脐血造血干祖细胞体外扩增的研究进展

脐带血富含造血干细胞，并具有免疫原性低，无肿瘤细胞污染，来源广泛，获取容易等优点，使得脐血成为骨髓及外周血造血干细胞的极佳替代来源。但是单份脐带血所含有的造血干粗细胞（HSPC）数不足以满足成人移植的需要，在体外对脐血造血干祖细胞进行体外扩增有望解决这一难题，并成为近年来研究的热点。本文就脐血造血干祖细胞的生物学特点及扩增研究的进展进行综述。     

脐血造血干祖细胞体外扩增的研究进展

脐带血富含造血干细胞,并具有免疫原性低,无肿瘤细胞污染,来源广泛,获取容易等优点,使得脐血成为骨髓及外周血造血干细胞的极佳替代来源。但是单份脐带血所含有的造血干祖细胞(HSPC)数不足以满足成人移植的需要,在体外对脐血造血干祖细胞进行体外扩增有望解决这一难题,并成为近年来研究的热点。本文就脐血造血干祖细胞的生物学特点及扩增研究的进展进行综述。     

人脐血造血干/祖细胞体外扩增的研究新进展

人脐血造血干／祖细胞增殖能力强，在不同的细胞生长因子联合作用下，可以有目的地扩增，使单份脐血造血干／祖细胞数量增加。动物实验证实了体外扩增并未降低造血干／祖细胞在小鼠体内的造血重建能力。因此，脐血造血细胞体外扩增有望解决成人济血移植中存在的造血干／祖细胞数量不足的问题。     

脐血造血干/祖细胞体外定向诱导扩增的研究

目的　观察不同因子组合在体外对脐血 (CB)中的巨核系等造血祖细胞的诱导扩增作用。方法　用体外液体悬浮培养法 ,将白细胞介素 3(IL 3)、白细胞介素 6 (IL 6 )、血小板生成素 (TPO)、脐血血浆 (CBP)作为刺激因子 ,添加不同的细胞因子组合 ,对CB的单个核细胞 (MNC)短期培养 2 1d。在培养的 0、7、14、2 1d检测新鲜细胞和培养细胞中的有核细胞数 (NC)、巨核系祖细胞 (CFU Mk)、粒巨噬系祖细胞 (CFU GM)、混合系祖细胞 (CFU GEMM)增殖倍数。结果　在 2 1d内 ,3个实验组的NC数 ,CFU GM、CFU Mk、CFU GEMM都有不同程度的增加 ,其中NC、CFU GM在培养的 2 1d达到高峰。CFU Mk、CFU GEMM在培养的 14d达高峰。在含有TPO的实验组中 ,CFU Mk的增殖倍数高于不含TPO的实验组 ,CFU GM、CFU GEMM增殖的倍数也高于不含TPO的实验组。含有CBP的实验组对CFU GM、CFU Mk、CFU GEMM有明显的促增殖作用。结论　CB中的含有丰富的造血干 祖细胞 ,可以在不同细胞因子的刺激下进行定向扩增 ,TPO可以促进干 祖细胞向巨核系分化 ,对粒巨噬系祖细胞也有促进作用。脐血血浆可以作为协同刺激因子促进CB中干 祖细胞增殖。     

脐血早期造血细胞体外扩增的研究进展

通过选择合适的研究条件,对脐血早期造血细胞进行体外扩增以及评价扩增后的质与量,从而得到相对足够的细胞数并维持其植入能力,使其得以应用于临床移植。现就脐血早期造血细胞在临床应用前体外扩增的基础研究加以系统综述。     

