人脐静脉血内皮祖细胞的分离扩增和生物学特征

目的:探索人脐静脉血内皮祖细胞的分离和扩增条件,并观测其生物学特性.方法:采集人脐静脉血,应用密度梯度离心法,分离其中单个核细胞,流式细胞术检测CD133 CD34 阳性率;利用差速贴壁法(48 h内贴壁和48 h后贴壁)联合内皮细胞专用培养基EGM-2培养细胞,接种于预先包埋了明胶培养瓶或培养板,倒置显微镜观察细胞生长形态和形成集落能力,免疫细胞化学法检测其免疫表型,摄取Ac-LDL和连接UEA-1功能,在生长因子培养体系中诱导其向成熟内皮细胞分化.结果:所获单个核细胞中CD133 CD34 百分比为1.06%;在EGM-2培养体系下可获得2种亚型的内皮祖细胞,即早期内皮祖细胞和晚期增殖性内皮祖细胞.其中48h后贴壁细胞属于早期内皮祖细胞,增殖能力较弱,免疫荧光检测,显示CD14和CD34KDR胞浆呈阳性表达,Ac-LDL UEA-1 功能特征;而48 h内贴壁细胞在10～17 d时可见由单个细胞增殖形成的克隆,呈铺路石样单层排列,增殖力旺盛形成融合状态,形成次集集落;经免疫荧光检测,显示CD133CD34和CD34KDR细胞质呈阳性表达,Ae-LDL UEA-1 功能特征,传代后vWF,CD31呈强阳性表达,是晚期增殖性内皮祖细胞.结论:经人脐静脉血可分离培养获得2种亚型的内皮祖细胞,在特定的培养体系中细胞可由祖细胞表型向成熟内皮细胞分化.     

肾毒性物质对甲酚抑制内皮祖细胞增殖和eNOS磷酸化

目的:观察对甲酚对人外周血晚期内皮祖细胞(EPCs)的体外增殖和内皮一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响.方法:用密度梯度离心法分离健康成人外周血中的单个核细胞,在含有血管内皮生长因子等的培养基中培养.通过形态学、免疫荧光、流式细胞分析鉴定细胞,在贴壁细胞中加入不同浓度对甲酚,用细胞计数和集落生成实验法评价对甲酚对EPC...     

小鼠脾脏内皮祖细胞的分离和培养

目的探讨小鼠脾脏内皮祖细胞（endothelial progen itor cell,EPC）的体外分离,定向分化和培养方法。方法梯度密度离心法从小鼠脾脏中分离单个核细胞,用含血管内皮生长因子的M199培养液培养,每4 d更换培养基去除非贴壁细胞,观察经过不同时间培养后的细胞形态、结构和功能变化。结果培养4 d可发现梭形贴壁细胞,7d后细胞成集落状,14 d左右可观察到条索状、网状血管样结构,原代细胞培养21 d左右接近融合并呈典型的鹅卵石样排列。培养7 d透射电镜可见特征性的W e ib le-Palade小体存在,细胞CD31表达阳性,细胞D iI-LDL摄取试验阳性,FITC-UEA-I染色阳性;流式细胞仪检测细胞Sca-1及VEGFR-2的总阳性率分别为（34.6±3.8）%和（50.5±4.9）%,且该细胞具有体外成血管能力。结论通过密度梯度离心联合贴壁筛选可以获得脾脏EPC。     

洛伐他汀影响内皮祖细胞分化的机制

目的研究洛伐他汀对内皮祖细胞分化的影响机制。方法密度梯度离心方法分离人脐带血单个核细胞，将其接种于人纤连蛋白包被的培养板上，添加生长因子的M199培养基培养。培养20d后，使用免疫荧光及流式细胞技术鉴定EPC的表面标志物CD34、CD133和VEGFR2的表达，以及其摄取乙酰化LDL和结合剂豆凝集素的能力，经鉴定后，采用黏附实验，Matrigel成管实验．及Western blot检测方法观察洛伐他汀对内皮祖细胞（EPC）分化的影响。     

阿魏酸对人脐带血内皮祖细胞生物学功能及血小板衍生生长因子分泌能力的影响

目的 观察阿魏酸(FA)对人脐带血内皮祖细胞(EPCs)增殖、迁移、黏附、成管以及分泌血小板衍生生长因子(PDGF)能力的影响.方法 取足月健康新生儿脐带血,通过密度梯度离心法分离得到单个核细胞,经CD31抗体和DAPI核染、FITC-UEA-I和Dil-AC-LDL双荧光联合染色法鉴定得到EPCs.将鉴定成功的EPC...     

小鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定

目的 建立一种高效、稳定的从小鼠骨髓中分离培养与定向诱导分化内皮祖细胞的方法.方法 通过密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离单个核细胞,经差速贴壁结合特殊培养基扩增,诱导分化为内皮祖细胞.应用流式细胞技术鉴定内皮细胞系列标志:CD34、CD31、Flk-1和祖细胞标志CD133.结果 经密度梯度离心和差速贴壁法分离所得的细胞经EBM-2专用培养基培养后,第4天可见集落形成,培养第12天流式细胞仪检测其CD34、CD133、Flk-1、CD31的阳性率分别为65%±4%、48%±3%、37%±3%和51%±4%.结论 从小鼠骨髓中分离培养与定向诱导分化内皮祖细胞的方法效率高,稳定性和重复性好.     

糖基化终产物引起晚期内皮祖细胞功能障碍

目的观察与糖尿病患者血清浓度类似的糖基化终产物修饰的牛血清白蛋白对体外培养脐血来源晚期内皮祖细胞功能的影响并探讨可能机制。方法密度梯度离心法分离脐血中单个核细胞,用差速贴壁法分离、培养晚期内皮祖细胞。流式细胞术、免疫细胞化学染色及荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白、植物凝集素被用于鉴定培养的细胞。将晚期糖基化修饰的牛血清白蛋白与晚期内皮祖细胞共同培养24h后,利用噻唑蓝法检测细胞的增殖能力,AnnexinV/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡;Boyden小室法检测血管内皮生长因子趋化的细胞迁移;ECMatirx-gel检测形成毛细血管样网状结构的能力。利用逆转录聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法测定糖基化终产物受体mRNA和蛋白表达水平。结果脐血单个核细胞在体外培养过程中先后出现两种细胞:第5～7天出现集落样生长细胞,扩增不明显,存在14天左右即消失,这类细胞被称为"早期内皮祖细胞";10～15天时,逐渐出现20～50个细胞组成的细胞簇,1～3天即可形成大于500个细胞簇,细胞呈铺路石样,可传代,大于95%的细胞免疫表型为CD45-/CD146+/CD105+,表达内皮细胞特有的vWF因子,可摄取乙酰化低密度脂蛋白并可与荆豆凝集素1结合,这类细胞被称为"晚期内皮祖细胞"。50～400mg/L晚期糖基化修饰的牛血清白蛋白与晚期内皮祖细胞共培养24h后,与对照组相比,细胞的增殖能力未见明显变化(P0.05)。当晚期糖基化修饰的牛血清白蛋白浓度大于100mg/L时,与对照组相比,晚期内皮祖细胞的凋亡增加(P0.05)、血管内皮生长因子趋化的迁移以及在ECMatirx-gel上形成新生血管的能力下降(P0.05),糖基化终产物受体mRNA和蛋白表达均增加(P0.05)。结论糖基化终产物通过促进凋亡、抑制迁移及体外形成新生血管的能力引起晚期内皮祖细胞功能障碍,这些影响可能与糖基化终产物上调晚期内皮祖细胞上糖基化终产物受体表达有关。     

