CFSE标记的内皮祖细胞在激光损伤的小鼠视网膜中的示踪研究

背景 探讨羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的内皮祖细胞（EPCs）在激光损伤视网膜小鼠模型中示踪的体内外研究。 方法 从人脐带血中分离、培养EPCs,并进行鉴定。应用不同浓度的CFSE标记EPCs,通过荧光强度和对细胞的毒性检测,选定最佳标记条件。采用Trypan blue拒染法和Annexin V/PI染色法测定标记后EPCs的生存能力和凋亡率的变化。荧光显微镜下观察标记荧光随培养时间的变化情况。利用视网膜激光光凝制作小鼠视网膜损伤模型,并将标记的EPCs注射到其玻璃体腔内进行示踪研究。Evans蓝灌注血管造影及视网膜铺片观察标记细胞在视网膜的分布情况。 结果 研究结果表明5 μM CFSE为标记EPCs最佳条件,标记的细胞呈现明亮的绿色荧光,并保持良好的细胞形态。在标记2天、1周和4周内,检测生存能力及凋亡率较未标记的细胞没有明显变化,但标记荧光的强度在4周内逐渐下降。Evans蓝灌注血管造影可清晰显示视网膜毛细血管网的结构,激光斑处可见荧光渗漏。移植标记的EPCs1周后,可见荧光标记的细胞在激光斑周围聚集,移植后4周可在视网膜血管网中观察到类似管状的荧光结构形成。 结论 活体染料CFSE可在体外标记EPCs,并在体内示踪至少4周,进一步证实EPCs可能参与损伤视网膜血管的修复。     

羧基荧光素乙酰乙酸在移植免疫研究中的应用

目的：介绍和探讨活体荧光示踪染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA—SE)在移植免疫研究中的应用及价值。方法：以不同浓度的CFDA—SE标记小鼠脾细胞用于体内外实验。标记Balb／c(H2^d)和C57BL／6小鼠(H2^b)脾细胞行混合淋巴细胞培养，流式细胞术观察标记细胞的增殖情况。Balb／c裸小鼠(H2^d)构建移植物抗宿主(GVHR)、宿主抗移植物(HVGR)模型；通过流式细胞术检测标记细胞在外周血及脾的增殖情况。结果：荧光显微镜观察到标记细胞。流式细胞术检测到标记细胞荧光强度出现倍减现象，表明细胞发生了增殖；无抗原刺激组荧光强度无明显变化，抗原刺激后24—72h标记细胞停留在脾，第3天后增殖细胞进入外周血液。结论：羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记技术可应用于体内、体外实验，有助于对细胞增殖及定位进行检测，在移植免疫实验研究中具有很高的应用价值。     

氨基免疫荧光探针在瓣膜交联度检测中的应用

目的利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)能与氨基基团发生特异性不可逆结合,且在波长为488 nm的激发光下发出绿色荧光的特性,检测人工心脏瓣膜的交联程度。方法将去细胞的牛心包浸泡于0.5%的戊二醛溶液中进行交联处理,根据浸泡时间不同分为空白对照组、10 min组、30 min组和6 h组。各组分别制成冰冻切片,经CFSE溶液处理后,通过荧光显微镜观察每组切片的荧光强度,采用图像分析软件计算每组图像的平均荧光强度。同时,从戊二醛处理过的牛心包中提取蛋白质,用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)检测各组牛心包的剩余蛋白含量,与氨基免疫荧光探针法进行比较。结果未交联的氨基数量随交联时间增加逐渐减少,荧光强度空白对照组>10 min组>30 min组>6 h组,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测结果显示,从空白对照组到6 h组可提取的蛋白越来越少。结论与蛋白电泳法检测生物瓣膜交联度相比,CFSE荧光免疫法更为直观灵敏,且能反映瓣膜组织任何部位、层厚的交联效果,为人工生物瓣膜交联度的检测提供新的理论依据和思路。     

