诱导Hela细胞凋亡的过程中,Caspase-3酶原的蛋白表达随着作用时间的延长而逐渐降低;在EOT作用Hela细胞的过程中,Caspase-3 mRNA的表达水平随作用时间的延长而增高;Caspase-3,8,9活性均有时间依赖性增高的趋势,并且Caspase-8和9早于Caspase-3被激活。结论 EOT诱导Hela细胞的凋亡是通过Caspase-3的活化来实现的,且活化的Caspase-8和9共同参与了Caspase-3的激活。     

BAPTA-AM对MDCK细胞的保护作用及其机制

目的观察BAPTA-AM抗D-氨基半乳糖(D-GalN)诱导MDCK细胞损伤作用,探讨其作用机制。方法采用MTT法,Annexin V-EGFP/PI与Hoechst33342/PI荧光染色,罗丹明123(Rhodamine 123)荧光染色,Caspase-8、Caspase-9活性测定及钙离子载体A23187诱导细胞内高钙等方法,分别测定D-GalN攻击下MDCK细胞活性,细胞凋亡状况,线粒体膜电位(△Ψm)、Caspase-8、Caspase-9活性和细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)变化等。结果 BAPTA-AM能明显抑制D-GalN所致的细胞活力下降、减少细胞凋亡、维持△Ψm,抑制Caspase-8、Caspase-9的激活,减轻A23187所致细胞损伤,降低[Ca2+]i。结论 BAPTA-AM通过减轻钙超载,保护线粒体、抑制外源及内源性凋亡通路的激活,发挥抗肾细胞凋亡作用。     

线粒体通路和死亡受体通路在中华眼镜蛇毒组分诱导KG1a细胞凋亡中的作用

目的研究线粒体通路和死亡受体通路在中华眼镜蛇毒组分(naja naja actra venom component,NNAVC)诱导KG1a细胞凋亡过程中的作用。方法以人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞为研究对象,采用Annexin V-FITC/PI荧光染色法进行凋亡细胞的形态学观察,流式细胞仪检测细胞凋亡率,分光光度法检测Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3的活性,ELISA法检测胞质内细胞色素C的表达水平,流式细胞仪分析TRAIL死亡受体(DR4、DR5)和诱骗受体(DcR1、DcR2)的改变。结果 NNAVC作用后,荧光显微镜下可见明显的凋亡细胞,细胞凋亡率随药物作用浓度的增加而升高;Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3蛋白被激活,胞质内细胞色素C的表达明显增加;流式细胞仪检测结果显示,NNAVC具有降低死亡受体DR4和诱骗受体DcR1的表达率,而提高DR5和DcR2的表达水平的作用。结论线粒体凋亡通路和死亡受体通路均参与NNAVC诱导KG1a细胞凋亡的过程,这可能是NNAVC发挥抗白血病作用的机制之一。     

DuP-697对K562白血病细胞凋亡诱导作用观察及机制研究

目的：观察选择性COX-2抑制剂DuP697对慢粒白血病K562细胞的凋亡诱导效应,并探讨其作用机制。方法：细胞培养加入DuP-697作用后,透射电镜观察细胞凋亡的形态,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率,Western印迹检测K562细胞Caspase-8蛋白表达;用Z—IETD—FMK阻断Caspase8活性,以证实Caspase-8蛋白表达和细胞凋亡的关系。结果：DuP-697能诱导K562细胞凋亡,其作用呈浓度依赖性,这-效应与Caspase-8蛋白表达上调和裂解激活有关;用Z-IETD—FMK阻断Caspase-8的活性,细胞凋亡明显受抑。结论：DuP-697能诱导K562细胞凋亡,其机制涉及Caspase-8活化的信号转导途径。     

