兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景：骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能。 目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件。 方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1的软骨分化诱导剂,2周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。 结果与结论：可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖。经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性。10 μg/L的转化生长因子β1诱导成软骨分化能力最强。     

转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化*

背景：转化生长因子β1是关节软骨组织工程研究的首选生长因子，适当浓度能刺激关节软骨细胞增殖、分裂和分化。 目的：建立含有转化生长因子β1的特殊诱导体系培养条件下骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的能力，观察诱导后的细胞形态及表型变化。 方法：于兔胫骨结节内侧抽取骨髓，采用贴壁培养法分离纯化兔骨髓间充质干细胞，取第3代骨髓间充质干细胞行流式细胞仪检测鉴定其表面抗原，以含有转化生长因子β1的特殊软骨诱导体系的培养条件下对第3代骨髓间充质干细胞诱导培养21 d，诱导后与人鼻中隔软骨细胞进行比较。采用免疫组织化学法对Ⅱ型胶原进行定性检测。 结果与结论：贴壁培养法可分离并纯化兔骨髓间充质干细胞，所得第3代骨髓间充质干细胞表面抗原CD44 阳性，CD34、CD45 阴性。经诱导培养21 d后细胞形态变为不规则，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示可见阳性细胞。提示含有转化生长因子β1的特殊软骨诱导体系的培养条件下，骨髓间充质干细胞可以转化为软骨细胞，且与正常软骨细胞无明显差异。     

外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响*

摘要 背景：透明质酸是关节腔滑液最主要的成分,对细胞的形态发生起着非常重要的作用,但其用于软骨缺损修复时对骨髓间充质干细胞的影响如何呢？ 目的：通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。 方法：全骨髓法+贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21 d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。 结果与结论：经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结果提示,外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。 关键词：透明质酸;骨髓间充质干细胞;软骨细胞;分化;细胞外基质 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.03.001     

骨髓间充质干细胞在诱导液条件下向软骨细胞的定向诱导分化

背景：骨髓间充质干细胞易于从骨髓中分离，来源取材方便，对供体损伤小，具有强大的增殖能力及多向分化潜能，便于自体移植，如能成功诱导为软骨细胞将是软骨组织工程理想的种子细胞。 目的：观察体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化，并对分化后细胞进行鉴定。 设计、时间及地点：细胞形态学、蛋白质组学的比较观察于2005-05-03/2007-12-30在沈阳医学院临床中心实验室完成。 材料：骨髓间充质干细胞来源于二三个月龄新西兰健康大白兔，体质量2~2.5 kg。 方法：采用全骨髓法分离培养兔骨髓间充质干细胞。取生长良好的细胞第4代细胞消化传代，以1×105密度接种于24孔板中将生长状态良好的细胞在含有地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C及 转化生长因子β的培养液中诱导分化。 主要观察指标：采用免疫组化的方法进行细胞鉴定，RT-PCR法检测诱导分化细胞 II型胶原的表达。 结果：骨髓间充质干细胞经成骨诱导后,由长梭形变为椭圆形及肾形。免疫组织化学方法显示所培养间充质干细胞不表达CD34、CD45，但CD105显阳性。骨髓间充质干细胞在未经诱导时不表达Ⅱ型胶原蛋白，经诱导后在500~750 bp之间可见明显条带。 结论：骨髓间充质干细胞经含地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子维生素C及 转化生长因子β等培养液诱导后，可以在体外向软骨细胞转化，高表达Ⅱ型胶原，并经细胞形态学及蛋白质组学RNA水平鉴定验证。     