单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B基因疫苗的构建及其诱导小鼠细胞免疫应答

目的:构建、制备单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B DNA疫苗，检测其诱导机体产生的细胞免疫应答效果。方法:利用PCR技术从HSV-1 SM44毒株基因组中扩增出编码HSV-1 gB14～507氨基酸序列的一段基因。定向插入真核表达质粒pcDNA₃载体中，构建出重组真核表达质粒pcDNA₃-gBt，并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定。于BALB/c鼠注射免疫3次，抗体分析CD4⁺、CD8⁺T细胞亚群的变化，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)/碘化丙碇(PI)双标记的流式细胞计数法检测CTL活性。结果:PCR及测序鉴定结果显示，插入的克隆基因与GenBank中HSV-1F株gB基因序列一致，证实了HSV-1 gBt核酸疫苗的构建；pcDNA₃-gBt免疫组BALB/c鼠的CD4⁺T细胞数较空质粒（pcDNA₃）对照组和生理盐水对照组增加，CTL活性也较对照组明显增强，但是pcDNA₃-gBt免疫组BALB/c鼠的CD8⁺T细胞、CD4⁺/ CD8⁺T细胞比值与对照组比较差异均无显著性（P＞0.05）。结论:HSV-1 gBt核酸疫苗诱导较强的细胞免疫应答。     

TGF-β1诱导的新生儿脐带血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞增殖动力学研究

目的：探讨转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）诱导的新生儿脐带血CD8^＋CD25^＋调节性T细胞增殖活性。方法：新生儿脐带血单个核细胞经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE）标记后,加入TGF-β1,同时用CD3mAb激活和IL-2培养扩增。培养第4、6、8天收集细胞,用流式细胞术检测活化增殖后的CD4^＋CD25^＋、CD8^＋T细胞增殖动力学变化。结果：培养后第6、8天,实验组CD4^＋CD25^＋T细胞增殖指数分别为11.52、23.04,高于对照组CD4^＋CD25^＋T细胞（6.68,10.46）及实验组CD8^＋T细胞（4.23,5.43）。培养后第8天,实验组CD4^＋CD25^＋T细胞第8代到第10代所占的比例为52.74%,在各代中以第8代所占比例最高,而对照组CD4^＋CD25^＋T细胞第8代到第10代所占的比例为36.26%;实验组CD8^＋T细胞第8代到第10代所占的比例为13.54%,在各代中所占比例最高的为第2代,而对照组CD4^＋T细胞第8代到第10代所占的比例为29.44%。结论：TGF-β1诱导的新生儿脐带血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞增殖活性明显强于CD8^＋T细胞。     

利用CFSE标记检测CD8+淋巴细胞增殖

[目的 ]介绍一种新的检测淋巴细胞增殖的方法。 [方法 ]用本室构建的重组蛋白疫苗hsp6 5-CAP3对C5 7小鼠进行 3次免疫后 ,分离小鼠的脾细胞 ,以照射灭活的CAP3转基因细胞为刺激细胞 ,在体外刺激淋巴细胞的增殖反应。淋巴细胞在与刺激细胞共培养之前用绿色荧光染料羧乙基锗倍半氧化物 (CFSE)进行标记。在共培养 72h后 ,用PE标记的抗鼠CD8分子的单抗标记淋巴细胞。收集细胞进行FACS检测 ,出现在二维点图左上象限的细胞代表CFSE含量减少的CD8 淋巴细胞 (CD8 CFSElow)即增殖的CD8 淋巴细胞 ,利用流式细胞仪记数左上象限CD8 CFSElow细胞的比例。 [结果 ]经体外刺激的脾淋巴细胞中 ,实验组CD8 CFSElow的平均百分比值为 (16 .4 7± 2 .10 ) % ,对照组CD8 CFSElow 的平均百分比值为 (7.6 9± 1.6 5 ) % (P <0 .0 5 )。 [结论 ]通过FACS结果判定CD8 淋巴细胞发生了特异性的增殖。CFSE标记是一种有效的检测淋巴细胞增殖的方法。     

CFSE标记细胞的影响因素探讨

目的探讨影响CFSE标记细胞效果的多种因素。方法用不同配制时间、不同浓度的CFSE标记不同浓度的HL60细胞、MCG803细胞以及人淋巴细胞。结果配制的CFSE在存放2年以后标记率下降12.32%;在10μmol/L范围内细胞标记率与CFSE浓度成正比;低浓度细胞的标记率比高浓度的更高;同等条件下HL60细胞的标记率高于MCG803细胞;细胞的异质性使同一群细胞的标记率发生差异;散点图比直方图更适合CFSE标记细胞的传代分析。结论2.5~5μmol/L的CFSE是理想的标记浓度,106/mL是合适的标记细胞浓度,均一的细胞是高质量标记的关键。     

