Rab13-蛋白激酶A途径调节体外培养支持细胞屏障通透性的研究

目的:研究Rab13蛋白在支持细胞(SC)屏障功能调节中的作用。方法:体外分离培养大鼠睾丸SC,Western blotting检测Rab13的表达,免疫共沉淀检测Rab13与蛋白激酶A(PKA)催化亚基间的相互作用;睾酮处理建立SC体外屏障增强模型,Western blotting和放射自显影法分别检测Rab13的表达及PKA活性变化,并通过跨上皮电阻(TER)检测PKA活性对SC屏障功能的影响;小干扰RNA(siRNA)干扰Rab13表达,检测其对PKA活性及SC屏障功能的影响。结果:Rab13的表达随SC屏障的建立逐渐降低,且与PKA催化亚基间存在相互作用;睾酮处理可使Rab13的表达下降而PKA活性升高;Rab13 siRNA干扰可导致PKA活性升高,且SC屏障功能增强;抑制PKA活性可以拮抗睾酮或Rab13 siRNA对屏障功能的增强作用。结论:Rab13可通过调节PKA活性参与调节SC屏障通透性。     

Rabl3-蛋白激酶A途径调节体外培养支持细胞屏障通透性的研究

目的：研究Rab13蛋白在支持细胞（SC）屏障功能调节中的作用。方法：体外分离培养大鼠睾丸SC，Westernblotting检测Rab13的表达，免疫共沉淀检测Rab13与蛋白激酶A（PKA）催化亚基间的相互作用；睾酮处理建立SC体外屏障增强模型，Westernblotting和放射自显影法分别检测Rab13的表达及PKA活性变化，并通过跨上皮电阻（TER）检测PKA活性对SC屏障功能的影响：小干扰RNA（siRNA）干扰Rab13表达，检测其对PKA活性及SC屏障功能的影响。结果：Rab13的表达随SC屏障的建立逐渐降低，且与PKA催化亚基间存在相互作用；睾酮处理可使Rab13的表达下降而PKA活性升高；Rab13siRNA干扰可导致PKA活性升高，且SC屏障功能增强；抑制PKA活性可以拮抗睾酮或Rab13siRNA对屏障功能的增强作用。结论：Rab13可通过调节PKA活性参与调节SC屏障通透性。     

靶向ERR α siRNA对不同类型子宫内膜癌细胞凋亡的影响

目的探究si RNA作用于不同类型子宫内膜癌细胞雌激素受体相关受体α(estrogen receptor-related receptorα,ERRα)的表达及细胞的凋亡情况。方法 si RNA处理RL952、AN3-CA、HEC-1A和HEC-1B细胞,以RL952、AN3-CA为Ⅰ型子宫内膜癌体外模型,HEC-1A、HEC-1B为Ⅱ型子宫内膜癌体外模型;采用荧光定量PCR法检测ERRαm RNA的表达,Western blot法检测ERRα蛋白的表达,流式细胞仪分别检测si RNA干扰后4株子宫内膜癌细胞的凋亡情况。结果 si RNA组较对照组ERRαm RNA表达水平显著下降(RL952:0.701±0.017 vs.1.165±0.019;AN3-CA:0.899±0.019 vs.1.362±0.007;HEC-1A:0.093±0.004 vs.0.541±0.038;HEC-1B:0.158±0.004 vs.0.356±0.001;P均0.05)。各株细胞si RNA组与对照组ERRαm RNA的表达比较,差异有统计学意义(P0.05),ERRαm RNA表达分别减少了39.77%、34.01%、82.82%和55.78%。West ern blot结果显示,4株细胞RNA干扰后ERRα蛋白表达与m RNA表达趋势一致。4株细胞凋亡率:RL952为(30.000±1.056)%vs.(10.572±1.027)%;AN3-CA为(32.931±1.613)%vs.(10.274±0.882)%;HEC-1A为(17.272±0.950)%vs.(8.704±0.608)%;HEC-1B为(18.703±1.877)%vs.(3.801±0.265)%,si RNA干扰4株细胞后凋亡率与各自对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 si RNA能够有效抑制子宫内膜癌中ERRα的表达,ERRα低表达可能与子宫内膜癌细胞的凋亡增加密切相关。     