胰岛素样生长因子1对人脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的作用☆

背景：近年研究者发现胰岛素样生长因子1还可以诱导骨髓来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化,但目前尚未见胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化及在此过程中与转化生长因子β1相互作用的报道。 目的：观察胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞定向分化的可能性及在诱导分化中和转化生长因子β1的相互作用。 方法：获取脂肪来源间充质干细胞,以2×105 cells/cm2的密度接种于培养瓶,使用含胰岛素样生长因子1或(和)转化生长因子β1的无胰岛素软骨诱导剂诱导脂肪来源间充质干细胞。2周后获取细胞,制备细胞爬片,进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察细胞内高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况。RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9 mRNA的表达。 结果与结论：加入诱导剂后,甲苯胺蓝染色显示3个诱导组细胞呈多角形,胞浆及胞膜呈蓝色异染。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示3个诱导组细胞胞浆及胞膜呈棕黄色着色。RT-PCR检测显示胰岛素样生长因子+转化生长因子组Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan、Sox9 mRNA的表达均显著强于胰岛素样生长因子组和转化生长因子组,胰岛素样生长因子组和转化生长因子组显著强于对照组,而胰岛素样生长因子组与转化生长因子组差异无显著性意义。提示胰岛素样生长因子1可以单独诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,胰岛素样生长因子1与转化生长因子β1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化有协同作用。     

胶原支架复合兔骨髓间充质干细胞体外模拟的微重力培养

背景：骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导的方法包括体外高密度微团培养、体外单层细胞培养、体外三维支架环境诱导、与软骨细胞体外共培养诱导和基因转染诱导培养等。 目的：验证模拟微重力条件下诱导后的兔骨髓间充质干细胞在Ⅰ、Ⅱ型胶原支架上黏附、伸展和增殖情况。 方法：对兔骨髓间充质干细胞体外进行原代和传代培养，按加入诱导条件不同分为2组：实验组(转化生长因子β1+ 胰岛素样生长因子1诱导)组、空白对照组。3周后分别作MTT比色试验、糖胺聚糖检测和免疫组织化学染色。将诱导后的实验组细胞分别种植于Ⅰ、Ⅱ型胶原支架，分为4组培养：复合Ⅱ型胶原支架静置培养、复合Ⅱ型胶原支架模拟微重力培养组、复合Ⅰ型胶原支架静置培养、复合Ⅰ型胶原支架模拟微重力培养组，1周后作苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色。 结果与结论：实验组MTT吸光度值和糖胺聚糖水平检测结果均大于空白对照组，且Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色显示，Ⅱ型胶原支架复合细胞的数量明显高于Ⅰ型胶原支架；模拟微重力培养条件下胶原支架复合细胞的数量明显高于静置培养组。结果说明微重力培养环境有利于高密度细胞的黏附、增殖，有利于细胞之间的信号传递，为维系细胞的生长和代谢提供适宜的微环境；作为诱导后骨髓间充质干细胞的支架材料Ⅱ型胶原支架优于Ⅰ型胶原。     

体外定向诱导鹿茸间充质干细胞向软骨细胞的分化**☆

目的：间充质干细胞的诱导分化的研究多见于骨髓、脐血等组织,而在鹿茸组织中分离的间充质干细胞是否能诱导为软骨细胞目前尚不清楚。实验拟建立梅花鹿鹿茸生长中心间充质干细胞体外培养方法,观察转化生长因子β1体外诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞的可行性。 方法：实验于2006-03/2007-06在吉林大学畜牧兽医学院基础兽医研究室完成。①实验材料：4岁龄健康雄性梅花鹿由中国农科院左家特产研究所提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：于生长早期锯取梅花鹿鹿茸,在解剖显微镜下定位和切取间质层（突起部）,即为鹿茸间充质干细胞所在的组织层。Ⅰ型胶原酶消化法原代分离培养鹿茸生长中心间充质干细胞,锥虫蓝染色显示细胞活性达90%以上,将活性确定后的细胞液氮冻存。取第3代细胞,用含10%胎牛血清以及10 μg/L转化生长因子β1的条件培养基诱导培养。③实验评估：培养12 d 后于倒置显微镜下观察细胞形态,采用细胞化学及免疫细胞化学鉴定细胞。 结果：①鹿茸生长中心间充质干细胞的分离与培养：Ⅰ型胶原酶消化法培养可以获得均一的间充质干细胞,贴壁的间充质干细胞形态均匀,呈长梭形,克隆样生长,增殖迅速。②转化生长因子β1体外定向诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞：转化生长因子β1诱导分化的鹿茸间充质细胞生长迅速,诱导后细胞形态明显改变,呈典型的软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原表达阳性。 结论：采用酶消化法可以从鹿茸生长中心间充质层中分离出间充质干细胞,在体外转化生长因子β1具有促进鹿茸生长中心间充质干细胞分化为软骨细胞的能力。     