人脐血造血细胞体外扩增的研究进展

单份脐血所含的干细胞数难以满足成人移植的需要[1] 。对脐血造血细胞进行体外培养和扩增有望克服这一障碍。我们就脐血造血细胞体外扩增的实验室研究最新进展作一介绍。1　脐血造血细胞的生物学特征　ＣＤ3 4 细胞是具有多系分化潜能的前体细胞 ,人的造血干细胞主要存在于ＣＤ3 4 细胞群中。如何进一步从脐血ＣＤ3 4 细胞群中纯化造血干细胞进行扩增 ,ＤｉＧｉｕｓｔｏ等[2 ] 发现大约 1%的脐血单个核细胞 (ＭＮＣ)在细胞表面有高度的ＣＤ3 4抗原表达 ,无系分化抗原的标志(Ｌｉｎ阴性 ) ,说明它们可能是未定向分化的造血前体细胞 ,并提…     

造血干/祖细胞体外扩增的临床应用现状

重组人造血生长因子 (Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ ,ＨＧＦ)以及造血干 祖细胞 (Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ,ＨＳＰＣ)动员、采集和分离技术的进步不仅推动了临床大剂量化疗的发展 ,同时也促进了体外扩增ＨＳＰＣ临床应用这一细胞治疗新领域的开展。众多研究显示 ,体外扩增ＨＳＰＣ是可行的。这一技术可克服单份脐血应用于成人ＨＳＰＣ数量的不足 ;对于骨髓移植来说 ,可以减少骨髓的采集量和采集时间 ,对减轻供者的痛苦以及费用具有重要的意义 ;同样对那些外周血干细胞…     

脐血间充质干细胞的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血间充质干细胞(MSC)的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用。方法用液体培养法分离脐血贴壁细胞,采用ELISA方法检测贴壁细胞条件培养液中细胞因子的表达;用流式细胞术分析其免疫表型特征;在成软骨细胞诱导培养条件下诱导细胞分化,并用RTPCR方法检测分化后细胞原胶原Ⅱ型基因的表达。采用分阶段共培养方法观察脐血贴壁细胞对CD34+细胞体外扩增的支持作用。结果脐血单个核细胞纤维样细胞集落形成率为(3.5±0.7)/106。脐血MSC体外至少可以扩增15代。没有分化的脐血MSC表型为CD13、CD29、CD90、CD105、CD166、SH2、SH3和SH4阳性,CD45、CD34和CD14阴性;脐血MSC培养上清中干细胞因子、IL6和肿瘤坏死因子α检测阳性。在成软骨细胞诱导培养基培养条件下,脐血MSC原胶原Ⅱ型基因mRNA表达阳性。脐血MSC与CD34+细胞共掊养14d,CD34+细胞扩增率高于未共培养组4倍。结论脐血MSC具有类似于成体骨髓MSC的特征,对造血干细胞增殖有明显的支持作用。     

间充质干细胞和内皮祖细胞对脐血造血干/祖细胞体外扩增效力的影响

目的比较脐带来源的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)和内皮祖细胞(Endothelial progeni-tor cells,EPCs)对脐血造血干/祖细胞(Hematopoietic stem/progenitor cells,HSCs/HPCs)的体外扩增效力。方法正常人脐血中分离单个核细胞(Mononuclear cells,MNCs),流式细胞术检测其中HSCs/HPCs所占比例,将MNCs分别接种于处理后的MSCs或EPCs或仅接种于培养液中,比较不同培养条件对HSCs/HPCs扩增能力、表面抗原CD34的表达以及集落形成能力的影响。结果共培养过程中,MSC组和EPC组的MNCs扩增倍数均明显高于对照组,且EPC组更为显著。扩增7天后,对照组、MSC组和EPC组的HSCs/HPCs CD34的表达均较扩增前下降,其中EPC组下降的最为显著,MSC组最不显著。共培养4天后,MSC组的HSCs/HPCs集落形成总数为EPC组的2.47倍(**,P<0.01),共培养7天后,MSC组的HSCs/HPCs集落形成总数为EPC组的3.45倍(**,P<0.01);EPC组与对照组的HSCs/HPCs集落形成总数无显著性差异。结论 MSC和EPC均可为HSCs/HPCs的体外扩增提供适宜的微环境,MSC可抑制HSCs/HPCs的分化,有助于维持其表面抗原CD34的表达,并保持其造血重建潜能和归巢能力;而EPC则可有效促进HSCs/HPCs的分化。     

