白细胞介素－2的基因克隆及其在啤酒酵母细胞中的表达

用ＰＣＲ方法从白细胞介素素－２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ全序列中扩增成熟肽基因片段，与酵母中间载体ｐＳＫ４３ＳＢ融合后，重组于酵母游离型表达载体ＹＥｐＨｃ８，获得了高效表达，并对其糖基化进行了研究。     

一种通用型重组2型腺伴随病毒载体的构建及外源基因表…

以野生型２型人腺伴随病毒（ＡＡＶ－２）基因组载体ｐＳＳＶ９－ｉｎｔ＾－为基础，构建了一种携带和表达真核基因的基础ＡＡＶ载体ｐＳＳＶ９／ＭｕｌＶ－ｎｅｏｓｖ，表达了ｎｅｏ基因，并采用该载体组建了携带人白细胞介素－２ｃＤＮＡ的重组ＡＡＶ载体ｐＳＳＶ９／ＭｕｌＶ－ｎｅｏｓｖ－ＩＬ２，转染Ａ５４９细胞后表达了人白细胞介素－２基因。为应用腺伴随病毒作基国治疗研究提供了实验基础。     

人脑源性神经营养因子cDNA克隆及在酵母中的表达

目的：克隆和表达人脑源性神经营养因子（ｈＢＤＮＦ）。方法和结果：从原代培养人雪旺细胞中提取总ＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ法获取了编码带前导肽的和成熟的ｈＢＤＮＦ２个ｃＤＮＡ片段，经ＤＮＡ测序表明其顺序与文献报道一致。将这２个ｃＤＮＡ片段分别插入到大肠－酵母穿梭质粒ｐＶＴ１０２Ｕ／α上。用酵母整体细胞法将重组质粒转化酵母宿主细胞，经筛选后，获得分泌性表达。表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定，大小都在１５０     

人Cu,Zn—SOD在酵母系统中的表达

甲醇酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）是一种理想的真核蛋白高水平表达系统。将人Ｃｕ,Ｚｎ－ＳＯＤ基因克隆到酵母整合型质粒载体ｐＰＩＣ３．５Ｋ,经转化ｈｉｓ４缺陷型酵母ＧＳ１１５,用ＭＤ培养基及ＰＣＲ方法筛选阳性转化子,并用含Ｇ４１８的ＹＰＤ培养基筛选多拷贝转化子,经甲醇诱导表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹杂交结果证实了表达产物为重组的人Ｃｕ,Ｚｎ－ＳＯＤ,经计算机扫描分析,表达量占酵母可溶性     

人类bcl—2蛋白在CHOdhfr^—细胞中的表达

目的：建立表达人类ｂｃｌ－２蛋白的哺乳类细胞模型，为探讨ｂｃｌ－２的作用机制及其与其它基因间的关系奠定基础。方法：通过将９１０ｂｐ的含有完整开放阅读框的人类ｂｃｌ－２ ｃＤＮＡ以正向克隆逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ的ＥｃｏＲＩ位点而构建重组真核表达载体ｐＬＸＳＮ／ｓ－ｂｃｌ－２。利用电穿孔技术将ｐＬＸＳＮ／ｓ－ｂｃｌ２转染于ＣＨＯｄｈｆｒ＾－细胞，筛选＋出Ｇ４１８抗性克隆，经免疫印迹检测人类ｂｃｌ－２     

大鼠肝氨甲酰磷酸合成酶I基因在非肝细胞中的表达

氨甲酰磷酸合成酶Ｉ（ＣＰＳＩ）ｃＤＮＡ全序列基因片段与ｐＳＶ２载体的重组及重组质粒ｐＳＶ２－ＣＰＳｃｆ在７４０２人肝癌细胞、ＣＨＯ细胞和ＮＩＨ／３Ｔ３细胞中的表达结果表明，ｐＳＶ２－ＣＰＳｃｆ转染的以上３株细胞均可稳定、高效地表达ＣＰＳＩ。通过核Ｒｕｎ－ｏｆｆ转录活性的检测和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实，表达的ＣＰＳＩ转录产物结构完整。提示ＣＰＳＩ肝组织特异表达主要与转录改变有关。     