氧化苦参碱抑制二硝基氟苯所致小鼠接触性皮炎及淋巴细胞增殖

目的 探讨氧化苦参碱(OMT)对二硝基氟苯(DNFB)所致小鼠变应性接触性皮炎(ACD)的抑制作用及小鼠淋巴细胞增殖的影响.方法 建立DNFB所致小鼠ACD模型,以不同剂量的OMT、PBS、氢化可的松(HCT)进行腹腔注射,检测小鼠耳廓肿胀度变化;利用羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)染色,流式细胞术检测OMT对小鼠淋巴细胞增殖的影响.结果 OMT对DNFB所致小鼠ACD呈剂量依赖性抑制作用,且与同等剂量HCT作用效果相似,但副作用明显减小;体外实验证明,在500、125和31 μg/mL组OMT对小鼠淋巴细胞增殖呈剂量依赖性抑制.结论 OMT对DNFB所致小鼠ACD有显著的抑制作用,而且抑制小鼠淋巴细胞增殖;OMT是一种免疫抑制剂.     

肺结核患者T淋巴细胞亚群的检测及临床意义

目的探讨外周血淋巴细胞亚群的比例变化在结核病的临床意义。方法采用流式细胞仪检测继发性肺结核患者93例（其中初治肺结核49例．复治耐药肺结核44例）,急性血行播散性肺结核29例患者的外周血CD3＋、CD4＋,CD8＋淋巴细胞亚群及CD4＋／CD8＋比值。结果急性血行播散性肺结核患者组外周血CD8＋T细胞比例明显增高[（34．64±5．45）％1,而CD3＋[（63．29±4．16）％]、CD4＋[（27．81±6．17）％]及CD4＋／CD8＋[（0．81±0．42）]则明显降低,与初治肺结核组及复治耐药肺结核组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。初治肺结核与复治耐药肺结核组间CD3＋、CD4＋,CD8＋及CD4＋/CD8＋比较．差异无统计学意义。继发性肺结核患者病变范围广泛者（病灶≥3个肺野）的CD3＋T细胞比例为（65．37±9．9）％,明显低于病变范围小者[（74．49±1．07）％],差异有统计学意义（P〈0．05）。结论T淋巴细胞亚群在结核病患者外周血中分布失衡,可能与疾病的发展相关。监测结核病患者T淋巴细胞亚群水平,对评价患者的细胞免疫功能及对疾病的免疫治疗均有重要的指导意义。     

结肠癌患者淋巴细胞亚群改变与疗效关系的探讨

目的：探讨检测结肠癌患者淋巴细胞亚群的临床意义。方法：收集85例我院收治的结肠癌患者,采用流式细胞仪检测其化疗前后淋巴细胞亚群的改变并与50例健康体检者进行比较,分析其临床意义。结果：结肠癌患者外周血中,CD3＋和CD4＋细胞的比例分别为（55.36±11.19）%和（32.03±8.57）%,CD4＋/CD8＋的比值（1.05±0.28）均较正常对照组显著降低（P〈0.05）。同时笔者发现患者临床分期越晚、组织分化程度越差,外周血中CD3＋和CD4＋细胞的比例越低、CD4＋/CD8＋的比值越低,而CD4＋CD25＋细胞的比例越高（P〈0.05）。治疗有效的患者CD3＋和CD4＋细胞的比例、CD4＋/CD8＋的比值均显著高于无效组,而CD4＋CD25＋细胞的比例显著低于无效组（P〈0.05）。结论：检测结肠癌患者淋巴细胞亚群及其化疗前后的变化有助于了解机体免疫状态,对患者的治疗效果进行判断。     

晚期肿瘤患者淋巴细胞亚群特点及临床意义

目的：通过观察晚期肿瘤患者外周血淋巴细胞亚群特点,探讨其免疫功能状况及临床意义。方法：应用流式细胞仪检测56例晚期肿瘤患者（肿瘤组）及42例健康体检者（健康组）外周血淋巴细胞亚群计数,并对其作比较。结果：肿瘤组较健康组T细胞亚群CD8＋比值上升,CD4＋、CD4＋/CD8＋比值下降,差值有统计学意义（P〈0.05）,CD3＋比值升高,差异无统计学意义（P〉0.05）,B细胞亚群下降,差异有统计学意义（P〈0.05）,NK比值下降,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：晚期肿瘤患者的细胞免疫及体液免疫功能均低于健康人,其中体液免疫下降较明显,对临床应用提高免疫力药物也具有指导意义。     

