高血压患者及大鼠线粒体ATPase6基因的克隆,表达与突变研究

研究正常血压与高血压鼠以及正常血压与高血压患者的差异基因,方法用差别杂交法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）筛选正常人心脏ｃＤＮＡ文库的部分克隆,得到多个在自发性高血压鼠（ＳＨＲ）心肌和高血压患者外周白细胞中高表达的线粒体基因。重组质粒,ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和测序,进行基因突变分析,结果：ＳＨＲ鼠心肌线粒体ＡＴＰａｓｅ６基因构象改变,８７０１位碱基由Ｇ→Ａ（Ｇ８７０１Ａ）,编码的第     

失血性休克肠上皮细胞线粒体DNA ATPase 6,8亚基基因的改变

目的 观察失血性休克大鼠肠上皮细胞mtDNA ATPase6，8亚基基因的改变。方法 将6只Wistar大鼠分成单纯手术组、休克组。分别提取mtDNA，采用PCR技术扩增后测序，检测突变点。结果 Wistar大鼠mtDNA ATPase6，8亚基基因存在多态性，休克组存在A 7797缺失和一定数量点突变：A7863G，G7950T，C8294G，T8505G。结论 失血性休克5h，肠上皮细胞mtDNA ATPase 6，8亚基基因会发生突变，由此可导致所编码的氨基酸的改变，有可能是酶活性改变的原因。     

慢性阻塞性肺疾病稳定期大鼠mtDNA ATPase 6亚基基因的变化

目的观察慢性阻塞性肺疾病（COPD）稳定期大鼠mtDNA ATPase 6亚基基因的改变。方法将20只SD大鼠按照宋一平等介绍的方法（香烟雾熏加脂多糖气管滴入法）复制大鼠COPD模型后提取mtDNA,采用PCR技术扩增后测序,检测突变点。结果 SD大鼠mtDNAATPase 6亚基基因存在多态性,COPD稳定期模型大鼠存在一定数量点突变,mtDNA ATPase 6：A8000T、G8074A、A8439G、C8009T、C8062。结论 COPD稳定期大鼠mtDNAATPase 6亚基基因会发生突变,由此可导致所编码的氨基酸的改变,有可能是酶活性改变的原因。     

金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP—1）的克隆与序列分析

目的：用基因工程技术构建金属蛋白酶组织抑制剂的克隆质粒。方法：从人乳腺癌细胞中分离提取总RNA,经逆转录PCR（RT－PCR）扩增出金属蛋白酶抑制因子1（TIMP－1）的c DNA,插入经NdeI和XhoI双酶切的PET19b载体中,构建了克隆质粒PET19bTIMP－1。结果：对此克隆质粒进行了限制性酶切鉴定和DNA序列分析,结果在扩增出的cDNA中624个碱基中与发表的TIMP－1cDNA序列相比,除361位碱基由A变为G外,其余均完全相同。结论：该突变导致编码的氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸,不影响本课题后期用该克隆化基因表达蛋白作为抗原制备单克隆抗体的目的。该DNA全长624bp,编码207个氨基酸。     

长爪沙鼠ATPase8,ATPase6,COX3基因的克隆及序列分析

目的对长爪沙鼠线粒体ATPase8,ATPase6,COX3基因全序列进行测定,并对其进行鉴定及进化分析。方法根据长爪沙鼠已知基因序列设计引物,采用PCR产物测序法,对目的片段进行测序鉴定。结合已公布啮齿类动物ATPase8,ATPase6,COX3基因序列,分析其碱基组成、遗传距离、并基于最小进化法和UPGMA法构建系统进化树。结果获得长爪沙鼠线粒体ATPase8,ATPase6,COX3基因全序列,其与家鼠、小家鼠和仓鼠均具有较高的同源性(76～98%);进化分析结果显示,长爪沙鼠与家鼠、黑家鼠和仓鼠遗传距离较近;碱基G的含量分别为6.9%,10.7%,15.2%,符合mtDNA的特点;A+T含量分别为68.2%,64.1%,59.2%,明显低于G+C含量,符合哺乳动物的特点。结论本研究为首次获得长爪沙鼠ATPase8,ATPase6,COX3基因全序列,长爪沙鼠与家鼠、黑家鼠和仓鼠具有较近遗传距离,本研究为长爪沙鼠进化研究、线粒体的结构和功能研究奠定基础。     