腺病毒介导人转化生长因子β2基因转染诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化

背景：前人的工作已证实转化生长因子β1能促进骨髓间充质细胞的增殖,诱导其向软骨细胞分化。 目的：进一步验证人转化生长因子β2(human transforming growth factor-β2,hTGFβ2)基因转染诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化作用。 方法：取清洁级3周龄雄性Lewis大鼠16只,用于分离培养骨髓间充质干细胞。通过腺病毒重组载体Ad-hTGFβ2将外源性hTGFβ2基因转染到体外培养的第2代大鼠骨髓间充质干细胞中,48 h后采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blotting的方法检测转染细胞中目的基因与软骨特异性蛋白——Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况。 结果与结论：从成体大鼠骨髓组织中培养出骨髓间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代。Ad-hTGFβ2转染骨髓间充质干细胞获得稳定表达,免疫组织化学染色和Western blotting检测到基因转染细胞中Ⅱ型胶原蛋白的合成表达,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和蛋白多糖aggrecan mRNA的表达。结果提示,从骨髓组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞,并能在体外稳定增殖传代;Ad-hTGFβ2成功转染骨髓间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化。     

骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化

背景：半月板损伤后自行修复能力有限，组织工程技术为半月板损伤后修复开辟了一条新的途径。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，有可能成为半月板组织工程理想的种子细胞。 目的：观察体外培养的猪骨髓间充质干细胞在诱导培养液作用下向纤维软骨细胞表型分化的可行性。 方法：采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞。取第3代的骨髓间充质干细胞，实验组以2.0×104/cm2细胞密度接种于24孔板，在含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ、地塞米松及抗坏血酸的DMEM-LG完全培养液中诱导分化，对照组以2.0×104/cm2细胞密度接种于24孔板，加入不含诱导因子的DMEM-LG完全培养液。在诱导第7，14，21天分别行甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色检测其分化结果。 结果与结论：①第2代骨髓间充质干细胞的群体倍增时间最短约为2 d，第4代以后相对延长，为5~9 d。②诱导后的骨髓间充质干细胞由梭形向多角形、多边形转变。③实验组可见胞浆呈明显的紫蓝色，尤其细胞密集生长的区域蓝染较深，染色强度随诱导时间延长而增强。对照组的骨髓间充质干细胞只有核蓝染。④实验组和对照组Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色均阳性，各期染色无明显差异。对照组未见Ⅱ型胶原表达，实验组诱导14 d后可见Ⅱ型胶原能稳定的表达。提示骨髓间充质干细胞在体外诱导培养下可分泌纤维软骨细胞特征性细胞外基质，作为半月板组织工程种子细胞来源可行。     

与软骨细胞共培养和条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的比较**

背景：骨髓间充质干细胞体外转化很大程度上依赖于合适的培养条件。 目的：比较与软骨细胞共培养和条件培养液2种不同的诱导方案诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的特点。 方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和耳软骨细胞，采用骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养及条件培养液诱导成软骨的方法，诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。以MTT法及流式细胞仪检测细胞活性及周期，糖胺多糖、甲苯胺蓝以及免疫组化染色检测细胞生物学特性，以RT-PCR法检测诱导后的软骨细胞Ⅱ型胶原RNA表达情况。 结果与结论：采用共培养方式诱导的软骨细胞，其生物学特性与采用条件培养液诱导的软骨细胞相比，前者优于后者，如分泌糖胺多糖的能力以及基质分泌量均较高。提示共培养方式诱导的软骨细胞更接近正常软骨细胞，更有利于作为组织工程软骨的种子细胞。