3''取代吲哚类衍生物诱导HL-60细胞凋亡的实验研究

目的：研究3-吲哚乙基(3’-甲基-2’-酮)戊酰胺诱导HL-60细胞凋亡的作用机制。方法：用DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪分析3-吲哚乙基(3’-甲基-2’-酮)戊酰胺对HL-60细胞的凋亡诱导作用,检测天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-8和Caspase-3活性来研究其对HL-60细胞的凋亡诱导途径,并通过间接免疫荧光技术检测其对Bcl-2表达的影响。结果：1．8％DNA琼脂糖凝胶电泳可观察到清晰的“DNA ladder”,流式细胞仪检测3-吲哚乙基(3’-甲基-2’-酮)戊酰胺对HL-60细胞具有明显的凋亡诱导作用。Caspase活性检测表明,Csapase-3活性明显升高而Caspase-8活性无明显变化。流式细胞仪分析表明Bcl-2的表达随着受试物浓度的升高而下降。结论：3-吲哚乙基(3’-甲基-2’-酮)戊酰胺可诱导HL-60细胞凋亡,其诱导凋亡与Bcl-2表达及Caspase-3活性有关。     

雷公藤甲素诱导人肝细胞凋亡的机制

目的 探讨雷公藤甲素诱导人肝细胞L-02凋亡的机制.方法 将L-02细胞分为对照组和雷公藤甲素50 nM实验组,处理48 h后,采用MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率、活性氧(ROS)的荧光强度,试剂盒检测细胞色素C的浓度以及半胱天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)和Caspase-3的活性,Western blot检测细胞中B细胞淋巴瘤-白血病2(Bcl-2)和Bcl相关X蛋白(Bax)的表达.结果 与对照组相比,实验组细胞存活率下降,细胞凋亡率上升,Bcl-2表达下调,Bax表达、细胞色素C浓度、ROS荧光强度、Caspase-9和Caspase-3活性均明显上调(P＜0.05或P＜0.01).结论 雷公藤甲素可以抑制L-02细胞的存活,通过激活线粒体凋亡途径促进L-02细胞凋亡,下调Bcl-2与Bax比率,促进细胞色素C释放,诱导ROS生成,进一步破坏线粒体膜,增加细胞色素C的释放,激活Caspase-9和Caspase-3介导的细胞凋亡通路,最终诱导细胞凋亡.     

维康醇诱导小鼠B16F0细胞凋亡的研究

目的本研究探讨维康醇诱导小鼠黑色素瘤B16F0细胞凋亡的机制。方法噻唑蓝(MTT)法检测维康醇对小鼠B16F0细胞增殖的影响;台盼蓝拒染法检测细胞致死率;吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)荧光染色法观察细胞凋亡形态;Hoechst 33258染色观察药物处理后细胞形态的变化;流式细胞仪Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡率;Caspase-9/3试剂盒检测半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)和半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的活性;实时荧光定量(Real-Time PCR)法检测Bax、Bcl-2基因表达水平。结果维康醇能抑制B16F0细胞的恶性增殖,并呈剂量依赖性(P<0.05或P<0.01);细胞致死率也不断上升(P<0.05或P<0.01);在荧光显微镜下发现维康醇作用于B16F0细胞后出现明显的凋亡形态;随着维康醇浓度的增加,细胞凋亡率呈剂量依赖性增长(P<0.05或P<0.01);Caspase-3、Caspase-9活性逐渐升高(P<0.05或P<0.01);Bax/Bcl-2表达的比率上调(P<0.01)。结论维康醇能够通过抑制B16F0细胞的恶性增殖,最终诱导细胞的凋亡。其机制是通过上调Bax/Bcl-2表达的比率,活化Caspase-9并进一步激活Caspase-3诱导B16F0细胞凋亡。推测维康醇诱导B16F0细胞凋亡是通过线粒体调控的内源通路介导的。     

原花青素对人冠状动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究原花青素对人冠状动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。方法采用MTT实验检测原花青素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞增殖的影响,运用流式细胞术、基因组DNA电泳观察凋亡特征性＂梯状＂条带检测细胞凋亡,采用Caspase活性定量检测试剂盒分析Caspase-9、Caspase-3的活性。结果原花青素对人冠状动脉平滑肌细胞具有明显的抑制作用,且其作用有剂量依赖性。流式细胞仪检测显示原花青素可以显著诱导人冠状动脉平滑肌细胞凋亡,DNA电泳显示原花青素作用于人冠状动脉平滑肌细胞后出现凋亡细胞特有的DNA阶梯状条带。原花青素作用后人冠状动脉平滑肌细胞Caspase-9、Caspase-3活性明显升高。结论原花青素可能通过线粒体信号通路抑制人冠状动脉平滑肌细胞的生长并诱导其凋亡。     