IM患者外周血淋巴细胞亚群的变化及其意义

目的观察传染性单核细胞增多症（IM）患者外周血淋巴细胞亚群的变化,探讨机体免疫功能和IM发病的关系。方法采用多参数流式细胞术（FCM）检测40例IM患者（IM组）和30例正常对照组（对照组）外周血的T淋巴细胞（CD3＋）及其亚群（CD3＋CD4＋,CD3＋CD8＋）、CD19＋和CD16＋56＋（NK）细胞,并进行比较。结果与对照组相比,CD3＋CD4＋T细胞、CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋T细胞比值、CD19＋和CD16＋56＋细胞显著降低（P〈0.01）,CD3＋T细胞、CD3＋CD8＋T细胞水平则显著升高（P〈0.01）。结论 IM患者外周血淋巴细胞亚群异常,可能存在细胞与体液免疫功能紊乱,淋巴细胞亚群可做为IM患者免疫状态及评估预后的重要指标。     

CCK-8法检测疟原虫HGXPRT蛋白刺激对淋巴细胞的增殖作用

目的检测疟原虫HGXPRT蛋白刺激淋巴细胞的增殖效果. 方法以HGXPRT蛋白免疫小鼠后制备淋巴细胞,与相应刺激物共同培养后采用CCK-8法检测淋巴细胞的增殖情况. 结果不同浓度的HGXPRT对淋巴细胞的刺激效果不同,以5μg/ml时刺激增殖效果最好. 结论 HGXPRT对淋巴细胞具有增殖作用.     

结核患者检测T淋巴细胞亚群的意义

目的通过检测肺结核（TB）患者外周血淋巴细胞亚群的比例变化,来探讨其在结核病发展中的意义。方法用流式细胞仪分别检测原发型肺结核患者组（92例）、正常对照组（54例）的外周血淋巴细胞表面标记：CD3、CD4、CD8。结果肺结核病患者血清中CD8水平明显增高,CD3、CD4、CD4/CD8明显降低,与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论淋巴细胞亚群在结核病患者外周血中分布失衡,可能与疾病的发展相关。     

手足口病患儿外周血淋巴细胞亚群的检测与意义

目的检测手足口病患儿外周血淋巴细胞亚群,探讨其免疫功能变化及临床意义。方法收集手足口病患儿73例,根据病情分为普通组49例、重症组24例。以8例健康儿童作为对照,采用流式细胞术,检测73例手足口病患儿外周抗凝全血的淋巴细胞细胞亚群：CD3＋细胞、CD4＋细胞、CD8＋细胞、CD19＋细胞、CD16＋56＋细胞的相对计数。结果手足口病患儿重症重型组外周血CD3＋细胞、CD4＋细胞（Th）的百分率较对照组及普通组显著降低（P〈0.01）,CD8＋细胞（Ts）的百分率亦低于普通组（P〈0.05）,而两组间Th/Ts细胞比值的变化不存在明显差异（P〉0.05）;CD19＋细胞、CD16＋56＋细胞的百分率变化无明显差异（P〉0.05）。结论手足口病患儿存在细胞免疫功能紊乱,淋巴细胞的变化以CD3＋细胞、CD4＋细胞为主,其在抗病毒感染中起着重要作用,可能参与了手足口病病情的发展。     

杜仲叶提取物对MC3T3-E1细胞增殖作用的实验研究

目的研究杜仲叶提取物（Euec）对小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1细胞生长、增殖的影响及其分子机制。方法采用Euec与MC3T3-E1细胞体外共同培养,MTT法检测不同浓度Euec处理MC3T3-E1细胞24、48、72h后的细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果4．0～125．0μg／ml的Euec能促进MC3T3-E1细胞增殖,其中7.8μg／ml的Euec对MC3T3-E1细胞增殖的促进作用最强。流式细胞仪检测显示,6.25μg／ml的Euec作用MC3T3-E1细胞48h后,G0/G1期成骨样细胞显著减少,S期成骨样细胞增多,G2/M期成骨样细胞显著增多。结论Euec可促进MC3T3-E1细胞向G2／M期转换,使G1期的成骨样细胞减少,G2期的成骨样细胞显著增加,从而促进细胞的有丝分裂和细胞的增殖。