脐血造血干／祖细胞的密度分离实验研究

目的：为建立脐血造血细胞库,减少脐血储存空间,探讨脐血造血干／祖细胞的密度分离效果。方法：选用五种不同比密的Ficoll分离液（1.084、1.077、1.072、1.064、1.054g/L）分离脐血细胞,采用流式细胞技术（FCM）和全自动血细胞分析仪分析了41例脐血造血干／祖细胞和有核细胞（NC）的回收率并作了对比研究。结果：1.064g/L Ficoll分离脐血有核细胞回收率3.6％,淋巴细胞去除率为86.6％;所分离的单个核细胞(MNC）中CD34^ 细胞平均纯度为10.3％,最高可高达46.6％;所分离的细胞体外易形成CFU－GM及BFU－E。结论：不同比密分离脐血造血干／祖细胞具有不同影响。其中1.064g/L Ficoll分离脐血造血干／祖细胞是一种方便、实用、有效的方法。所分离的细胞体外有较强的增殖能力。     

脐带血中造血干/祖细胞的体外扩增研究与临床应用进展

脐带血因具有来源广泛、采集方便、免疫配型要求低、移植后移植物抗宿主病(GVHD)发生率低等优点,为造血干细胞(HSC)的重要来源之一,为需要接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的患者提供1种可靠的HSC来源.然而,脐带血干细胞移植(UCBT)亦存在一定的缺陷,由于脐带血的体积小、细胞数量极有限,其所含的造血干/祖细胞(HS/PC)数量有限,往往不能满足高体重儿童及成年患者allo-HSCT的需要,从而限制了UCBT在临床上的广泛应用.HS/PC体外扩增方法为解决上述难题的关键,笔者拟就HS/PC体外扩增方法的相关研究与临床应用进展进行综述.     

重组人白细胞介素11加速无血缘关系脐血移植血小板植入的临床研究

目的观察重组人白细胞介素11（rhIL—11）加速无血缘关系脐血移植血小板植入的情况。方法9例患者中成人6例，儿童3例。接受HLA0～2个位点不合的脐血移植。成人给予双份脐血移植，儿童给予单份脐血移植。预处理采用BU／CY或CY／TBI方案，同时加用抗胸腺细胞球蛋白（ATG）。采用环孢素联合短疗程甲氨蝶呤预防移植物抗宿主病（GVHD）。移植后1天开始皮下注射rhIL-1150mg·kg^-1·d^-1和G—CSF5mg·kg^-1·d^-1促进造血重建。结果9例患者平均年龄22．3岁，平均体重52．3kg。9例患者8例白细胞植入，中性粒细胞〉0．5×10^9／L的中位时间为21．3（14～37）天；7例患者血小板植入，血小板〉20×10^9／L的中位时间为25（18～36）天。急性GVHD（aGVHD）发生率为42．9％，均为Ⅰ度。慢性GVHD（cGVHD）发生率为33．3％，为局限型。死亡3例，死亡主要原因为感染。存活的6例患者，中位随访时间为7个月，均为无病存活。预计1年总生存率为77．8％，2年总生存率为52．2％。使用rhIL-11的8例患者中5例（62．5％）出现渗漏综合征。所有患者在采取包括紫草的综合防治措施后均可耐受rhIL-11的治疗。结论rhIL-11可能有利于加速血小板的植入，降低严重aGVHD的发生率。渗漏综合征是主要的不良反应，在采取包括紫草的综合防治措施后患者耐受较好。     

非血缘脐血移植的展望

近年,非血缘脐血移植(UCBT)的广泛开展,为恶性及非恶性血液病患者的治疗提供了更多选择.本文将从脐血的选择、预处理方案、植入前综合征(PES)、植入失败和复发的处理等方面,对UCBT的最新进展及前景进行总结.     

