1型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染人脐静脉内皮细胞的体外研究

目的 评价1型重组腺相关病毒(rAAV1)作为新生血管性角膜病变基因治疗载体的可行性.方法 rAAV1-EGFP按转染倍数(MOI)5×103,5×104,5×105转染ECV304细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察ECV304细胞中GFP阳性表达情况和细胞生长形态特点等,流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对EVE304细胞的转染效率.MTT法检测rAAV1-EGFP对EVC304细胞增殖的影响.结果 转染后2 d,MOI=5×105组细胞中的GFP开始表达;表达强度随MOI值的增高而增强,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强,转染后第7天达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对ECV304细胞的转染率分别为45.90％(MOI=5×103),58.56％(MOI=5×104),68.31％(MOI=5×105).AAV1-EGFP转染ECV304细胞后.细胞生长及形态正常.MTT法显示转染后72、96 h各转染组与未转染组之间A值无显著性差异.结论 rAAV1-EGFP对ECV304细胞转染稳定、有效,重组腺相关病毒对细胞增殖无明显抑制,重组腺相关病毒可作为基因治疗角膜新生血管性病变的载体.     

腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因体外转染兔结膜上皮细胞

目的:研究2型重组腺相关病毒( recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP) 对体外培养兔结膜上皮细胞的转染和表达情况,为后续研究提供依据。方法:体外培养兔结膜上皮细胞,rAAV2-EGFP 按感染复数(multiplicity of infection ,MOI)为104、105、106 转染第2代兔结膜上皮细胞,转染后第1 、3 、5 、7日倒置荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况,计算转染率。MTT方法检测rAAV2-EGFP转染对细胞增殖的影响。结果:随着MOI值增大及转染时间延长,EGFP 表达效率逐渐增高,转染后第7～8日达到高峰并维持。MTT检测各MOI组与对照组差别无统计学意义。结论:rAAV2载体可以介导EGFP 基因高效稳定转染兔结膜上皮细胞,并且对细胞增殖无影响。     

两种重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白转染大鼠成骨细胞效率的体外研究

目的 比较2种不同重组腺相关病毒(rAAV)介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对大鼠成骨细胞的转染效率,评价其作为成骨细胞病变基因治疗载体的可行性.方法 采用Ⅰ型胶原酶阶段消化法分离培养大鼠成骨细胞并鉴定,rAAV-EGFP按转染复数(MOI) 1×10~3、1×10~4、1×10~5、5×10~5分为只加rAAV和rAAV与腺病毒(ADV)共同转染组转染成骨细胞,倒置荧光显微镜观察转染后荧光强度随转染时间的变化,流式细胞仪检测rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP对成骨细胞的转染效率及荧光强度,确定转染的较佳MOI值,以此值用MTT法描绘细胞生长曲线,观察rAAV对细胞的毒性.结果 分离培养的细胞具有体内成骨细胞的生物学行为,rAAV对成骨细胞的转染效率随MOI值的增加而提高,ADV(-)组荧光强度在第5 d达到高峰,当MOI为1×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率分别为90.2%、66.1%,MOI值增到5×10~5时转染效率无显著提高;ADV(+)组荧光强度在第3 d即达高峰,MOI值为5×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率为47.6%、30.5%.细胞生长正常,rAAV对细胞活性影响小.结论 两种病毒载体对成骨细胞转染效率均较高,其中rAAV2/6高于rAAV2/9,是一种理想的基因治疗载体.     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34^＋细胞

目的研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34^ 细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞，免疫磁性分离仪纯化CD34^ 细胞，重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞，并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达，流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32．8％，CD34^ 细胞的基因转导效率最高为25％．在所观察的时间内，转染率呈先升高后降低趋势。结论重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34^ 细胞，绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因，为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