扁柏双黄酮对肝细胞癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的研究扁柏双黄酮(HF)对肝细胞癌HepG2细胞增殖、凋亡及其作用机制的影响。方法CCK8法检测0、10、20、40、60、80、100、120μmol·L~(-1)浓度梯度的HF对肝细胞癌HepG2细胞活性的影响;平板克隆检测HF对肝细胞癌HepG2细胞增殖的影响;用DAPI染色和Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测HF对肝细胞癌HepG2细胞凋亡的影响;荧光探针DCFH-DA流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平;蛋白质印迹检测凋亡相关的蛋白表达水平。结果不同浓度的HF作用于HepG2细胞后,细胞活性随着HF浓度的增加显著降低(P <0.01),并且24 h和48 h的半数抑制浓度(IC50)值分别是(59.77±2.57)μmol·L~(-1)、(48.96±4.187)μmol·L~(-1);DAPI染色显示HF可导致HepG2细胞收缩,核碎裂和染色质凝聚,出现凋亡小体;流式细胞术检测结果显示HepG2细胞早期和晚期凋亡率均随HF浓度的升高而依次升高(P <0.05);进一步的研究表明,HF处理HepG2后,显著增加细胞内ROS水平(P<0.01),并且细胞凋亡通路相关蛋白cleaved-PARP、cleaved-Caspase 3的表达也明显增加(P <0.001)。结论 HF可通过ROS/Caspase信号通路抑制HepG2细胞增殖,促进其凋亡。     

RNAi沉默XIAP基因抑制MG-63细胞增殖及其分子机制

目的 探讨RNA干扰(RNAi)抑制NC-63骨肉瘤细胞X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)基因的表达及其抗肿瘤的机制.方法 构建XIAP基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体.将NC-63细胞分为空白组(A组),用空白质粒psiRNA-Con转染(B组),用psiRNA-XIAP转染(C gt).Westernblot检测XIAP蛋白的表达;MTT检测细胞的增殖;流式细胞术检测细胞周期、凋亡及半胱天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)的表达;ELISA法检测细胞内血管内皮生长因子(VEGF)含量.结果 与A、B组比较,C组细胞XIAP蛋白水平、MTT值及VEGF含量均显著降低,细胞凋亡率、Caspase-9蛋白表达及G2/M期细胞所占比例增高(P＜0.05).结论 RNAi能有效抑制XIAP基因表达,抑制骨肉瘤细胞增殖活性,诱导其凋亡.其机制可能涉及Caspase家族凋亡信号转导通路的活化、DNA合成及肿瘤血管生成的抑制.     

丙戊酸钠诱导K562细胞凋亡的机制探讨

目的 探讨丙戊酸钠(VPA)诱导K562细胞凋亡的可能机制.方法 将K562细胞分为经VPA 2.0mmol/L处理的实验组(A组)和正常对照组(B组),分别培养24、48、72 h.流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位改变,分光光度法检测半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶(Caspase)8、Caspase-9蛋白活性.结果 A组细胞凋亡率、细胞线粒体跨膜电位破坏率呈时问依赖性地增加,且明显高于B组(P<0.05);与B组相比,A组不同时间的Caspase-8、Caspase-9活性均上调(P<0.05).结论 VPA诱导K562细胞凋亡的机制可能与线粒体跨膜电位崩溃或死亡途径有关.     

姜黄素诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的 探讨姜黄素诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用.方法 采用噻唑蓝(MTT)比色法检测人胃癌SGC-7901细胞生长活力;Hoechst 33258核染色观察细胞形态学变化;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡率;比色法检测Caspase-3、8、9活性.结果 姜黄素(5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L)明显抑制SGC-7901细胞牛长并呈剂量依赖关系,48 h的IC50值为(23.65±3.15)μmol/L,细胞核经Hoechst 33258染色出现浓染致密的固缩形态和颗粒状荧光.与对照组相比,姜黄素处理后凋亡细胞比例增加;姜黄素处理SGC-7901细胞48 h后Caspase-3、8、9的活性明显增强.结论 姜黄素可通过激活Caspase级联活化而抑制人胃癌SGC-7901细胞生长并诱导其凋亡.     