叶酸受体-α在卵巢癌耐药细胞株中的表达及其介导的多药耐药的靶向逆转

目的:研究叶酸受体-α(folic acid receptor-α,FR-α)在卵巢癌多药耐药细胞株中的表达水平,并探讨FR-α靶向的MDR1小干扰RNA(siRNA)纳米粒对卵巢癌多药耐药细胞的逆转效果。方法:采用体外浓度梯度递增法建立卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3-ts,应用激光共聚焦法检测FR-α的表达水平。复凝聚法将叶酸修饰壳聚糖载体包裹靶向MDR1的PGPU6/GFP/Neo/PshRNA真核表达质粒(PshRNA-MDR1),形成叶酸修饰壳聚糖PshRNA-MDR1纳米粒(FA-CS-PshRNA)。采用RT-PCR、Western blot检测叶酸修饰前后,纳米粒转染细胞后MDR1 mRNA及蛋白的表达,MTT法检测SKOV3-ts半数抑制浓度(IC50)的变化。结果:激光共聚焦法显示,耐药细胞株SKOV3-ts胞膜层有FR-α强表达,经叶酸修饰后,FA-CS-PshRNA纳米粒较CS-PshRNA能更有效降低靶细胞SK-OV3-ts的靶基因MDR1 mRNA和P-gp蛋白表达(P<0.01),并逆转SKOV3-ts细胞针对紫杉醇的IC50(0.3830±0.0096 vs 0.0353±0.0006,P<0.01)。结论:经FR-α介导,FA-CS-PshRNA能更有效敲除MDR1的表达,靶向逆转卵巢癌多药耐药。     

IL-6、TNFα对人早孕绒毛滋养层细胞胎盘生长因子表达调控的作用

目的:探讨IL-6、TNFα对原代培养人早孕绒毛滋养层细胞胎盘生长因子(PIGF)表达的调控作用。方法:对胰蛋白酶与胶原酶Ⅰ联合消化、Percoll细胞分离液纯化而得到的滋养层细胞进行原代培养,测定100 ng/mL IL-6、50 ng/mL TNFα对滋养层细胞PIGF表达的影响。结果:酶联合消化及梯度离心能较好地分离早孕绒毛中的滋养层细胞,100 ng/mL IL-6作用于滋养层细胞后PIGF分泌增加,与对照组有显著性差异(P<0.01),TNFα作用于滋养层细胞后PIGF分泌也增加,但与对照组差异不显著(P>0.05)。结论:IL-6对PIGF分泌具有促进作用,TNFα对滋养层细胞PIGF分泌的促进作用不显著,提示VEGF与PIGF可能由母胎界面不同的细胞因子所调控。     

甲氧滴滴涕对人绒毛外滋养细胞的白细胞表面抗原G(HLA-G)表达的影响

目的:探讨甲氧滴滴涕(MXC)对绒毛外滋养细胞(EVCT)白细胞表面抗原G(HLA-G)表达的影响。方法:用胰蛋白酶消化加流式细胞仪分离得到人绒毛外滋养细胞,进行原代培养及鉴定。将所获细胞分为MXC(1μmol/L、3μmol/L、5μmol/L、7μmol/L)处理组及空白对照组,培养12h、24h、48h。用Western blotting检测各组各时间点HLA-G的表达,同时用RT-PCR法检测HLA-GmRNA表达。结果:MXC处理组滋养细胞HLA-G表达呈时间剂量依赖性下降,HLA-G mRNA变化与其一致。结论:MXC可从蛋白和mRNA水平降低绒毛外滋养细胞HLA-G表达,从而降低其免疫耐受功能。     