sPLA2cDNA表达载体的选择和亚克隆

目的：选择适当的载体，启动Ｃａ＾２＋依赖分泌型磷脂酶Ａ２（ｓＰＬＡ２）ｃＤＮＡ的表达，为进一步研究各种因素对该酶活性的影响奠定基础。方法：首先从ｓＰＬＡ２－ｐＧＥＭ７重组体（这一重组体不能在转染的真核细胞中表达）获得人ｓＰＬＡ２ｃＤＮＡ，克隆该片断进入中间载体ＢＳＳＫ（使ｓＰＬＡ２ｃＤＮＡ两端出现ＸｂａＩ、Ｈｉｎｄ３酶切位点），选择ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓＰＬＡ２－ＢＳＳＫ重组体进行扩增，双酶消化上     

重组人β—防御素基因在COS—7细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达ｈＢＤ－２的哺乳类动物工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＣ－２以进行ＣＯＳ－７细胞转染表达实验。将本室克隆获得的ｈＢＤ－２全长ｃＤＮＡ片段插入带有报告基因的真核表达质粒ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ构建出ｈＢＤ－２的重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２,并经ＤＮＡ测序证明ｈＢＤ－２ｃＤＮＡ片段的插入方向和其全长ｃＤＮＡ的碱基组成顺序均准确无误。通过脂质体转染法将ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２导入ＣＯＳ－７细胞。ＲＴ－ＰＣＲ法和免疫印迹法分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白质水平检测到被转染的ＣＯＳ－７细胞系能有效表达ｈＢＤ－２。     

人白细胞介素2基因转移表达及抗乙型肝炎病毒和诱导LAK细胞活性的研究

为了探讨白细胞介素（ＩＬ）－２转基因表达抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用，应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＳｖ（Ｘ）－包装细胞系ＰＡ３１７基因转移系统，研究了人ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移和表达，以及抗ＨＢＶ和诱导淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）的作用。所构建的人ＩＬ－２重组表达载体ｐＺＩＰｈｕＩＬ－２，以ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀技术转染ＰＡ３１７细胞，筛选到Ｇ４１８抗性克隆，分泌假病毒颗粒达１０６ＣＦＵ／ｍｌ。以假病毒颗粒感染２．２．１５细胞系及正常人外周血单个核细胞，分泌ＩＬ－２水平可达６ＩＵ／ｍｌ，明显抑制２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ的分泌表达，与１００ＩＵ／ｍｌ重组的ＩＬ－２一样可诱导出相似的ＬＡＫ细胞活性。而不含ＩＬ－２ｃＤＮＡ的ｐＺＩＰＳＶ（Ｘ）的假病毒颗粒则无此作用。提示逆转录病毒载体。包装细胞系可以成功地实现人ＩＬ－２ｃＤＮＡ的转移和低水平的分泌和表达，并可明显抑制２．２．１５细胞分泌ＨＢｓＡｇ及诱导ＬＡＫ细胞活性。     

肺表面活性物质结合蛋白B和C在大肠杆菌中的表达

用基因工程方法表达出肺表面活性物质结合蛋白（ＳＰ）－Ｂ和ＳＰ－Ｃ，与人工合成磷脂制备成有效的外源性肺表面活性物质，以便今后用于治疗呼吸窘迫综合征。方法用人ＳＰ－Ｂ、ＳＰ－Ｃ基因的成熟多肽构建原核细胞表达载体ｐＩＮ－Ⅲ－ｏｍｐＡ２－Ｂ－Ｃ，在大肠杆菌ＢＬ２１中，通过异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达。表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，并用膜天平检测表达产物的生物活性。结果ＳＰ－Ｂ和ＳＰ－Ｃ融合蛋白可以在大肠杆菌ＢＬ２１中表达，分子量约为２００００，但表达量较低。在大肠杆菌中，表达产物能使表面张力降低，最小表面张力可以达到０．００４Ｎ／ｍ２，且有较大滞后环面积。结论为今后通过基因工程方法获得ＳＰ，从而制备理想的外源性肺表面活性物质制剂创造了条件。     