灵芝多糖诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的研究

目的：研究灵芝多糖（GLPS）与化疗药氟尿嘧啶联合使用诱导人肝癌细胞HepG2凋亡作用。方法：MTT法测定细胞毒作用,流式细胞术检测细胞凋亡率,比色法测定Caspase-3、Caspase-8酶活性,Western—Blotting法检测细胞色素C、Caspase-3、Caspase-8蛋白表达情况。结果：灵芝多糖与氟尿嘧啶联合使用具有显著的细胞毒作用;流式细胞术检测,随着GLPS浓度增加,细胞凋亡率升高,Caspase-3、Caspase-8酶活性亦增强;Western-Blotting检测发现GLPS作用后细胞色素C、Caspase-3、Caspase-8蛋白表达不同程度增加。结论：灵芝多糖与氟尿嘧啶联合使用可通过引起细胞色素C的释放,活化Caspase诱导肝癌细胞凋亡。     

大黄酸对H_2O_2诱导HK-2细胞凋亡的保护作用及其机制研究

目的观察大黄酸对H2O2诱导HK-2细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法 H2O2处理HK-2细胞建立氧化应激模型,实验过程中采用大黄酸进行预处理,MTT法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡,利用DHE荧光探针对细胞内ROS水平进行荧光染色强度的检测,通过Western blotting检测MAPK的磷酸化水平。结果 H2O2作用于HK-2细胞后,能够显著降低细胞活力,诱导HK-2细胞发生凋亡,增强HK-2细胞内ROS荧光强度,同时激活MAPK信号通路,增加p38和JNK的磷酸化。而加入大黄酸预处理后,可明显抑制H2O2对细胞活力及凋亡的影响,减少HK-2细胞内ROS的含量,抑制p38和JNK的磷酸化。结论大黄酸抑制H2O2诱导的HK-2细胞凋亡部分通过抑制JNK和p38 MAPK的磷酸化而发挥作用。     

利用FRET技术实时检测Bid蛋白在TNF-α诱导PC12细胞凋亡过程中的作用

目的 在活细胞中实时检测TNF-α诱导PC12细胞凋亡过程中Bid蛋白的作用并探讨PC12细胞凋亡的信号通路.方法 利用基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理设计的荧光探针pFRET-Bid( YFP-Bid-CFP)转染PC12细胞后,在激光共聚焦显微镜下实时检测Bid蛋白的切割情况,并采用专用软件进行数据分析.结果 TNF-α诱导细胞凋亡的过程中,在短时间内(3 h)就凋亡的细胞中观测不到bid的切割,而在8h后凋亡的细胞中却观测到了hid的切割.结论 通过分析实验结果推测不同时间凋亡的细胞经过的信号通路是不同的,一个是不通过线粒体的较快途径,一个是需要通过线粒体的较慢途径.     

槲皮素对人肺腺癌NCI-H1395细胞凋亡的影响

目的:研究槲皮素对人肺腺癌NCI-H1395细胞凋亡的影响。方法:采用CCK-8法检测0~200μmol/L槲皮素作用12、24、48 h对NCI-H1395细胞增殖的影响;应用Hochest33258染色法和流式细胞仪检测0、20、50、100μmol/L槲皮素作用24 h对NCI-H1395细胞凋亡的影响;检测100μmol/L槲皮素对经半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(Caspase-8)、Caspase-9、Caspase-3抑制剂处理后NCI-H1395细胞凋亡的影响。结果:槲皮素可抑制NCI-H1395细胞的增殖,且与浓度和时间呈正相关。20、50、100μmol/L槲皮素可诱导NCI-H1395细胞凋亡,凋亡率分别为(18.6±4.1)%、(39.1±4.5)%、(58.2±3.5)%。抑制Caspase-8、Caspase-3激活可明显降低槲皮素对细胞的抑制作用(P<0.05)。结论:槲皮素可抑制NCI-H1395细胞增殖,诱导其凋亡,其作用可能与凋亡外源通路Caspase-8和Caspase-3的激活有关。     