二噁英对子宫内膜异位症患者子宫内膜细胞TNF-α表达的影响

目的:探讨二噁英(TCDD)在子宫内膜异位症(EMs)发病中的作用。方法:通过预实验,加入一定浓度的TCDD分别作用于11例EMs患者离体在位子宫内膜细胞和12例离体对照组子宫内膜细胞24 h,应用Real-time RT-PCR和ELISA法检测TCDD处理前后子宫内膜细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA和蛋白的表达。结果:TCDD未处理前,EMs组子宫内膜细胞分泌TNF-α蛋白和mRNA水平均显著高于对照组(P<0.05)。TCDD呈剂量依赖方式促进子宫内膜细胞TNF-α蛋白的分泌,以10 nmol/L TCDD作用最明显(P<0.01),但TCDD对子宫内膜细胞TNF-αmRNA表达均无明显影响(P>0.05)。结论:二噁英可能通过影响子宫内膜细胞TNF-α蛋白水平的表达而参与EMs的发病过程,其主要机制可能不是通过调节其转录途径。     

β-连环素对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:探讨信号分子β连环素(β-catenin)在多个卵巢癌耐药细胞系中的表达及其对顺铂耐药性的影响。方法:首先在2个卵巢癌耐药细胞系(C13K,SKOV-3),2个卵巢癌敏感细胞系(OV2008,A2780),A2780顺铂敏感株、A2780-cis顺铂耐药株,COC10顺铂敏感株、COC1-cis顺铂耐药株中检测β-catenin蛋白的水平。通过小干扰RNA(si RNA)介导的RNA干扰技术靶向沉默细胞中β-catenin的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)验证β-catenin基因沉默效果。台盼蓝染色方法分析β-catenin基因沉默对细胞化疗药物顺铂敏感性的影响,流式细胞术检测顺铂处理后β-catenin基因沉默细胞的凋亡率。Western blotting筛选多个凋亡相关信号分子的改变。结果:β-catenin在2个卵巢癌耐药细胞系C13K,SKOV-3中蛋白水平较敏感细胞系明显上调。与亲本A2780和COC10细胞相比,在耐药株A2780-cis和COC1-cis中表达水平也明显增高。β-catenin si RNA能显著抑制细胞中β-catenin蛋白的水平。β-catenin基因沉默后,卵巢癌耐药细胞C13K,SKOV-3对顺铂敏感性显著增高;流式细胞术进一步分析发现β-catenin基因沉默可以促进顺铂介导的卵巢癌耐药细胞的细胞凋亡。Western blotting发现β-catenin基因沉默后,顺铂处理可以显著上调促凋亡分子p53和caspase-3蛋白水平。结论:β-catenin在卵巢癌耐药细胞系表达明显增高,β-catenin沉默可以促进卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性,并同时促进了顺铂介导的细胞凋亡。     

小鼠卵巢玻璃化冻融过程中重组人卵泡刺激素干预对血管内皮生长因子(VEGF)及整合素αvβ3表达的影响

目的:观察重组人卵泡刺激素(r FSH)对小鼠卵巢血管内皮生长因子(VEGF)以及整合素αvβ3表达的影响。方法:将4周龄C57BL/6J小鼠卵巢随机分为新鲜对照组(FCG)、玻璃化冻存对照组(VCG)、300 IU/L r FSH干预玻璃化冻存组(r FSH-VG)。通过对冻融卵巢内各级卵泡计数、免疫组织化学观察VEGF和整合素αvβ3在卵巢不同细胞中的定位,Western blotting检测VEGF、整合素αv和整合素β3蛋白表达量。结果:各级卵泡计数、VEGF及整合素β3的蛋白表达均为r FSHVG组优于VCG组(P0.05),整合素αv的表达组间均无统计学差异(P0.05)。结论:玻璃化冻融过程中添加r FSH可以上调VEGF及整合素β3蛋白的表达。     