人外周血单个核细胞不同克隆成分向内皮祖细胞分化的实验研究

目的:探讨从成人外周血单个核细胞中分离、培养内皮祖细胞(EPCs)的方法以及EPCs的生物学特征。方法:密度梯度离心法获得单个核细胞,用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中。细胞在接种后每2 h去除1次未黏附细胞共2次,然后隔日换液1次,7 d后计数早期克隆。每例血样均分为2等份,1份在获得早期克隆后进行下列实验;另1份持续培养直到晚期克隆出现进行相同实验。流式细胞技术检测细胞表面抗原表达,直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素及摄取乙酰化LDL,胶原凝胶细胞种植实验测定体外血管生成功能。结果:早期克隆中心为圆形细胞,周边是放射状排列的纺锤形细胞,再种植不能形成第2代克隆且无体外血管形成功能,细胞表面主要表达CD14和CD45。晚期克隆形态不同于早期克隆,在培养21～28 d间出现,再种植可形成第2代内皮细胞克隆,并能在胶原凝胶中形成管腔样结构。其构成细胞与早期克隆相比CD45、CD14表达显著减少(P<0.01)而CD146表达明显增加(P<0.01),2种克隆的构成细胞在结合植物凝集素和摄取乙酰化LDL方面未存在显著差异。结论:人外周血单个核细胞在内皮培养条件下可形成早期克隆和晚期克隆,早期克隆属于单核细胞系列,晚期克隆细胞具有EPCs的形态和生物学特征。     

人循环内皮祖细胞不同克隆成分的体内外血管生成功能不同

目的探讨成人外周血循环来源的内皮祖细胞不同克隆成分表型特点及体内外血管生成差异。方法密度梯度离心法获得单个核细胞,用含生长因子的内皮培养基接种于纤维连接蛋白包被的培养板中。7d后计数早期克隆并进行下面实验,另1份持续培养直到晚期克隆出现进行相同实验。流式细胞术检测细胞表面抗原,间接荧光染色法鉴定细胞表达假血友病因子。胶原凝胶细胞体外种植及裸鼠体内移植实验分别测定体外及体内血管生成功能。结果早期克隆再种植不能形成第二代克隆且无体内外血管形成功能,细胞表面主要表达CD14和CD45。晚期克隆在培养21~28d间出现,再种植可形成第二代内皮细胞克隆,并能在体外和裸鼠体内胶原凝胶中形成管腔样结构,细胞表达CD45和CD14显著减少(P<0.001)而CD146明显增加(P<0.01)。结论人外周血单个核细胞在内皮培养条件下可形成早期克隆和晚期克隆,只有晚期克隆表现出干/祖细胞和内皮细胞双重表型特征并具有体内外血管生成功能。     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子对大鼠内皮祖细胞功能活性的影响

目的研究粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子对内皮祖细胞功能活性的影响,为探讨血管内皮再生修复机制和心血管疾病的防治提供实验基础。方法首先用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓和脾内皮祖细胞,在倒置相差显微镜下观察内皮祖细胞的生长分化过程。标记FITC-AC133和PE-vWF鉴定内皮祖细胞,在荧光显微镜下观察。然后选取培养7d的内皮祖细胞施加实验因素。分别用MTT比色法、Transwell小室、Matrigel管腔形成的体外模型检测粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子对内皮祖细胞增殖、迁移、管腔形成能力的影响。结果与对照组相比,粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子作用后,内皮祖细胞的OD490值、迁移的细胞数和形成的管腔数显著增加(P<0.001),且随着作用浓度的增加和作用时间的延长内皮祖细胞的OD490值、迁移的细胞数和形成的管腔数逐渐增加。结论在体外,粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子能够增强内皮祖细胞的增殖、迁移和管腔形成能力,并随着作用浓度的增加和作用时间的延长其效应增强。     

大鼠外周血晚期内皮前体细胞体外培养研究

目的体外培养大鼠外周血内皮前体细胞（EPCs）,观察细胞克隆形态并进行鉴定。方法密度梯度离心法分离SD大鼠外周血单个核细胞,EGM-2培养基离体培养。免疫荧光染色鉴定细胞CD34、CD31、CD133、FLk-1、vwF细胞表面标志。Real—TimePCR检测细胞CD34、CD133、FLk-1、eNOSmRNA表达。结果细胞培养10天后可见“铺路石样细胞”和少数“紊乱生长细胞”,传代培养后经免疫荧光及Real—TimePCR鉴定“铺路石样细胞”符合晚期EPCs特点,紊乱生长细胞不表达相应标志。结论通过体外分离长时培养可从大鼠外周血获得晚期内皮前体细胞,具有内皮细胞的特征。     