2种腺相关病毒介导的增强型绿色荧光蛋白对人成纤维细胞转染效率的研究

目的 比较2种不同腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)介导的增强型绿色荧光蛋白对人皮肤成纤维细胞(human fibroblast, HFB)的转染效率.方法 原代分离培养人皮肤成纤维细胞并鉴定,按照感染复数(multiple of infection,MOI)为104、105、106转染传2代的人成纤维细胞,流式细胞检测AAV2-EGFP和AAV2/1-EGFP对HFB的转染效率,倒置荧光显微镜观察转染后的荧光强度.MTT法检测AAV2-EGFP和AAV2/1-EGFP对HFB的毒性.结果 腺相关病毒AAV2-EGFP对HFB的转染效率随着MOI增加而增高, MOI为104时转染效率为(7.68±1.18)%,当MOI达到105后,转染效率稳定在(22.16±5.59)%,随着MOI增加,最高至MOI 106转染效率无显著提高.而病毒AAV2/1对于HFB的转染效率在MOI 为106转染效率仅为(3.47±0.93)%.2种病毒在转染过程中,细胞生长正常,MTT显示各转染组与未转染组的吸光度值无统计学差异.结论 AAV2载体对体外培养的HFB转染效率高于AAV2/1,但2种病毒载体对人皮肤成纤维细胞转染效率均不高,AAV2/1-EGFP对HFB几乎无感染能力.     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34+细胞

目的 研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34⁺细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法 用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞,免疫磁性分离仪纯化CD34⁺细胞,重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞,并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果 荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32.8%,CD34⁺细胞的基因转导效率最高为25%,在所观察的时间内,转染率呈先升高后降低趋势。结论 重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34⁺细胞,绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因,为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

腺相关病毒介导bFGF基因转染促进人骨髓基质细胞成骨实验研究

目的:观察腺相关病毒介导人碱性成纤维细胞因子(bFGF)基因转染对人骨髓基质细胞(hMSCs)成骨能力的影响。方法:从健康志愿者全骨髓中分离培养人骨髓基质细胞,体外扩增纯化后随机分为4组。①腺相关病毒介导人碱性成纤维细胞因子(AAV-bFGF)组:培养液中加入人碱性成纤维细胞因子基因重组腺相关病毒1×1010OPU/ml,孵育24h后换普通培养液继续培养;②β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒(AAV-LacZ)组:用半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒替换bFGF,其余处理与AAV-bFGF组相同;③阳性对照组:培养液中添加地塞米松(1nmol/L)、抗坏血酸(10mmol/L)和β-甘油磷酸钠(50mg/L);④空白对照组:不给予特殊处理。各组细胞处理后2wk,免疫组化观察bFGF表达,Von Kossa染色检测人骨髓基质细胞中骨胶原结节形成,全自动生化分析仪检测培养上清碱性磷酸酶(ALP)活性。结果:经多次换液传代,人骨髓基质细胞呈均一梭形形态。处理后AAV-bFGF组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平,突起减少。AAV-LacZ组和空白对照组形态无明显变化。免疫组化染色见bFGF主要在胞浆内表达,AAV-bFGF组bFGF表达明显强于其他3组。von Kossa染色AAV-bFGF组与阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成,显著多于AAV-LacZ组和空白对照组。培养上清液ALP活性检测AAV-bFGF组与阳性对照组显著高于AAV-LacZ组和空白对照组。结论:基因重组腺相关病毒人碱性成纤维细胞因子转染对人骨髓基质细胞成骨能力具有促进作用。     

慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白转导兔角膜上皮细胞的体外实验研究

目的 观察慢病毒载体(lentiviral vectors, LVs)用于兔角膜上皮细胞基因转染的有效性.方法 兔角膜上皮细胞的原代及传代培养并做细胞鉴定;慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白(lenti-EGFP)以不同的感染复数(multiplicity of infection, MOI=0、1、10、50、100、500)转染实验细胞,寻找最佳转染剂量;于转染后24、48、72、96 h运用倒置荧光显微镜观察不同MOI下增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)的表达并计算细胞转染率;RT-PCR 方法检测EGFP基因的表达情况.结果 EGFP于转染48 h即开始有表达,随着转染时间的延长其表达增强.MOI=1、10、50、100时,角膜上皮细胞转染率随着感染复数的增加而增加,分别为(4.5±0.6)%、(30.4±0.9)%、(51.9±1.4)%、(75.4±0.7)%,各组间差异显著(P<0.05);MOI在100与500时,转染率差异不显著(P>0.05),即最适感染复数为100.RT-PCR结果提示转染细胞组EGFP基因有表达.结论 慢病毒载体能够有效转染离体兔角膜上皮细胞.     