T载体克隆乙肝病毒preS2＋S基因的实验研究

将商品化真核表达载体ｐｃＤＮＡ３改造成Ｔ载体ｐｃＤＮＡ３－Ｔ，燕运用ｐｃＤＮＡ３－Ｔ直接克隆也由ＰＣＲ扩增的ａｄｗ２亚型乙肝病毒ｐｒｅＳ２与Ｓ基因；结果：ｐｃＤＮ３－Ｔ与ＰＣＲ产物的重组率高达７０％。提示：该方法具有简便，省时等特点。     

牛碱性成纤维细胞生长因子在酵母中表达产物的纯化与鉴定

在以往工作基础上，将已经鉴定的牛碱性成纤维细胞生长因子（ｂｂＦＧＦ）基因克隆至酵母分泌型表达载体ｐＶＴ１０２Ｕ／α，并转化宿主菌Ｓ－７８。表达产物经一系列纯化后，得到ＳＯＳ－ＰＡＧＥ银染鉴定纯度＞９０％的最终产物，免疫学和细胞学检测结果表明，重组ｂｂＦＧＦ具有与天然ｂｂＦＧＦ相同的生物活性。     

水蛭素变异体I基因的合成及其在酵母中表达的初步研究

目的将水蛭素基因转入酵母系统中进行表达,以评价人工合成基因在真核系统中表达的可行性和探讨影响表达水平的因素。方法根据水蛭素变异体Ｉ（ＨＶ１）的氨基酸序列,选择酿酒酵母偏爱的密码子,设计了ＨＶ１基因。将ＨＶ１基因分１２个寡核苷酸片段,进行人工合成,并连接成一个完整的水蛭素基因。经ＰＣＲ扩增后,将扩增产物连到克隆载体ｐＢＳ－ＳＫ（＋）上并进行ＤＮＡ序列分析。用正确的ＨＶ１基因与酵母α因子信号肽基因相连,并一起插入酵母表达载体ｐＹＣ－ＤＥ,经鉴定表明,获得正确的重组表达质粒。将后者转入酿酒酵母ＢＪ１９９０细胞进行初步表达。结果在筛选出的阳性克隆的培养上清中,检测出的水蛭素活性为３０抗凝血酶单位（ＡＴＵ）／ｍｌ。所表达的量高于ＨＶ２在酵母中和ＨＶ１在原核系统的表达水平。Ｎ末端氨基酸序列与天然水蛭素一致。结论采用人工合成的ＨＶ１基因和较强的启动子在酵母中进行表达是一较好途径。     

人白细胞介素2基因转移表达及抗乙型肝炎病毒和诱导LAK细胞活性…

为了探讨白细胞介素－２转基因表达抗乙型肝炎病毒的作用，应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＳＶ（Ｘ）－包装细胞系ＰＡ３１７基因转移系统，研究了ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移和表达，以及抗ＨＢＶ和诱导淋因子激活的杀伤细胞的作用。     

人促红细胞生成素在大肠杆菌中融合高表达：稀有密码子对外源蛋白翻译速率的影响

本实验分别用两种融合表达载体（ｐＧＥＸ－２Ｔ及ｐＤＳ－６Ｈ）在大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ中表达人促红细胞生成素（ｈ－ＥＰＯ）。结果发现，虽然ｈ－ＥＰＯ基因中大肠杆菌使用频率为０％或１％的密码子占密码子总量的１４．３％，但实验中却取得了较高的蛋白表达量。ｐＧＥＸ－２Ｔ和ｐＤＳ－６Ｈ中表达的融合蛋白（分子量：４４４００和２３８００）分别占细菌总蛋白的２９．７％和１７．５％。从而提示，一个基因中的密码子使用频率与翻译延长速率之间可能不是一种简单的对应关系。表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ中５＇融合基因长度达１３００ｂｐ，而ｐＤＳ－６Ｈ中仅为３６ｂｐ，而ｐＤＳ－６Ｈ但两者表达水平却无显著差异，因此作为翻译起始限制因素的翻译起始区的ＡＴＧ下游顺序仅需长约３６个核苷酸。     