壳聚糖/肝素层层自组装涂层与CD133^＋内皮祖细胞生物相容性的实验研究

目的研究壳聚糖/肝素层层自组装涂层对CD133＋内皮祖细胞的黏附、增殖相关基因表达的影响,并从分子生物学角度探讨其作为促内皮修复功能药物洗脱支架涂层材料的可行性。方法（1）分离人脐血单个核细胞,免疫磁珠分选CD133＋内皮祖细胞;（2）制备壳聚糖/肝素层层自组装涂层,1%明胶涂层以及玻璃对照皿,接种并培养分选所得内皮祖细胞;（3）免疫荧光鉴定内皮祖细胞;（4）抽提总RNA,RT-PCR法比较不同培养介质中细胞的eNOS、VE-cadherin、KDR、PECAM-1、Sirtuin-1、Thrombomodulin等基因的表达差异。结果（1）重力梯度离心及磁珠分选法所得CD133＋内皮祖细胞纯度较高（92.88%±0.51%（n=4）,在VEGF诱导下能较好的分化为内皮细胞;（2）eNOS、VE-cadherin、KDR、PECAM-1和Sirtuin-1在壳聚糖/肝素层层自组装涂层组表达丰度较玻璃对照组显著增高（P〈0.05）,与明胶组差异不明显,Thrombomodulin在壳聚糖涂层表达丰度较明胶组、玻璃组表达均增高（P〈0.05）结论壳聚糖涂层能促进内皮祖细胞的黏附、增殖,生物相容性好,为理想的生物材料。     

糖基化终末产物对人外周血内皮祖细胞数量及功能的影响

目的观察糖基化终末产物(AGEs)对体外培养的人外周血内皮祖细胞(EPCs)数量及功能的影响。方法体外培养的人外周血EPCs根据不同AGEs-人血白蛋白(HSA)浓度分为对照纽、正常组(终浓度7.5 mg/L)、干预1组(终浓度1 5 mg/L)干预2组(终浓度30 mg/L)和干预3组(终浓度60 mg/L)。采用密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞;激光共聚焦显微镜检测其对FITC标记荆豆凝集素-1的吸附和Dil-标记乙酰化低密度脂蛋白进行细胞功能鉴定;加入AGEs后,分别采用MTT法、Boyden小室测定EPCs的增殖、迁移能力;人纤维连接蛋白检测EPCs的黏附能力;用体外血管生成分析试剂盒检测不同浓度AGEs HSA作用后的EPCs成血管能力。结果高浓度AGEs可减少EPCs贴壁细胞数量(P<0.01),减弱EPCs的黏附(P<0.01)、增殖(P<0.01)、迁移(P<0.05)和成血管能力(P<0.01)。结论 AGEs可减少人外周血EPCs的数量并使用其功能受损。     

小鼠脾源性内皮祖细胞培养及7.0T磁共振单细胞成像初探

目的 建立一种小鼠脾源性内皮祖细胞的培养方法,探讨7.0T磁共振(7.0T MR)系统对磁标记单细胞成像的可行性.方法 密度梯度离心法分离脾脏单个核细胞,诱导培养得到内皮祖细胞(EPC).免疫化学、荧光染色鉴定细胞特性.Fe_2O_3-PLL标记细胞,普鲁士蓝染色,MTT法评价Fe_2O_3-PLL对细胞生长的影响,邻菲啰啉法定量分析细胞内铁含量.7.0T MR不同序列体外单细胞成像.结果 小鼠脾脏单个核细胞经体外诱导培养呈内皮细胞形态,表达EPC表面标志物CD31、CD34、vWF,显示内吞乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)、结合凝集素1(UEA-1)等内皮细胞的功能.MTT检测Fe_2O_3-PLL标记对细胞增殖活力影响不明显,标记组与未标记组吸光度(A)值比较第4天至第7天差异均无统计学意义(第4天,t=2.81;第5天,t=-1.87;第6天,t=-0.298;第7天,t=-0.115;P均＞0.05).磁标记单细胞能够在7.0T MR检测中成像,自旋回波序列(MSME)图像中标记细胞显示灰度高于梯度回波序列(2D-FLASH),MSME序列图像标记细胞平均导致信号缺失体素个数为20.2个,而2D-FLASH序列图像为30.1个,差异具有统计学意义(t=15.2,P＜0.05).结论 小鼠脾脏单个核细胞可诱导分化为EPC.在7.0T MR检测中Fe_2O_3-PLL标记的EPC能够实现体外单细胞成像.     