犬MC1R基因多态性的研究

目的 利用PCR—RFLP和PCR—SSCP技术分别检测犬MC1R基因中两个序列T105A和R306Ter的基因多态性，为遗传育种、培育出更加优良的实验用犬奠定基础。方法 以224只犬为实验材料，对犬MC1R基因T105A片段和R306Ter片段分别进行PCR-RFLP和PCR—SSCP分析，并且分别对具有RFLP和SSCP多态性的片段进行克隆测序，找出等位基因的差异位点。结果 经对犬MClR基因的PCR-RFLP分析，发现犬MC1R基因的T105A序列具有多态性，表现为三种基因型：AA、AB和BB。通过对具有RFLP多态性的片段进行克隆测序发现MC1R基因在编码第105位氨基酸的密码子处存在由G到A的单碱基突变，该突变导致第105位氨基酸发生由精氨酸向苏氨酸的改变，此外在第207位氨基酸的密码子处还发现由A到G的单碱基突变，并产生了一个HhαI限制性内切酶位点。同时，经过犬MC1R基因的PCR—SSCP分析，发现犬MC1R基因的R306Ter序列具有多态性，表现为三种基因型：CC、CD、DD.通过对具有SSCP多态性的片段进行了克隆测序发现，MC1R基因在编码第306位氨基酸的密码子处存在一个由CGA到TGA的终止突变，而使翻译终止。结论 利用PCR—RFLP和PCR—SSCP分析技术证实犬MC1R基因具有明显的多态性。     

缺血再灌注大鼠肠上皮细胞线粒体DNA ATPase 6,8亚基基因的改变

目的观察缺血再灌注大鼠肠上皮细胞mtDNA ATPase 6,8亚基基因的改变情况.方法将6只Wistar大鼠分成对照组、缺血再灌注组.分别提取mtDNA,采用PCR技术扩增后测序,检测突变点.结果 Wistar大鼠mtDNA ATPase 6,8亚基基因存在多态性,在缺血再灌注组存在a7797缺失和一定数量点突变:A7 779T,T8 515G,T8 520G,C8 535G.结论缺血再灌注后,肠上皮细胞mtDNA ATPase 6,8亚基基因存在损伤,由此可能导致所编码的氨基酸改变.     

过氧化氢对肠上皮细胞线粒体编码基因mRNA的影响

目的：观察过氧化氢处理对体外培养肠上皮细胞株SW－480线粒体编码基因mRNA的影响。方法：以400μmol/L和4mmol/L的过氧化氢处理人肠上皮细胞细胞株（SW－480)3h后，分离RNA,应用RT－PCR检测ATPase6、ATPase8、COI、COII及COIII mRNA的变化。结果：过氧化氢对肠上皮细胞线粒体编码基因mRNA的表达具有明显影响，但是这种改变不与过氧化氢的剂量呈现出一种一致的变化。结论：过氧化氢引起肠上皮细胞线粒体编码基因mRNA的明显改变。     

基因检测在Ⅳ型埃勒斯-当洛综合征诊断中的意义

目的 埃勒斯-当洛综合征(Ⅳ型)是临床罕见病例,诊断困难,基因检测技术可明确该病诊断.方法 设计Col3A1基因引物,提取患者外周血标本DNA,PCR扩增后行测序分析碱基突变点,确认氨基酸变化位置,结合临床特征进行疾病诊断.结果 患者Col3A1基因外显子30的第2209个碱基及内含子15的第327碱基出现套峰.在2209位碱基出现G-A的突变,造成第698个氨基酸变化,由丙氨酸(Ala)改变为苏氨酸(Thr),即:P.A698T(c.2209G＞A),突变来源于先证者家系.结论 基因检测可以明确埃勒斯-当洛综合征诊断,对临床有指导意义.

Abstract：

Objective To ascertain the diagnosis of such a rare disease as Ehlers-Danlos syndrome type Ⅳ by the technique of DNA(deoxyribonucleic acid)analysis.Methods The primer sequences of Col3A1 gene were designed. Genomic DNA was isolated from the peripheral blood samples. The amplification of polymerase chain reaction(PCR)was performed and direct sequencing used to screen the mutations.A definite diagnosis was made in conjunctions with clinical features.Results Two nucleotide mutations for Col3A1 were found. One was in intron 15 while another in exon 30. The latter was an important mutation of a G to A transition(c.2209G＞A)resulting in alanine to threonine substitution at position(p.Ala698Thr).The mutations were inherited from proband of pedigree.Conclusion Genetic testing of Col3A1 mutation can facilitate an accurate diagnosis of Ehlers-Danlos syndrome.     