2型重组腺相关病毒转染新西兰兔关节软骨细胞的体外研究

目的为进一步研究腺相关病毒重组体在体内间接和直接基因治疗的效果提供依据。方法应用AAVMaxTM包装系统,复制和包装2型腺相关病毒重组体,进行纯化和滴度检测后,按照不同的转染指数(MOI)转染体外培养的新西兰兔关节软骨细胞,观察转染效果与及转染效果与时间的关系。倒置荧光显微镜观察证实表转染成功,流式细胞仪检测转染效果,包括表达绿色荧光信号细胞的百分比和平均荧光强度,将未转染的软骨细胞自发表达的绿色荧光信号百分比的最大值4·76%和荧光信号强度的最大值1·04设定为空白对照。结果当MOI值在1×105v·g·/cell以下时,MOI值(v·g·/cell)与转染率之间的剂量-反应曲线为正相关的线性关系,在MOI超过105v·g·/cell时,转染率不会再有显著的提高。在转染第7天,绿色荧光信号表达达到了峰值,随着转染时间的延长和传代次数的增加,表达绿色荧光信号的软骨细胞百分比和荧光强度均呈现降低趋势,但在转染后第56天仍可检测到绿色荧光蛋白的表达。结论2型腺相关病毒重组体在体外对新西兰兔关节软骨的转染效果良好;增强绿色荧光蛋白是观察2型腺相关病毒重组体转染关节软骨细胞效果一种良好的报告基因。     

增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞株的表达

目的:研究重组腺相关病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞的转染效率及其表达情况. 方法:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒转染永生化大鼠神经前体细胞,持续观察转基因神经前体细胞绿色荧光蛋白的表达情况,并计算转染效率. 应用巢蛋白抗体和抗猿肾病毒40大T抗原抗体进行细胞鉴定,50 mL/L胎牛血清诱导细胞分化后,应用神经元和星形胶质细胞特异性标志物抗体检测其分化能力. 结果:荧光显微镜观察显示转染后24 h神经前体细胞即有绿色荧光蛋白表达,转染后72 h,大部分细胞表达绿色荧光蛋白,转染效率可达90%. 经传代培养8 wk后,表达绿色荧光蛋白的阳性细胞仍可高达70%～75%. 免疫细胞化学结果显示转绿色荧光蛋白神经前体细胞巢蛋白和抗猿肾病毒40大T抗原抗体染色均为阳性,50 mL/L胎牛血清可诱导其分化为神经元和星形胶质细胞. 结论:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒可高效转染永生化大鼠神经前体细胞,并可在细胞中长期稳定地表达,绿色荧光蛋白作为良好的示踪剂可应用于神经前体细胞的体内移植.     

重组1和2型腺相关病毒转导增强绿色荧光蛋白在大鼠脑中的表达

目的　探讨重组1、2型腺相关病毒(rAAV1和rAAV2)载体经不同途径向大鼠脑转入增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的表达情况,选择更加适于中枢神经系统(CNS)转基因治疗的rAAV血清型和可行的基因转入途径。方法　将24只雄性健康成年SD大鼠随机分为4组:rAAV1海马注射组、rAAV1脑室注射组、rAAV2海马注射组和rAAV2脑室注射组,每组6只大鼠。对每组大鼠立体定向注射剂量和滴度相匹配的rAAV1 EGFP和rAAV2- EGFP载体,分别于注射后2周和4周处死大鼠取脑,行序列冰冻切片并以荧光显微镜观察EGFP在脑内的表达情况,计算EGFP在脑的表达体积。结果　2周时各组小鼠EGFP表达量少或无表达,差异无统计学意义; 4周时rAAV1海马注射组表达体积为(7 .00±0. 98)mm3,rAAV2海马注射表达体积为(0. 81±0 .28)mm3 (P<0 .01); 4周时AAV1脑室注射组表达体积为(12 .72±0 .28)mm3, AAV2脑室注射组表达体积为(0 .24±0. 13)mm3(P<0 .001)。结论　在CNS中rAAV1是一种比rAAV2更为优越的转基因载体,rAAV1可通过脑室内注射途径在CNS高表达,并可直接转导胶质细胞。     