GBP1基因沉默对宫颈癌CaSki细胞增殖和迁移的影响

目的:观察人类鸟苷酸结合蛋白1(GBP1)基因沉默对宫颈癌CaSki细胞增殖和迁移的影响。方法:细胞免疫荧光法检测CaSki细胞中GBP1表达。人工合成针对GBP1基因的小干扰RNA(GBP1-siRNA),体外瞬时转染CaSki细胞。Western blot法检测转染后GBP1蛋白水平变化,CCK-8法检测细胞增殖变化,Transwell小室法检测细胞迁移变化。结果:GBP1主要定位于CaSki细胞胞浆。与对照组比较,GBP1-siRNA转染后细胞中GBP1蛋白水平明显下降(P0.01),细胞增殖能力增高(P0.01),平均细胞穿膜数增高(P0.001)。结论:GBP1基因沉默能促进宫颈癌CaSki细胞的增殖和迁移,GBP1基因的存在可能为宫颈癌的发生发展提供了一道防线,这将为宫颈癌的治疗提供新的思路。     

细胞因子与胎儿宫内发育受限胎盘凋亡相关性研究

目的探讨胎儿宫内生长受限(FGR)中细胞因子对胎盘细胞凋亡的调节。方法 20例FGR组和25例足月正常体重儿(对照组),采用放射免疫分析法测定脐血中表皮生长因子(EGF),肿瘤坏死因子a(TNF—α)浓度。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测胎盘细胞凋亡指数(AI)。结果与对照组比较,FGR组脐血EGF浓度明显降低(P<0.01),TNF—α明显升高(P<0.05),胎盘AI明显升高(P<0.01)。FGR组中脐血EGF浓度与胎盘细胞AI呈负相关(P<0.05),TNF—α与AI呈正相关(P<0.05)。在正常对照组中EGF、TNF—α与AI无相关性(P>0.05)。结论FGR脐血中EGF水平降低,TNF—a升高,可能引起胎盘凋亡细胞增加,抑制胎儿生长。     

RNA干扰抑制EZH2基因表达对子宫内膜癌细胞上皮-间质转化的影响

目的:利用RNA干扰技术靶向沉默EZH2基因,检测其对子宫内膜癌细胞增殖、迁移能力及上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:实时荧光定量PCR、Western blot检测EZH2在子宫内膜细胞ESC及子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2中的表达差异。利用化学技术合成小分子siRNA转染子宫内膜癌细胞,靶向抑制EZH2基因表达。CCK-8、Transwell小室检测干扰前后子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2增殖、迁移能力变化。Western blot检测干扰前后子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2中EMT相关蛋白E-cadherin、α-catenin、N-cadherin和Vimentin的表达变化。结果:(1)EZH2在子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2中的表达明显高于子宫内膜细胞ESC(P0.01)。(2)RNA干扰抑制EZH2基因表达后,ECC-1、RL95-2细胞增殖、迁移能力降低(P0.01)。(3)RNA干扰抑制EZH2基因表达后,ECC-1、RL95-2细胞中上皮标志物E-cadherin和α-catenin的蛋白表达水平上调(P0.05),间质标志物N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平下调(P0.01)。结论:EZH2在子宫内膜癌细胞中高表达,siRNA靶向沉默EZH2基因可抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和上皮-间质转化。     

Effects of ERβ Knockout on the Expression of eNOS-NO Pathway in Mouse Corpus Cavernosum Penis

目的:探讨雌激素受体β(ERβ)基因敲除对小鼠阴茎海绵体eNOS-NO通路基因表达的影响.方法:选取ERβ基因敲除(ERβKO)雄性小鼠和相应野生型雄性小鼠各12只,随机分为4组:正常对照组(A组)、ERβKO组(B组)、野生型+肿瘤坏死因子-α(TNF-α)处理组(C组)和 ERβKO+TNF-α处理组(D组).C组和D组每日给予TNF-α6μg/kg腹腔注射,A组及B组则以等量生理盐水替代,连续14d.采用RT-PCR技术检测小鼠阴茎组织通路相关分子:eNOS、小窝蛋白-1(caveolin-1)、钙调蛋白(Cam)mRNA表达情况;Western blotting检测小鼠阴茎组织eNOS-NO通路相关分子蛋白表达水平的变化情况.结果:RT-PCR结果与Western blotting 结果相符:与A组相比,B组eNOS、Cam表达减少,小窝蛋白-1表达上调(P＜0.05); TNF-α给药后,与C组比较,D组的eNOS、Cam表达减少,小窝蛋白-1表达上调(P＜0.05).结论:ERβ基因敲除后,尤其在内皮损伤因素TNF-α作用下,eNOS-NO通路表达下调,提示ERβ对阴茎海绵窦内皮具有保护效应.     