HLA相合同胞脐血移植成功治疗一例成人慢性髓系白血病

目的研究脐血移植(CBT)治疗成人恶性血液病的可行性,观察长期造血重建和移植相关并发症的发生.方法 1例18岁体重75 kg的慢性髓系白血病慢性期(CML-CP)患者在用改良的马利兰、环磷酰胺(Bu/CTX)方案预处理后给予HLA相合同胞CBT.输入有核细胞数1.73×107/kg,CD34+细胞为2.7×105/kg.移植物抗宿主病(GVHD)预防方案选用环孢菌素A(CsA)加甲泼尼龙.结果移植后第18天中性粒细胞计数>0.5×109/L,移植后36天血小板计数>50×109/L.CBT后共给予7次血小板输注.移植后80天DNA位点检测示已全部转为供者型.移植后90天后出现严重黄疸,诊断为肝脏急性GVHD合并巨细胞病毒感染,通过加用免疫抑制剂和抗病毒药物治疗,同时辅以血浆交换和人工肝体外胆红素吸附,并发症得到控制.随访24个月,患者一般情况良好,肝功能基本正常,骨髓细胞Ph染色体和bcr/abl基因持续阴性.结论本例为国内首例应用异基因CBT成功治疗成人白血病,表明异基因CBT应用于成人血液病的治疗是可行的.     

不同细胞因子组合对脐血造血干细胞体外扩增效果分析

目的观察不同细胞因子组合对脐血干细胞体外扩增效果的影响。方法用含15%胎牛血清的改良细胞培养液,按加入的不同细胞因子组合分成7个实验组(A—G)进行细胞培养。分别于培养0d、3d、7d、14d取培养液,台盼蓝染色计数单个核细胞的总数、流式细胞仪分析CD34+细胞含量。结果与对照组相比,含细胞因子的7个实验组单个核细胞的数量均显著增加,除F组在培养d14时扩增达到峰值(15.60±10.90)×109/L外,其它各实验组在扩增d7时,均达到了扩增峰值并以E组为最高(17.11±6.12)×109/L,培养延续到d14时,各组均有不同程度的下降。所有实验组CD34+细胞的百分比也显著提高,A、D、E、F、G组均在d7达到了峰值,B、C组则在第14d达到峰值。经计算,扩增7d时CD34+细胞单位体积含量范围在(34.7±10.4)×107/L(A组)—(168.6±43.5)×107/L(这种表述似乎不太合适),对应的扩增达10—50倍。结论不同细胞因子组合可以提高脐血单个核细胞和CD34+细胞的扩增效率,SCF+IL-3,-6,-2,-4的组合在d7时达到了最佳的扩增。     

JAK2转基因骨髓造血干/祖细胞体外长期扩增调控及定向分化的研究

目的　探讨酪氨酸激酶JAK2转基因骨髓造血干 祖细胞体外长期扩增调控和定向分化潜能的可行性。方法　克隆了一个MSCV based逆转录病毒载体称作MGI F2Jak2 ,它编码一个绿色荧光蛋白 (GFP)和两个改进的FK5 0 6结合蛋白 (F36v)与JAK2组成的融合蛋白 ,F36v是二聚化化学诱导物AP2 0 187的结合位点。应用该载体转染GpE 86包装细胞株 ,将C5 7BL 6小鼠的骨髓细胞与照射过15 0 0cGy的GpE 86产毒细胞株共同培养实现基因转导。转导后的细胞在X VIVO 15培养体系中扩增 ,分为①空白对照组 ;②AP2 0 187组 ;③干细胞因子 (SCF)组 ;④AP2 0 187 SCF组。扩增的细胞用直接法标记藻红蛋白荧光素 (PE)结合的抗Sca1、c kit、CD34 、Gr1、CD1 1b、TER 119、CD4 1 、B2 2 0和CD3单克隆抗体以流式细胞仪检测 ,并进行定向分化、祖细胞集落培养和脾细胞集落形成单位 (CFU S)的研究。结果　只有AP2 0 187 SCF组可以持续地使转基因的骨髓造血干 祖细胞大量增殖 ,扩增 80d后细胞可达10 1 4倍 ,细胞倍增时间约 30h ,扩增细胞的表型为CD34 、c kit和Sca1等干细胞表面标志强阳性 ,其它细胞表面标志如Gr1、CD1 1b、TER119、CD4 1 、B2 2 0、CD3接近阴性。所扩增的细胞在不同的细胞因子组合下 ,可定向分化为粒细胞、巨噬细胞、红细胞、     