腺病毒介导EGFP基因转染神经干细胞的实验研究

目的探讨腺病毒（adenovirus）介导的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因在神经干细胞（NSCS）的表达规律及转染对神经干细胞增殖、分化的影响。方法用不同感染复数的携带EGFP基因的腺病毒（Ad/EGFP）转染NSCS,在荧光倒置相差显微镜下观察EGFP的表达情况,同时用台盼蓝染色、细胞球计数、免疫细胞化学方法分别检测对照组和转染组细胞的活力、增殖、分化情况。结果Ad/EGFP转染16 h后NSCS发出绿色荧光,在第7天左右荧光强度达高峰并可持续稳定表达20天左右,Nestin表达阳性。在分化后细胞的胞体与突起均可见绿色荧光,部分细胞β-Ⅲtubu lin、GFAP表达阳性。同时观察到对照组和转染组的NSCS在第7天、14天、21天时细胞活力、增殖、分化情况均无统计学差异（P〉0.05）。结论Ad/EGFP可以高效转染新生大鼠海马NSCS,且不影响NSCS的存活、生长和分化。EGFP基因是神经干细胞的理想的报告基因。     

增强型绿色荧光蛋白基因转染兔间充质干细胞的实验研究

目的建立增强型绿色荧光蛋白标记间充质干细胞（MSCs）的方法,并观察标记方法对MSCs的分化功能影响。方法应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、培养兔外周阻MSCs,以携带EGFP的腺病毒（Ad-CMV-EGFP）转染MSCs,荧光倒置显微镜下观察其瞬时表达及转染效率,并对转染后的MSCs进行诱导分化为内皮细胞以观察其部分分化功能。结果①MSCs于体外培养14～20d可达到80％～90％融合,细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等。传代MSCs变为形态均一、排列有序的长梭形细胞,增殖活跃;②MSCs经携带EGFP腺病毒转染后24h即可表达EGFP,4～5d时表达最强,此后逐渐减弱,2wk时明显减弱,到4wk时无EGFP表达;③测定腺病毒转染MSCs效率约为60％;④经诱导后分化的内皮细胞呈铺路石样排列,CD31呈阳性表达。结论Ad．CMVoEGFP转染后的MSCs可有效表达EGFP,且本法转染效率较高,基本不影响细胞分化功能,是一种较好的MSCs标记方法。     

3种腺相关病毒介导的绿色荧光蛋白对西藏小型猪胚胎成纤维细胞的转染效率

目的比较3种不同血清型腺相关病毒(AAV)介导的绿色荧光蛋白对西藏小型猪胚胎成纤维细胞的转染效率。方法原代分离培养西藏小型猪胚胎成纤维细胞并进行形态学鉴定,按照感染复数(MOI)为103、104、105转染传代两次的猪胚胎成纤维细胞,流式细胞学检测不同血清型AAV对西藏小型猪胚胎成纤维细胞的转染效率,并在倒置显微镜下观察转染后绿色荧光的表达强度;同时,应用MTT方法检测不同血清型AAV对西藏小型猪胚胎成纤维细胞的毒性。结果腺相关病毒AAV2-EGFP对PFF的转染效率随MOI值的增加而增高,MOI为103、104、105时,转染效率分别为(33.68±1.18)%、(50.80±2.59)%和(60.08±1.08)%,而其他两种血清型病毒感染效率均低于AAV2-EGFP。3种病毒转染PFF过程中,细胞生长正常,MTT显示各个转染组与对照组(未转染组)在D570处吸光度无显著差异。结论AAV2血清型载体对体外培养的猪胚胎成纤维细胞的感染效率显著高于其他几种血清型,AAV8和AAV9对PFF感染能力极差,筛选AAV2作为西藏小型猪基因打靶的最适病毒载体;同时,3类血清型病毒载体对猪胚胎成纤维细胞均无明显细胞毒性。     

