铜绿假单胞菌中Ⅰ类整合子及携带的耐药基因研究

目的 了解整合子在广州地区铜绿假单胞菌中的分布状况及其主要类型,研究Ⅰ类整合子的结构特征并探讨其与细菌多重耐药之间的相关性.方法 采用PCR检测3类整合子整合酶的编码基因,并扩增整合子的可变区,运用DNA测序技术分析整合子可变区的耐药基因及其排列顺序,利用生物信息学的方法对检测到的可变区基因序列进行比对分析.结果 在20株产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌中,15株检测到Ⅰ类整合子,未检测到Ⅱ类和Ⅲ类整合子,其中一株铜绿假单胞菌整合子全长序列含有Ⅰ类整合子整合酶、Aac A4氨基糖甙乙酰转移酶、IMP-25金属β-内酰胺酶、OXA-30 β-内酰胺酶和Cat B3氯霉素乙酰转移酶的编码基因及其相应的基因重组位点,GenBank登录号为EU588392,其中IMP-25为一个新的金属β-内酰胺酶亚型.结论 广州地区铜绿假单胞菌中存在的整合子类型是Ⅰ类整合子,并且该整合子可变区携带多种耐药基因盒,其中一个是金属β-内酰胺酶新亚型IMP-25,在分子水平上阐述了I类整合子参与铜绿假单胞菌对抗生素的耐药性和多重耐药性.     

铜绿假单胞菌I类整合子相关基因的解析和定位

目的对4株铜绿假单胞菌临床菌株携带的I类整合子相关基因进行解析和定位，探讨I类整合子相关基因在细菌耐药性形成和耐药基因播散中的作用。方法采用PCR扩增、DNA测序、DNA序列比对的方法对4株铜绿假单胞菌临床菌株携带的I类整合子相关基因进行解析，采用接合试验对该类整合子进行定位分析。结果4株铜绿假单胞菌I类整合子都含有耐药基因．该耐药基因在相应菌株中发挥耐药作用；该菌整合子位于质粒上。结论I类整合子耐药基因在铜绿假单胞菌耐药性形成和耐药基因的播散中发挥作用。     

铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子相关基因的解析和定位

目的对4株铜绿假单胞菌临床菌株携带的Ⅰ类整合子相关基因进行解析和定位,探讨Ⅰ类整合子相关基因在细菌耐药性形成和耐药基因播散中的作用。方法采用PCR扩增、DNA测序、DNA序列比对的方法对4株铜绿假单胞菌临床菌株携带的Ⅰ类整合子相关基因进行解析,采用接合试验对该类整合子进行定位分析。结果4株铜绿假单胞菌I类整合子都含有耐药基因,该耐药基因在相应菌株中发挥耐药作用;该菌整合子位于质粒上。结论Ⅰ类整合子耐药基因在铜绿假单胞菌耐药性形成和耐药基因的播散中发挥作用。     

不同地区铜绿假单胞菌第一类整合子和整合子相关基因盒的分布

目的对石家庄、昆明两地分离的铜绿假单胞菌临床菌株进行第一类整合子的分布及整合子相关基因盒携带率的比较分析，探讨第一类整合子在两地菌株分布的差别。方法采用PCR方法筛选检测64株石家庄、昆明两地临床分离的铜绿假单胞菌第一类整合子和及其所携带的整合子相关基因盒。结果64株铜绿假单胞菌临床菌中共有43株为第一类整合子阳性菌（阳性率67．2％）；其中石家庄菌株和昆明菌株阳性率分别为71．4％和64．3％，两地铜绿假单胞菌第一类整合子阳性率无显著性差异。第一类整合子阳性铜绿假单胞菌中，石家庄菌株和昆明菌株携带一类整合子相关基因盒的阳性率分别为80．0％和38．％，两地第一类整合子阳性菌中整合子相关基因盒的携带率具有显著性差异（P〈0．01）；两地菌株携带的基因盒大小不同。结论第一类整合子在铜绿假单胞菌临床菌株中广泛分布，环境的选择压力影响细菌整合子相关基因盒的分布。     