大鼠肝氨甲酰酸合成酶IcDNA片段在肝癌及非肝细胞中表达体…

观察０．５８７和０．７１２ｋｂＣＰＳＩｃＤＮＡ片段分别与ＰＳＶ２载体的重组质粒ｐＳＶ２－ＣＰＳ５０５和ｐＳＶ２－ＣＰＳ５０７在人肝癌和非肝细胞中的表达情况。结果证实，两种重组的表达质粒转染的７４０２人癌细胞和ＮＩＨ／３Ｔ３细胞能有效地表达ＣＰＳＩ，ＣＰＳＩ基因的非翻译区顺序与其高度组织特异性无关。这些体系的建立为体外生产ＣＰＳＩ抗原和天然ＣＰＳＩ蛋白提供了细胞模型和实验依据，对深入了解ＣＰＳＩ的表     

类胰岛素生长因子-Ⅰ的克隆、表达、分离纯化与活性检测

把类胰岛素生长因子-Ⅰ（IGF－Ⅰ）cDNA重组于酵母游离体型表达载体YEpHC8，转化酵母后获得了IGF－Ⅰ的表达，并经Bio－Rex70和Bio－GelP10分离纯化后进行了重组蛋白的活性检测。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的表达载体构建及在酵母中的表达

目的：为探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心（core）蛋白的功能，在真核生物酵母细胞中表达HCV核心蛋白基因。方法：用多聚酶链反应（PCR）的方法在HCV全长质粒pBRTM／HCV为膜板扩增HCV核心蛋白基因，克隆到pGEM－T载体中，双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HCV核心蛋白基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示了HCV核心蛋白在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在，分子量22000ku左右。结论：HCV核心蛋白在酵母中表达成功。     

人CTLA-4胞外区cDNA毕赤酵母表达载体的构建及高拷贝稳定整合菌株的筛选

目的 构建人CTLA－4胞外区蛋白毕赤酵母分泌型表达载体，获得高拷贝稳定整合菌株，为大量获得人CTLA－4胞外区蛋白，进行功能研究及其临床应用奠定基础。方法 从活化人外周血淋巴细胞总RNA中，扩增人CTLA－4基因胞外区cDNA片段，将目的基因插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游，再插入高拷贝载体pPIC9K，得到pPIC9K-CTLA4,SaL I线性化后电转GS115；G418梯度筛选转化菌。PCR，Suthern blotting鉴定目的基因整合及拷贝数。结果 成功构建了人CTLA－4胞外区cDNA毕赤酵母表达载体，获得了高拷贝稳定整合菌株。结论 为表达人CTLA－4胞外区蛋白及其功能研究和临床应用奠定了基础。     

重组B7-1/B7-2逆转录病毒载体的构建及其在小鼠肝癌基因治疗中的应用

目的构建表达Ｂ７－１／Ｂ７－２的重组逆转录病毒载体，并观察Ｂ７－１／Ｂ７－２的表达对体内外抗小鼠肝癌免疫反应的影响。方法粘端定向克隆构建重组逆转录病毒载体ＬＸＳＮ－ｍＢ７－１和ＬＸＳＮ－ｍＢ７－２，依次转导包装细胞系ＰＥ５０１和ＰＡ３１７，并用重组病毒上清感染小鼠肝癌细胞系Ｈｅｐａｌ－６，流式细胞术检测Ｂ７－１／Ｂ７－２的表达，并用Ｂ７－１／Ｂ７－２表达阳性的Ｈｅｐａｌ－６在体内外诱导抗肿瘤免疫反应。结果１．表达Ｂ７－１／Ｂ７－２阳性的Ｈｅｐａｌ－６致瘤性明显降低；２．单独Ｂ７－１／Ｂ７－２基因转染仅能诱导部分细胞毒性和部分保护性免疫反应；３．Ｂ７－１／Ｂ７－２基因转染与细胞因子处理联合应用则能诱导强烈的细胞毒性和完全的抗Ｈｅｐａｌ－６保护性免疫反应。结论Ｂ７－１／Ｂ７－２共刺激分子在小鼠肝癌的表达是激活抗肿瘤免疫所必需的但不是充分的条件，而Ｂ７基因转染联合ＩＦＮ－γ等细胞因子处理能诱导彻底的抗肿瘤免疫反应