毛发角蛋白的基因多态性在先天性念珠状发家系中的研究

目的 研究先天性念珠状发患者毛发角蛋白基因hHB1和hHB6多态现象。方法 提取患者及其家系成员外周血基因组DNA。采用聚合酶链反应扩增hHB1和hHB6基因的全部序列，PCR产物直接测序验证。结果 患者及其家庭成员在测序时发现hHB1基因第1外显子的第447位碱基表现为C，第52位的密码子表达为CGA-精氨酸。而与该家系无关的50人份测序中该住为-G〉C的杂舍峰，即在此位碱基既可是G也可是C，在GeneBank中氨基酸编码为GGA（甘氨酸）。提示为一单核苷酸多态性改变。结论 该研究在先天性念珠状发家系中发现了可引起编码氨基酸改变的单核苷酸多态性，证实了国外的报道。     

A Mitochondrial DNA A8701G Mutation Associated with Maternally Inherited Hypertension and Dilated Cardiomyopathy in a Chinese Pedigree of a Consanguineous Marriage

Background:

Cardiovascular diseases, including dilated cardiomyopathy (DCM) and hypertension, are the leading cause of death worldwide. The role of mitochondrial DNA (mtDNA) in the pathogenesis of these diseases has not been completely clarified. In this study, we evaluate whether A8701G mutation is associated with maternally inherited hypertension and DCM in a Chinese pedigree of a consanguineous marriage.

Methods:

Fourteen subjects in a three-generation Han Chinese family with hypertension and DCM, in which consanguineous marriage was present in the parental generation, were interviewed. We divided all the family members into case (7 maternal members) and control group (7 nonmaternal members) for comparison. Clinical evaluations and sequence analysis of mtDNA were obtained from all participants. Frequency differences between maternal and nonmaternal members were tested to locate the disease-associated mutations.

Results:

The majority of the family members presented with a maternal inheritance of hypertension and DCM. Sequence analysis of mtDNA in this pedigree identified eight mtDNA mutations. Among the mutations identified, there was only one significant mutation: A8701G (P = 0.005), which is a homoplasmic mitochondrial missense mutation in all the matrilineal relatives. There was no clear evidence for any synergistic effects between A8701G and other mutations.

Conclusions:

A8701G mutation may act as an inherited risk factor for the matrilineal transmission of hypertension and DCM in conjunction with genetic disorders caused by consanguineous marriage.     

伴有高血压的糖尿病大鼠大血管病变SMC增殖早期基因表达谱的研究

目的:建立糖尿病大血管病变平滑肌细胞(SMC)增殖早期基因表达谱.方法:以自发性高血压大鼠(SHR)为对照,以STZ诱导SHR构建伴有高血压的糖尿病大鼠模型为实验组,分别在1周、2周、4周时抽提胸主动脉中膜的总RNA,获得两组cDNA的探针,与含有4 096条大鼠全长基因的cDNA表达谱芯片杂交,扫描芯片荧光信号图像,对差异表达基因数据进行生物信息学分析.结果:1周时有差异表达的基因321条,160条基因表达下降(ratio<0.5),161条基因表达上升(ratio>2).2周、4周时上述数据分别为414、238、176和403、202、201.分级聚类分析归为8类,3期全部高表达已知基因13条,其中4条持续升高的基因(CD74、Irf1、GAP43、CD36)都与细胞增殖有关.CYP2E1基因的表达大幅上调(ratio 1 w=34.54; ratio 2 w=24.82; ratio 4 w=33.57).结论:糖尿病大血管病变SMC增殖是多基因综合改变的结果,细胞增殖相关基因高表达是主要病理基础,CYP2E1基因可能是糖尿病大血管病变SMC增殖较重要或关键的基因.     

eNOS基因多态性对乐卡地平逆转左心室肥厚的影响

目的探讨内皮型一氧化氮合酶基因G894T多态性对乐卡地平逆转老年轻中度高血压左心室肥厚(LVH)的影响。方法测定患者的年龄、性别、身高、体重等基线特征,采用基因芯片技术测定eNOS基因型,按GG型,GT+TT基因型分为两组,均给予乐卡地平(10～20 mg/d)治疗,测定治疗前后的血压变化;治疗前后行心脏超声检查,测定相关指标并计算左室重量指数(LVMI)的变化。结果 96例患者中,治疗前GT+TT基因型LVMI高于GG型(F=4.673,P=0.033),多元线性回归示eNOS基因G894T多态性是影响高血压性左心室肥厚的主要因素(Beta=0.218,P=0.033)。治疗后患者收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、LVMI均明显下降(t分别为22.680～32.469,P均为0.000),但下降程度GT+TT基因型患者明显大于GG基因型患者(F分别为17.675～35.269,P均为0.000)。结论 eNOS基因G894T多态性可能与轻中度高血压LVH有关;eNOS基因G894T多态性影响乐卡地平逆转老年高血压左心室肥厚。     

Differential screening captopril responsive genes in the heart of spontaneously hypertensive rats

Cedac h~ or remodeling is closely "dated tothe development Of caliliac failare in essenhal hnyrtension. There is abundant evidence that ~-angiotensinsystem Plays a crucial I'Ole in the cedac remedeling. Administlation of mpotenSin converting enZyTne (ACE) inhibitoIS can efficiendy prevent the cabal hypeltIDPhy inhUInan and experimental hypertenSion[". The ~ndousefficiency Of ACE ~tor in treatment of cedovasculardiseases was kllown as itS diVerse mechanisms such as inhibition of angio…     