铜绿假单胞菌耐药机制的分析

目的了解铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药机制。方法采用纸片K-B琼脂扩散法,参照CLSI2011年版标准判读结果。结果 154株铜绿假单胞菌中来自呼吸内科的52株,内分泌科6株,康复科46株,干部科11株,外科16株,儿科7株,ICU10株,五官科6株。可见,铜绿假单胞菌主要分布于呼吸内科,其次是康复科的慢性病患者。铜绿假单胞菌对米诺环素、头孢曲松、头孢唑肟耐药率达到50%以上,对氟喹诺酮类、氨基糖苷类均低于20%,对碳青霉烯类的美洛培南耐药率达到了7.8%。结论细菌产生头孢菌素酶(Ampc酶)是引起头孢类药物耐药的主要机制;产金属B-内酰胺酶是引起碳青霉烯类抗生素耐药的原因;拓扑异构酶的突变,改变了三元复合物的亲和力,抑制了氟喹诺酮的活性而产生耐药。     

定量分析铜绿假单胞菌第一类整合酶基因的表达

目的整合于是具有整合和表达外来耐药性基因盒能力的基因元件。在细菌耐药性基因的积累和传递中起重要作用。本研究通过定量分析第一类整合子整合酶基因（intI1）在细菌不同生存状态的表达水平，探讨整合子的作用机制。方法培养和提取两株第一类整合子阳性铜绿假单胞菌的液相培养菌、生物被膜菌、被膜脱落菌等三种生长状态的总RNA，采用竞争RT-PCR方法定量检测菌体在以上三种状态下intI1 mRNA的表达水平。结果铜绿假单胞菌的液相培养菌、生物被膜菌和被膜脱落菌都有intI1 mRNA表达；两株菌在三种状态下intI1 mRNA的表达量不同，其中生物被膜菌表达最高，被膜脱落菌次之，液相培养菌最低；生物被膜菌intI1 mRNA的量较液相培养物高约15倍，较被膜脱落菌高约4倍。结论铜绿假单胞菌intI1在生物被膜中mRNA表达上调，随着菌体从被膜脱落以及菌体持续的液相培养intI1表达下调。提示整合子在生物被膜菌中可进行活跃的基因盒的捕获、移动和积累。有利于细菌耐药性的提高及扩散。     

铜绿假单胞菌中整合子的分布及其可转移耐药性研究

目的 研究淮北地区Ⅰ类、Ⅱ类整合子在多重耐药铜绿假单胞菌(PA)中分布及其可转移耐药情况.方法 用聚合酶链反应(PCR)技术榆测多重耐药菌中整合子基因,并对整合酶基因阳性菌株进行转移接合试验;采用K-B法对接合转移成功菌株及接合子进行13种药物敏感试验.结果 多重耐药铜绿假单胞菌中Ⅰ类整合子检出率为86.1%,未检出Ⅱ类整合子,含整合酶基因的接合子在转移成功接合子中所占比率为35.7%.结论 淮北地区铜绿假单胞菌中整合子的分布以Ⅰ类整合子为主,且水平传播率达到35.7%,应引起高度重视.     

41株铜绿假单胞菌耐药分析

目的:了解41株铜绿假单胞菌的耐药情况。方法:对临床分离的41株铜绿假单胞菌用细菌分析鉴定仪(ATB)鉴定,并进行体外药物敏感试验。结果:41株铜绿假单胞菌中,6株为耐亚胺培南菌株,占总菌株数14.6%,耐美罗西林的菌株数达50.0%,左旋氧氟沙星耐药达31.7%,替卡西林/棒酸耐药高达63.0%。结论:亚胺培南是治疗铜绿假单胞菌引起感染的可靠药物之一,而随着耐亚胺培南菌株的增加,应了解铜绿假单胞菌的耐药机制,加强耐药监测,以便为临床提供可靠的依据,指导临床合理用药。     

566株铜绿假单胞菌耐药性分析

目的:了解铜绿假单胞菌的耐药现状。方法:药敏试验用K-B法。结果:铜绿假单胞菌对多种抗生素的耐药率不断上升。结论:临床医生应根据实验室的试验结果合理、有效用药,减少、减缓耐药株的产生。     