Girdin蛋白在小鼠受精卵微丝聚集调控作用的初步研究

目的:探讨Girdin蛋白在调控小鼠受精卵早期发育微丝聚集中的作用。方法:采用免疫荧光染色观察Girdin蛋白和F-actin在小鼠受精卵中的共定位情况。激光共聚焦显微镜观察Girdin表达敲低后小鼠受精卵分裂形态及分裂率。结果:在小鼠受精卵中存在Girdin蛋白并且Girdin蛋白与F-actin存在共定位。敲低Girdin蛋白的表达,小鼠受精卵出现不规则分裂,10μmol/L Girdin si RNA处理组小鼠受精卵有28.93%到达2-细胞期,而注射20μmol/L Girdin si RNA组小鼠受精卵只有15.1%到达2-细胞期。并且Girdin表达敲低的受精卵微丝不能正确聚集。结论:Girdin蛋白在调控小鼠受精卵早期分裂微丝聚集中发挥作用。     

黄体生成素受体及类固醇激素合成急性调节蛋白在大鼠多囊卵巢综合征模型中的表达

目的:探讨黄体生成素受体(LHR)及类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)在大鼠多囊卵巢综合征(PCOS)模型中的表达及作用。方法:将50只21日龄SD大鼠随机分为模型组(PCOS组,n=35)和对照组(NC组,n=15)。通过注射脱氢表雄酮(DHEA)建立PCOS大鼠模型,放射免疫法和酶联免疫法分别检测血清孕酮(P)和雌二醇(E_2)水平及睾酮(T)水平;免疫组织化学法对LHR及StAR进行细胞定位分析,RT-PCR和Western blotting分别检测LHR及StAR mRNA和蛋白表达变化。结果:与NC组相比,血清E_2和T水平显著升高,P水平无显著变化;LHR和StAR mRNA和蛋白表达水平均显著升高。结论:PCOS高雄激素血症可能与LHR和StAR表达调控有关;两者与E_2水平升高之间的关系仍有待阐明。     

蛋白激酶B(AKT)抑制剂对小鼠1-细胞期胚胎分裂的影响

目的:研究蛋白激酶B(AKT)在小鼠1-细胞期受精卵中的作用。方法:激酶活性分析检测2种AKT的抑制剂在小鼠1-细胞期胚胎中对MPF活性的调节;G2/M期的细胞计数检测AKT抑制剂对小鼠1-细胞期胚胎细胞分裂的影响;Western blotting检测AKT抑制剂对小鼠1-细胞期胚胎中pCDC2Tyr15的去磷酸化状态的改变。结果:AKT抑制剂抑制了MPF活性、G2/M期的转换,pCDC2Tyr15的去磷酸化状态。结论:AKT存在于小鼠1-细胞期胚胎中并通过调节MPF活性和pCDC2Tyr15的去磷酸化状态调节细胞分裂的进程。     