人体外周血来源成体内皮前体细胞在体外培养过程中的单核细胞和巨噬细胞功能表现

目的：研究成体内皮前体细胞生物学特性,尤其对该种细胞所表现的单核细胞和巨噬细胞特点进行探讨。方法：人体外周血来源的单个核细胞被接种于纤维粘连蛋白(Fibronectin)包被的培养皿中,在 EGM-2培养液中培养。描述贴壁细胞生长曲线,对细胞表型及功能特点进行检测。结果：部分单个核细胞变形成为长梭形细胞,但未表现出明显的增殖能力。这些细胞可以表达部分内皮系表面标志物及单核细胞标志物 CD14。在第4,14,28天进行的 Dil 标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)和印度墨汁双摄取实验显示这种细胞能够同时吞噬这两种物质,却没有类似于内皮细胞的体外成血管现象,从而说明这种细胞有类似于单核细胞和巨噬细胞的吞噬功能。结论：人体外周血单个核细胞来源成年内皮前体细胞在体外培养过程中表现典型的单核巨噬细胞功能,且无明显增殖能力。     

Endothelial progenitor cell culture and differentiation in vitro: a methodological comparison using human umbilical cord blood

OBJECTIVE: Endothelial progenitor cells (EPC) can contribute to vascular repair and targeted tumour therapy. Little is known about generating EPC from human umbilical cord blood. We therefore compared methods for purification of EPC from human umbilical cord blood. METHODS: Mononuclear cells were isolated from human umbilical cord blood by density gradient centrifugation and used either unselected or after CD34 preselection. Unselected mononuclear cells were cultured for 9 days. Culture-dish-adherent (CDAC) and non-adherent (CDNAC) CD34+ cells were cultured separately for 4 weeks. Surface markers were assessed by immunofluorescence staining and FACS analysis. RESULTS: In unselected mononuclear cells, VEGF-R2 and VE-cadherin expression increased up to day 6. They stained positive with UEA-1 and took up acetylated LDL. Expression of CD45 and CD14 decreased over time, but remained strong. CD133 and CD34 were not expressed. CD34+-CDNAC acquired an endothelial phenotype over time with an increase of VEGFR-2 and von Willebrand factor (vWF). CD45 and CD14 decreased, while CD34 and the progenitor-cell marker CD133 remained strongly expressed. CD34(+)-CDAC showed a strong increase in VEGFR-2, CD133, CD34 and vWF, while CD14 decreased, and CD45 did not change. CONCLUSION: Putative EPC can be obtained from human umbilical cord blood. When selected for CD34, cells can be differentiated in culture to express markers of mature endothelial cells, while keeping progenitor markers. In contrast, short-term culture of unselected mononuclear cells leads to an endothelioid-monocytoid phenotype devoid of progenitor markers. Thus, the outgrowth from CD34-selected cells appears to be superior to short-term culture of unselected mononuclear cells with regard to endothelial cell-lineage specific differentiation of cells with a progenitor marker profile.     