269株铜绿假单胞菌耐药率统计和分析

目的:了解铜绿假单胞菌的耐药率,为临床合理选用抗菌药物和控制其感染提供参考。方法:对我院2005年1月―9月从临床标本分离确认的269株铜绿假单胞菌的药敏试验结果进行耐药率统计。结果:铜绿假单胞菌耐药现象严重,对所有抗菌药物都有不同程度的耐药。美罗培南和亚胺培南耐药率较低,为10%和22.3%。头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南的耐药率高于50%,分别为51%、55.6%、60.6%。庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素的耐药率分别为54.6%、48.7%、49.7%,左氧氟沙星和哌拉西林-他唑巴坦的耐药率为43%和38.3%。结论:加强对铜绿假单胞菌的耐药性监测,规范抗菌药物的应用,及早进行菌株培养和药敏试验,是控制铜绿假单胞菌感染和耐药率上升的有效措施。     

铜绿假单孢菌连续分离株耐药性与Ⅰ类整合酶基因的研究

目的了解铜绿假单孢菌临床连续分离株Ⅰ类整合酶基因(inⅠt1)存在情况和耐药性。方法采用聚合酶链反应方法检测97株铜绿假单孢菌inⅠt1。结果97株铜绿假单孢菌中有72株inⅠt1基因阳性(74.2%);其中多重耐药菌,耐药菌、敏感菌inⅠt1基因检出率分别84.7%(61/72)、8.9%(6/72)、6.4%(5/72)(P<0.01)。结论inⅠt1在铜绿假单孢菌中广泛分布,Ⅰ类整合子介导的耐药基因可能与铜绿假单孢菌多重耐药密切相关。     

铜绿假单胞菌主动外排泵介导的多重抗生素耐药性

铜绿假单胞菌作为一种机会致病菌，对多种临床常用抗生素呈现明显的固有与获得性耐药。这种多重耐药性的形成机制在于该菌具有的多种能量依赖性的药物主动外排泵和低通透性外膜屏障协同作用所致。近10年对铜绿假单胞菌药物外排泵的研究已经颇为深入，本文对有关进展予以讨论。在铜绿假单胞菌已报道了6种属于“耐药-生节-分裂(RND)”类的药物外排泵系统，它们可在天然野生株表达或者由于基因突变而诱导表达，从而介导了对β-内酰胺类(包括β-内酰胺酶抑制剂)、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、大环内酯类及四环素类等的耐药性。这些外排泵中尤其以MexAB—OprM系统的作用底物范围最广，在耐药性形成中起主要作用。RND类外排泵系统也普遍存在于其它革兰氏阴性细菌。各外排泵通常由内膜转运体蛋白、内膜融合蛋白及外膜通道蛋白一起形成功能性转运复合体将药物排至胞外。药物外排泵常影响对灭活酶较稳定的抗菌药物。一些新抗菌药物如Linezolid(Oxa—zolidinoes类)、Telithromyein(Ketolides类)及Tigecycline(Glycyclines类)也是MexAB-OprM等RND类外排泵的作用底物，故这些药物抗革兰氏阳性细菌的活性较强。铜绿假单胞菌外排泵表达的调控机制多是在转录水平上受局部阻遏物或激活物的作用。这些局部调节子的基因突变能导致外排泵活性增强。并常见于应用抗生素或其它抗菌消毒制剂后从临床分离的或实验室筛选的多重耐药铜绿假单胞菌。这些耐药菌的形成再次说明合理限制抗菌药物应用的必要性。外排泵系统还与其它耐药机制如细菌的药物作用靶位改变或产生药物灭活酶等一起发挥明显的协同作用，使细菌的耐药程度进一步地增高。现已研制了针对铜绿假单胞菌等细菌的外排泵抑制剂。应用外排泵抑制剂可阻断药物外排泵这一耐药机制，以维护或提高抗菌药物的抗菌活性。如外排泵抑制剂在体外和动物感染模型均被证实明显增强了氟喹诺酮类对铜绿假单胞菌敏感株和耐药株的抗菌活性，并降低了耐药菌的发生率。外排泵抑制剂尚处于临床前的基础实验研制阶段。     