人子宫内膜组织中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因和蛋白的表达

目的:探讨人子宫内膜组织中缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)的表达。方法:30例人子宫内膜组织石蜡标本,分为增生早期组(n=7),增生中-晚期组(n=8),分泌早期组(n=6)和分泌中-晚期组(n=9),应用免疫组织化学方法检测子宫内膜HIF-1α蛋白的表达。15例子宫内膜组织,分为增生期组(n=7)和分泌期组(n=8),采用逆转录聚合酶链反应法和Western blot-ting法检测HIF-1α基因和蛋白的表达及其变化。结果:子宫内膜上皮(包括腺上皮与腔上皮)细胞和间质细胞的胞质可见HIF-1α蛋白表达。在月经周期中,增生中-晚期组HIF-1α蛋白表达水平最高,分泌中-晚期组的表达水平最低(P<0.05);但增生早期组与增生中-晚期组的比较、分泌早期组与分泌中-晚期组比较,HIF-1α蛋白表达水平无显著性差异(P>0.05)。增生期上皮组织中HIF-1αmRNA和蛋白的表达显著高于分泌期(P<0.01;P<0.05)。结论:人子宫内膜HIF-1αmRNA和蛋白在增生期的表达较高,其表达水平升高可能与子宫内膜的修复再生有关。     

低氧环境对人上皮性卵巢癌细胞株上皮间质转化及侵袭能力的影响及机制探讨

目的:探讨低氧环境对人卵巢癌细胞上皮间质转化(EMT)和侵袭能力的影响及可能机制。方法:培养人卵巢癌细胞株SKOV-3、3AO,将每株细胞分为对照组、Co Cl2(模拟低氧环境)组、VPL(钙离子拮抗剂)组和VPL+Co Cl2组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测Co Cl2对SKOV-3、3AO细胞生长情况的影响;倒置相差显微镜下观察低氧后细胞形态的改变;采用Western blot法检测SKOV-3、3AO细胞中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、转录因子Twist、上皮型钙黏蛋白(E-cad)及神经型钙黏蛋白(N-cad)表达的变化;体外侵袭实验穿膜小室(Transwell小室)检测细胞的侵袭能力。结果:Co Cl2作用后,两种细胞的存活率均较对照组明显降低(P0.05)。低氧环境下,部分细胞伸出伪足,呈多角形,细胞排列松散、紊乱。Co Cl2能体外模拟细胞低氧环境,诱导HIF-1α蛋白高表达。SKOV-3、3AO细胞中,Co C12组中HIF-1α、Twist、N-cad蛋白表达明显高于对照组、Co C12+VPL组(P0.01,P0.05);E-cad蛋白表达明显低于对照组、Co C12+VPL组(P0.01,P0.05);VPL组与对照组相比,各蛋白表达的变化无明显差异(P0.05)。Co C12组两种细胞的穿膜数均显著多于对照组、Co C12+VPL组(P0.01,P0.05)。结论:钙信号途径参与了低氧环境下HIF-1α调节卵巢癌SKOV-3、3AO细胞中Twist的表达,从而诱导这两种细胞EMT的发生并增强其侵袭能力。     

聚酰胺-胺介导耐药基因ABCG2沉默策略治疗宫颈癌侧群细胞

目的:检测纳米分子聚酰胺-胺(PAMAM)介导耐药基因-ATP结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)沉默对宫颈癌侧群细胞的治疗效果。方法:从宫颈癌细胞中采用流式细胞术分离宫颈癌侧群细胞,检测ABCG2基因的表达,噻唑蓝(MTT)法检测多柔比星对细胞的抑制率;实验分为si RNA组、无义组和对照组,PAMAM介导ABCG2基因沉默后,蛋白质印迹法(western blot)检测ABCG2的表达,MTT法检测多柔比星对细胞敏感性的恢复情况;建立宫颈癌侧群细胞荷瘤鼠模型,给予多柔比星药物治疗,测量肿瘤体积。结果:宫颈癌侧群细胞ABCG2的蛋白水平高于非侧群细胞(P0.05);MTT耐药实验显示,多柔比星对非侧群细胞的抑制率高于侧群细胞(P0.01)。si RNA组在ABCG2表达沉默后,抑制率恢复到(69.4±11.3)%,与对照组及无义组比较差异均有统计学意义(P0.01);动物实验结果显示,si RNA组肿瘤体积小于对照组和无义组(P0.05)。结论:以PAMAM为介质可实现宫颈癌侧群细胞团中ABCG2基因表达沉默,恢复宫颈癌侧群细胞对化疗药物的治疗敏感性。