腺相关病毒与人α1干扰素基因重组体的构建

目的 构建腺相关病毒载体(pWP8A)与人α1干扰素(hIFNα1)基因重组体。方法 用多聚酶链反应(PCR)方法扩增获得hIFNα1基因；以T-A克隆方法将PCR扩增hIFNα1基因亚克隆到PCR2，1质粒中，产生PCR2．1—hIFNα1；用EcoRI酶切PCR2．1—hIFNα1，后回收hIFNα1基因片断，将此片断连接到pWP8A的EcoRI位点上，构建重组体pWP8A—hIFNα1；pWP8A—hIFNα1转化JM109大肠杆菌扩增，hIFNα1基因经测序鉴定符合Genebank中hIFNα1序列，并用BanH I酶和Xbal I酶双酶切鉴定hIFNα1基因插入方向。结果 经MR扩增获得567bp hIFNα1基因；构建重组体pWP8A—hIFNα1，经测序证实pWP8A—hIFNα1中的hIFNα1与Genebank中hIFNα1序列相同，用BamH I酶和Xbal I酶双酶切鉴定hIFNα1基因插入方向正确的重组体pWP8A—hIFNα1。结论 成功构建腺相关病毒载体(pWP8A)与人α1干扰素(hIFNα1)基因的重组体。     

人单纯疱疹病毒加强型绿色荧光蛋白真核表达系统的构建及表达

目的：构建人单纯疱疹病毒2型（HSV-2）加强型绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达系统，用于HSV感染的快速诊断。方法：通过PCR扩增HSV-2启动子ICP10目的基因片段，克隆至真核表达载体pEGFP—1，构建重组质粒pICP10—EGFP，脂质体法转染Veto细胞，经G418筛选获得稳定转染细胞株Veto—ICP10—EGFP。以不同量的HSV-2感染Vero—ICP10—EGFP细胞，分别于感染后6、8和10h，于倒置荧光显微镜下检测EGFP荧光。同时以人巨细胞病毒和柯萨奇病毒感染Vero-ICP10—EGFP细胞，检测其特异性。结果：构建的重组质粒pICP10—EGFP经DNA测序鉴定，表明重组正确。重组质粒pICP10—EGFP转染Vero细胞后，经G418长期筛选建立稳定转染细胞株Vero-ICP10—EGFP，感染HSV-2后6h，倒置荧光显微镜下即可检测到EGFP荧光。人巨细胞病毒和柯萨奇病毒感染Vero—ICP10—EGFP细胞后6、10和24h，均未检测到特异性荧光。结论：成功构建了HSV-EGFP真核表达系统．其具有早期、快速、灵敏等优点，特异性较高，可望用于HSV感染的快速诊断。     

睾丸特异性表达GFP小鼠的繁殖及其表型鉴定

目的 繁殖睾丸特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）小鼠,为进行小鼠生殖系统的研究提供有效的工具。方法 将Ddx4-cre转基因雄鼠与Rosa26mT/mG转基因雌鼠交配,通过Cre/loxP重组系统产生睾丸特异性表达GFP小鼠,利用分子、病理及活体成像的方法,从器官、细胞、分子水平上对该鼠进行表型鉴定。结果 分子水平的结果表明在这种小鼠的睾丸组织中发生了Cre酶介导的特异性基因重组;从器官水平上可以看到在这种小鼠的睾丸组织中具有GFP的表达;睾丸冰冻切片及精子荧光观察显示GFP主要表达于次级精母细胞、精子细胞和精子中。结论 睾丸特异性表达GFP小鼠繁殖成功。