亚最低杀菌浓度环丙沙星体外诱导铜绿假单胞菌标准质控菌株耐药研究

目的:研究亚最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,Sub-MBC)环丙沙星体外诱导对铜绿假单胞菌MIC值影响,为防止临床不合理使用抗菌药物导致细菌耐药性,提供新思路。方法:以铜绿假单胞菌质控菌株ATCC27853为研究对象,以环丙沙星为诱导耐药抗菌药物,用微量稀释法首先测定其MBC值,然后用1/2MBC值环丙沙星浓度进行体外诱导培养,每天观察其MBC值变化,及时调整诱导浓度为变化后MBC值的1/2,直到诱导菌株MBC值升高到原始MBC值的64倍时,停止诱导,并记录诱导天数;诱导出的耐药菌株传代3 d,再采用微量稀释法对其MBC进行测定,并通过全自动微生物药敏仪对其进行耐药性鉴定。结果:铜绿假单胞菌标准质控菌株的环丙沙星MBC值为0.5μg·ml^-1;采用0.25μg·ml^-1环丙沙星浓度体外诱导7 dMBC值明显升高,诱导30 d升高至原始菌株MBC的64倍;诱导出的铜绿假单胞菌针对环丙沙星的耐药菌株,经3 d传代后,微量稀释法测定其MBC仍为原始菌株的64倍,全自动药敏分析仪鉴定为环丙沙星耐药菌。结论:亚最低杀菌浓度环丙沙星可体外诱导铜绿假单胞菌标准质控菌株出现耐药,且耐药性随亚最低杀菌浓度诱导时间延长而增加,诱导出的铜绿假单胞菌耐药菌株的耐药性能稳定传代,提示低剂量使用抗菌药物可导致细菌产生耐药性。     

耐亚胺培南的铜绿假单胞菌整合子基因研究

目的通过分析耐亚胺培南的铜绿假单胞菌的整合子所携带的耐药基因的种类及特点，探讨其耐药机制，为指导临床用药，预防院内感染和流行病学调查、新药的研发提供参考。方法根据美国国家临床标准化研究所（CLSI／NCCLS）2004年标准，应用纸片扩散法（KB）进行药敏试验，采用多重PCR方法对临床分离的23株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌进行整合酶（IntI）检测，并分析整合酶阳性菌株的耐药基因盒。结果药敏试验显示23株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌全部为泛耐株，5株为Ⅰ类整合酶阳性，其中3株为缺失型，无耐药基因盒，其余2株耐药基因为blaVIM4和blaPSE-1；14株为Ⅱ类整合酶阳性，其耐药基因盒均为dfr1-sat1-aadA1；3株Ⅰ、Ⅱ类整合酶均为阳性；7株不含Ⅰ、Ⅱ类整合酶。结论耐亚胺培南的铜绿假单胞菌大多都具备Ⅰ、Ⅱ类整合酶基因和基因盒，这是造成它们成为泛耐株的重要耐药机制。     

Molecular mechanisms of resistance in Pseudomonas aeruginosa to fluoroquinolones

Pseudomonas aeruginosa is important in the field of infectious disease especially with respect to its role in nosocomial infections. Infections with P. aeruginosa may be a problem as the organism has intrinsic resistance to several antibiotics and a capability in acquiring resistance during antibiotic therapy. Fluoroquinolones are sometimes used during antibiotic therapy of P. aeruginosa infections even though resistance to fluoroquinolones may develop. Six strains of P. aeruginosa were studied in an attempt to elucidate the mechanisms of resistance to fluoroquinolones. These included the electrophoresis patterns of the outer membrane proteins (OMPs), random amplified polymorphic DNA (RAPD) and polymerase chain reaction (PCR) analyses. A method is described that improved the clarity of the OMP gels. Resistance in these P. aeruginosa strains could depend not only on DNA-gyrase modifications but also on membranes alterations and on the presence (qualitative and quantitative) of the efflux pump formed by three subunits.     