蛋白酶体抑制剂MG132对外周血内皮祖细胞数量与功能的影响

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对外周血内皮祖细胞(EPCs)数量与功能的影响。方法采用Ficoll密度梯度离心法从外周血获得单个核细胞,接种于包被人纤维连接蛋白的培养板,收集贴壁细胞,加入不同浓度MG132(20nmol/l,50nmol/l,100nmol/l,200nmol/l)培养12、24、48h。激光共聚焦显微镜鉴定,倒置荧光显微镜计数。分别采用MTT比色法、改良的Boyden小室、黏附能力测定观察EPCs的增殖、迁移、黏附能力。结果低剂量范围内,EPCs数量随MG132浓度与作用时间增加而减少,其增殖、迁移、黏附能力亦随MG132浓度与作用时间增加而减少。200nmol/l浓度MG132作用48h对EPC数量、增殖功能及黏附能力的影响最为显著。结论低剂量MG132减少EPCs数量并抑制EPCs的增殖、黏附、迁移能力。     

通心络体外促进人外周血内皮祖细胞的增殖、迁移、黏附的研究

目的：研究中药通心络对体外培养的人外周血内皮祖细胞（EPCs）增殖、迁移、黏附的影响。方法：采用密度梯度离心法分离培养人外周血单个核细胞,经FITC—UEA—I和Dil—acLDL双染色鉴定为正在分化的EPCs。进一步采用流式细胞仪检测其表面标志CD34、CD133,采用MTT比色法、transwell小室、细胞计数法分别观察50、100、200、500、750和1000μg／ml通心络超微粉溶液和500μg／ml通心络超微粉溶液作用0、6、12、24和36h后,对EPCs增殖、迁移、黏附的影响。结果：不同水平的通心络均改善了EPCs的增殖、迁移、黏附的功能,且在500μg／ml时作用最为显著。采用500μg／ml的通心络进行时效作用的研究显示,通心络呈时间依赖性地增强EPCs增殖、迁移、黏附能力,在36h达到高峰（P〈0．01）。结论：通心络能显著改善外周血内皮祖细胞增殖、迁移、黏附能力,这可能是通心络防治心脑血管疾病的新机制。     

硫化氢对内皮祖细胞数量和功能的影响

目的：观察不同浓度的硫化氢（H2s）对体外培养内皮祖细胞（EPCs）数量和功能的影响。方法：以密度梯度离心法获取脐血单个核细胞,培养6d后收集贴壁细胞。用流式细胞仪检测细胞表达CD34、CD133、血管内皮生长因子受体（VEGFR）2、VE—Cadherin,并用荧光显微镜观察细胞吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac—LDL）和异硫氰酸荧光素-荆豆凝集素-1（FITC—UEA-1）来鉴定EPCs。以不同浓度的H2S（0、10μM、50μM、100μM或500μM）孵育EPCs（每天1h）,分别培养4d观察细胞集落及6dEPCs数量。结果：与正常对照组相比,H2S在一定浓度下（〈100μM）呈浓度依赖性促进EPCs增殖及细胞集落形成（P〈0．05）。结论：一定浓度的硫化氢可能通过抗氧化发挥对内皮祖细胞的影响。     

血管内皮生长因子调节内皮祖细胞生物学功能

目的研究血管内皮生长因子（VEGF）对体外培养骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）数量及增殖、迁移、黏附功能的影响及机制初探。方法密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞,FITC-荆豆凝集素I、DiI-乙酰化低密度脂蛋白荧光双染鉴定。单个核细胞培养7d后分为对照组和VEGF干预组。VEGF干预组加入不同浓度VEGF（25,50,75,100μg／L）培养48h,分别采用四氮唑溴盐比色法、改良的Boyden小室和黏附能力测定观察EPCs的增殖、迁移和黏附能力。RT—PCR法半定量检测VEGF对EPCs内皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA表达的影响。硝酸还原酶法比色测定VEGF对EPCs分泌一氧化氮的影响。结果VEGF可浓度依赖性地增加EPCs数量并明显促进EPCs的黏附、迁移和增殖能力,与对照组比较差异显著。VEGF可上调EPCseNOSmRNA的表达,促进EPCs分泌一氧化氮。结论VEGF可能通过上调EPCseNOSmRNA的表达影响EPCs部分生物学功能。