β2-AR基因A46G多态性与原发性高血压、2型糖尿病的关系

目的 :探讨 β2 肾上腺素能受体 (Beta 2 adrenergicreceptor,β2 AR)基因A4 6G多态性与原发性高血压和2型糖尿病的关系。方法 :应用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性的方法 ,检测 1 2 3例健康人 ,1 0 9例原发性高血压患者及 1 0 8例 2型糖尿病病人的 β2 AR基因型。用生化技术测定研究对象的空腹血糖、总胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白 胆固醇。结果 :原发性高血压组G等位基因频率 4 6 .3% ,显著高于正常对照组 35 .8% (χ2 =5 .33,P<0 .0 5 ) ,2型糖尿病组G等位基因频率 4 3.5 % ,与对照组差别无显著性意义 (χ2 =3.0 9,P >0 .0 5 )。结论 :β2 AR基因可能是中国武汉汉族人原发性高血压的重要遗传因素 ,但该基因多态性与 2型糖尿病无显著性相关     

血管紧张素Ⅱ-2型受体基因A1675 G多态性与原发性高血压的相关性研究

目的:研究血管紧张素Ⅱ-2型受体(AT2R)基因A1675G单核苷酸多态性(SNPs)与中国汉族人群原发性高血压(Essential Hypertension,EH)的关系,探讨AT2R基因在EH发病机制中的作用.方法:应用等位基因特异性引物PCR方法检测181例EH患者(EH组)和187例健康人(对照组)的AT2R基因型,比较各组间的等位基因频率及基因型分布差异,分析AT2R基因A1675G多态性与高血压的关系.结果:AT2R基因A1675G的A等位基因频率在EH组明显高于对照组(53.3%vs44.4%),但两组间差异无显著性意义(P＞0.05).在男性组中,EH组的A等位基因频率明显高于对照组(53.6%vs42.9%,P＞0.05);而在女性组中,EH组和正常对照组间各基因型(AA,AG,GG)频率及等位基因频率分布的差异均无显著性意义(P＞0.05).结论:AT2R的A等位基因频率在EH组的分布较正常对照组高,但无统计学意义,尚不能确定AT2R基因A1675G多态性与中国人原发性高血压的发生存在相关性.     

CYP4F2基因调控区G421C与原发性高血压的相关分析及鉴定

目的探讨高血压候选基因CYP4F2基因调控区G421C多态位点与原发性高血压的相关性及其作用机制。方法采用聚合酶链式反应—限制性片段长度多态方法检测196例高血压患者和219名正常对照者的G421C位点等位基因和基因型频率,报告基因检测CYP4F2基因G421C的启动子活性,凝胶阻滞实验鉴定G421C多态所在的Myb反应元件。结果G421C位点的基因型和等位基因频率在原发性高血压和正常对照者间差异具有显著性(P<0·05),携带GG纯合子基因型的个体患病风险增高(OR=1·87,95%CI1·11~3·13,P<0·05);421G等位基因启动子活性明显低于421C启动子(P<0·05);421G位点位于Myb反应元件中,而421C位点破坏了该基序。结论CYP4F2基因调控区的G421C多态与原发性高血压发生相关,421G等位基因通过与Myb反应元件结合抑制该基因的转录。     

灵芝孢子能够调节妊高征大鼠所生幼鼠海马线粒体相关分子物质的水平

目的:探讨灵芝孢子对妊高征大鼠所生幼鼠海马线粒体相关分子物质的影响。方法:用一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制剂N硝基左旋精氨酸甲酯(Nw-nitro-L-arginine methylester,L-NAME)给予大鼠腹腔注射制备妊高征模型,在此基础上胃饲灵芝孢子。应用cAMP放免法、RT-PCR、酶活力检测等技术评价灵芝孢子对妊高征大鼠所生幼鼠海马线粒体相关分子物质水平的影响。结果:妊高征孕鼠的刚分娩幼鼠海马cAMP水平、线粒体DNA(mtDNA)水平及ATP合酶活力都降低。pgc1α表达水平与正常对照大鼠比较没有变化。生后30 d的幼鼠海马cAMP水平、mtDNA水平、ATP合酶活力和pgc1α表达水平低于正常对照大鼠。胃饲灵芝孢子后,妊高征大鼠的刚分娩幼鼠和生后30 d的幼鼠海马cAMP水平和mtDNA含量恢复到正常对照大鼠水平,ATP合酶活力和pgc1α表达水平也有恢复性增高。结论:灵芝孢子具有调节妊高征大鼠所生幼鼠海马线粒体相关分子物质水平的作用。