抗生素压力下铜绿假单胞菌耐药机制变化的动态研究

目的 探索抗生素压力下铜绿假单胞菌在患者呼吸道内耐药性的动态改变.方法 以同一患者不同时期下呼吸道分离铜绿假单胞菌为对象,E-test检测细菌对常用抗菌药物的敏感性;三维水解实验检测目标菌的β-内酰胺酶表型特征;普通PCR检测ESBL、AmpC、碳青霉烯水解酶、膜孔蛋白OprD2等耐药基因;荧光定量RT-PCR检测细菌的AmpC和OprD2的表达情况.结果 筛查到1例因慢性阻塞性肺病急性发作(AECOPD)患者3次入院、下呼吸道分离的属同一克隆的9株铜绿假单胞菌,药敏试验提示细菌的药敏谱存在由单一耐药逐渐转化为泛耐药的模式.三维水解实验显示,5株多重耐药株和泛耐药株高产AmpC酶.所有9株菌的ampC和oprD2基因都为阳性,碳青霉烯水解酶均为阴性.荧光定量RT-PCR检测,多重耐药株和泛耐药株的ampC基因表达量是单一耐药株的1.7～18.7倍;亚胺培南耐药株的oprD2表达量则是敏感株的1/10～1/2000.结论 铜绿假单胞菌在治疗过程中可获得耐药性,其中ampC高表达和oprD2表达下降是导致细菌对亚胺培南、广谱头孢菌素(含酶抑制剂)耐药的主要原因.     

5种铜绿假单胞菌高危克隆的流行及耐药情况

摘要：细菌引起的感染分为社区感染和医院内感染,社区感染的细菌通常对抗生素敏感,较容易控制,而院内感染较难 治疗。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是机会性感染的非发酵革兰阴性细菌,一种引起医院内感染的常见细菌,并容易 感染术后患者及烧伤患者,影响患者的治疗与恢复。抗生素治疗是人们抵御细菌感染性疾病的有效手段,但是随着抗生素的大 量使用,抗生素耐药性细菌不断产生,泛耐药(extensively drug resistant, XDR)甚至是全耐药(pandrug-resistant bacteria, PDR)铜绿 假单胞菌已在世界多地医院被检出。而这种广泛的耐药性往往集中在几种特定的铜绿假单胞菌基因型中,如ST111、ST175、 ST235、ST308和ST664等;由于无药可用,使得它们所引发的感染异常危险,因此被称为高危克隆。本文就目前国际流行的 5种铜绿假单胞菌高危克隆进行系统性综述,包括其流行情况、耐药谱、耐药机制及治疗手段,为高危克隆的甄别和防治提 供借鉴。     

596株铜绿假单胞菌临床分布特点及耐药性分析

目的分析我院596株铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药情况。方法细菌鉴定采用VITEK32全自动细菌培养鉴定仪,药敏试验采用K-B纸片法。结果铜绿假单胞菌主要从痰液标本中分离,占77.7%(463/596);最多的分布病区为呼吸内科(164株)、其次为干部病房(91株)和普通外科(48株)。对阿米卡星的耐药性为84.9%、其次为碳青霉烯类(亚胺培南),耐药性79.8%、加酶抑制剂的复合药物(哌拉西林/他唑巴坦)耐药性为78.5%,对头孢哌酮/舒巴坦的耐药性位72.8%,敏感性尚可。结论院内感染的主要病原菌之一为铜绿假单胞菌,其耐药机制复杂多样,对于大多数抗菌药物耐药,所以要及时进行检测,这样才能采取措施控制感染。     

铜绿假单胞菌265株的临床分布及耐药性分析

目的:调查铜绿假单胞菌(PAE)临床分布特点及耐药性,为临床合理选用抗菌药物提供参考.方法:回顾性调查分析临床标本中分离的265株铜绿假单胞菌的临床感染特点及其耐药性,药敏试验采用琼脂纸片扩散法.结果:PAE临床分布以ICU及呼吸科最多.临床标本中以呼吸道标本分离率最高,占71.3%,其次为分泌物,占13.6%.PAE对亚胺培南最敏感,耐药率为8.3%;其次是头孢呱酮/舒巴坦,耐药率为12.1%;对其他抗生素均有不同程度的高耐药性、多重耐药性.结论:加强对PAE的耐药性监测,规范抗菌药物的应用,对保持敏感抗菌药物的抗菌活性具有重要意义.