白花蛇舌草的有效成分2-羟基-3-甲基蒽醌通过Fas/FasL信号通路诱导卵巢癌细胞凋亡

目的研究中药白花蛇舌草的有效成分2-羟基-3-甲基蒽醌对人卵巢癌细胞HO-8910生长的抑制作用和凋亡的影响。方法不同浓度的2-羟基-3-甲基蒽醌与人卵巢癌细胞HO-8910分别培养0、24、48、72 h,用台盼蓝染色法测定HO-8910细胞存活率;以Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测HO-8910细胞的凋亡率;Western blot法检测Fas和Fas L蛋白的表达;采用荧光比色法测定Caspase-3和Caspase-8蛋白酶的活性。结果随着2-羟基-3-甲基蒽醌浓度的增加及作用时间的延长,药物对HO-8910细胞的生长有明显的抑制作用;HO-8910细胞的凋亡率亦随之增高,且呈药物浓度及时间依赖关系;2-羟基-3-甲基蒽醌作用HO-8910细胞后Fas和Fas L的蛋白表达水平逐渐上升;Caspase-3和Caspase-8蛋白酶的表达亦逐渐增强;Caspase-3和Caspase-8抑制剂能够抑制2-羟基-3-甲基蒽醌诱导的HO-8910细胞凋亡。结论 2-羟基-3-甲基蒽醌可以诱导HO-8910细胞凋亡,Fas/Fas L通路在2-羟基-3-甲基蒽醌诱导的HO-8910细胞凋亡过程中起重要作用。     

苞叶香茶菜庚素诱导人白血病细胞系HL-60凋亡的分子机制研究

目的：观察苞叶香茶菜庚素（melissoidesin G,MOG）对多种肿瘤细胞系的细胞毒活性,并研究MOG诱导白血病细胞系HL．60凋亡的相关分子机制。方法：用MTT法评价化合物对多种肿瘤细胞的增殖抑制活性;通过流式细胞术PI单染法观察化合物对肿瘤细胞内DNA含量的影响,以分析周期变化;Annexin V染色法分析凋亡;荧光底物发光法检测caspase活性;膜电位依赖性结合的荧光探针JC-1标记法检测线粒体膜电位（△ⅢIn）;Western blotting检测蛋白表达。结果：（1）MOG对多种肿瘤细胞系均有一定的增殖抑制作用;（2）MOG诱导HL-60细胞发生剂量依赖性凋亡;（3）在MOG作用下,HL-60细胞出现时间依赖性的△ψm降低;（4）HL-60细胞在MOG作用6～12h后caspase-3和caspase-7均被明显激活,且在抑制剂Z-VAD-FMK的作用下,MOG诱导的caspase激活和细胞凋亡被完全抑制;（5）抗氧化剂NAC可以抑制MOG诱导的△ψm降低、细胞凋亡及caspase-3激活。结论：MOG能够明显抑制肿瘤细胞增殖,并通过诱导细胞凋亡发挥其抗肿瘤作用。推测MOG可能通过引起细胞内氧化还原状态失平衡,进一步破坏线粒体功能,并激活caspase通路引起肿瘤细胞凋亡。     

灯盏花素增强马利兰抑制HL-60细胞作用的实验研究

目的:研究灯盏花素增强马利兰抑制HL-60细胞的作用。方法:MTT法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blotting法检测肿瘤抑制基因(p53)/B细胞淋巴瘤-白血病-2(Bcl-2)的表达,ELISA、比色法和分光光度法分别检测细胞色素C、Caspase-3、Caspase-8和谷胱甘肽(GSH)的含量。结果:灯盏花素能增强马利兰抑制HL-60细胞生长的作用,促进小鼠淋巴细胞对马利兰的抵抗,上调p53/Bcl-2表达比率,激活Caspase-3和Caspase-8,升高细胞色素C,降低GSH。结论:灯盏花素对马利兰抗肿瘤具有增效减毒作用,其机制可能与激活肿瘤耐药细胞凋亡通路有关。