体外扩增小鼠造血干/祖细胞及重建造血功能的研究

目的 探讨体内中性粒细胞的快速植入及长期重建造血的能力。方法 分离经氟尿嘧啶处理的雄性BDF1小鼠骨髓单个核细胞，以MoFlo细胞分选系统分离纯化CD34^ /c-kit^ 造血干，祖细胞，体外应用骨髓间充质干细胞共培养和阶段扩增结合的方法分别对分离的单个核细胞和CD34^ /c-kit^ 细胞进行体外扩增，并将扩增的有核细胞移植给经亚致死剂量照射的雌性小鼠。结果 以骨髓间充质干细胞为培养基质细胞，结合分阶段扩增方法，有效提高了各种细胞的扩增倍数，其中单个核细胞扩增的总有核细胞、CD34^ 细胞、GM-CFC和HPP-CFC扩增倍数分别为10．8，4．8，65．9和38．8，CD34^ /c-kit^ 细胞扩增的以上4种细胞扩增倍数分别为76．1，2．9，71．7和51．8；扩增细胞移植后可快速产生体内中性粒细胞的植入，并在2个月后的移植小鼠中仍可检测到移植的造血细胞。结论 与骨髓间充质干细胞的共培养，为造血干，祖细胞的有效扩增提供了良好的环境，分阶段扩增法加快了体外造血干，祖细胞的扩增和成熟，为移植后体内中性粒细胞的快速植入创造了条件。     

造血微环境决定脐血造血干/祖细胞的早期分裂行为

目的 在特定生长因子的培养体系中，观察模拟造血微环境及粘附因素对人类脐血造血干/祖细胞早期分裂行为影响。方法 （1）应用流式细胞仪（FACS）分选CD34^ CD38^-细胞；（2）细胞培养体系中应用干细胞支持性基质AFT024及单一粘附因素纤维结合素（Fn)。并观察其对细胞早期分裂行为的影响。结果 （1）在联合生长因子的条件下，人类脐血CD34^ CD38^-细胞早期分裂呈现固定比例的静止，慢分裂，快分裂以及不对称分裂状态；（2）未观察到单一粘附因子Fn对其早期分裂行为的影响；（3）干细胞支持性基质AFT024所模拟的体外造血微环境可促使脐血造血干/祖细胞广泛增殖并更多地进行不对称分裂。结论 （1）CD34^ CD38^-细胞群体具有异质性。由具有不同增殖行为的亚群组成，在体外培养早期存在不对称分裂；（2）体外模拟的骨髓微环境AFT024基质滋养层较细胞因子及单一粘附因素能够更好地支持造血干/祖细胞的增殖并保持其自我更新的特性。     

体外扩增脐血CD34+细胞的实验研究

目的 探讨体外扩增脐血干／祖细胞用于成人脐血移植的可能性。方法 从１０份新鲜的脐血标本中纯化的ＣＤ３４＾＋细胞接种于含体积分数为２０％的胎牛血清（ＦＢＳ）的ＩＭＤＭ培养基的悬 培养体系中,分别加入由ＳＣＦ、Ｆｌｔ－３Ｌｉｇａｎｄ（ＦＬ）与ＩＬ－１β、ＩＬ－３、ＩＬ－６、Ｇ－ＣＳＦ、Ｅｐｏ（合称１３６ＧＥ）组成的３组细胞因子（Ａ组：１３６ＧＥ＋ＦＬ;Ｂ组：ＳＣＦ＋１３６ＧＥ;Ｃ组：ＦＬ＋ＳＣＦ＋１３