人分泌型白细胞介素2受体α链基因的克隆及其在真核细胞中的表达

删除人白细胞介素－２受体α链ｃＤＮＡ中编码胞质内１３个氨基酸及跨膜区１９个氨基酸残基的ＤＮＡ片段后，接上人工合成的终止寡核苷酸片段，改建后的ｃＤＮＡ与真核表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ重组成质粒ｐＣＭＶ／ｒｓＩＬ２Ｒ。用电打孔及磷酸钙法将此质粒转染ＣＨＯ细胞，经Ｇ４１８筛出表达Ｎｅｏ基因的克隆２０株，通过ｍＲＮＡ狭缝杂交及ＥＬＩＳＡ检测，有５株能稳定表达分泌型α链ｍＲＮＡ及蛋白，其中４株细胞培养上清中的ＩＬ２Ｒα链的含量达１４００Ｕ／ｍｌ以上。     

重组人β—防御素基因在COS—7细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达ｈＢＤ－２的哺乳类动物工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＣ－２以进行ＣＯＳ－７细胞转染表达实验。将本室克隆获得的ｈＢＤ－２全长ｃＤＮＡ片段插入带有报告基因的真核表达质粒ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ构建出ｈＢＤ－２的重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２,并经ＤＮＡ测序证明ｈＢＤ－２ｃＤＮＡ片段的插入方向和其全长ｃＤＮＡ的碱基组成顺序均准确无误。通过脂质体转染法将ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２导入ＣＯＳ－７细胞。ＲＴ－ＰＣＲ法和免疫印迹法分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白质水平检测到被转染的ＣＯＳ－７细胞系能有效表达ｈＢＤ－２。     

Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂cDNA表达质粒的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

建立Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂（ＰＡⅠ－１）ｃＤＮＡ哺乳动物细胞表达体系。用人工合成的６个寡核苷酸连接成编码ＰＡⅠ－１Ｎ－端１０个氨基酸和２３个氨基酸的信号肽顺序；将构成的完整ＰＡⅠ－１ｃＤＮＡ插入真核表达质粒ｐＳＶ２ｄｈｆｒ中，获得真核表达质粒ｐＺＹＳ－１；将ｐＭＡ２１２中的ｈＭＴ－ⅡＡ的起动子再插入ｐＺＹＳ－１，使ＰＡⅠ－１ｃＤＮＡ受ＳＶ４０和ｈＭＴ－ⅡＡ双启动子控制，得ｐＺＹＳ－２。２个表达质粒分别在ＣＯＳ－７细胞中进行表达。结果：获得两个真核表达质粒，在ＣＯＳ－７细胞中得到表达，在培养液中的ＰＡⅠ－１活性和抗原含量分别为２３４．７ＩＵ／ｍｌ和３０μｇ／Ｌ。结论：ｐＺＹＳ－１和ｐＺＹＳ－２两株ＰＡⅠ－１ｃＤＮＡ真核表达质粒在ＣＯＳ－７细胞中能有效表达和分泌。     

α肿瘤坏死因子（TNFα）基因的分离鉴定及在人肝癌细胞中的表达

应用不连续密度梯度法分离获得人肝癌浸润性单个核细胞（ＴＩＭ），ＲＮＡ斑点杂交提示ＴＩＭ中有明显的ＴＮＦαｍＲＮＡ转录。经ＲＴ－ＰＣＲ扩增反应分离得到一特异的７００ｂｐ左右的ＤＮＡ片段，ＤＮＡ序列分析证实这一ＤＮＡ片段中包含编码人ＴＮＦα成熟肽所需的的全部ｃＤＮＡ序列。将这一人ＴＮＦαｃＤＮＡ克隆到真核细胞表达质粒ｐＳＶＫ３，获得真核细胞表达重组ｐＳＶＫ３－ｔｎｆ，用磷酸钙沉淀法将ｐＳＶＫ３－ｔｎｆ导入人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１中的细胞培养上清中可检测到ＴＮＦα的一过性表达。结果提示ＴＩＭ可成为获取ＴＮＦα基因的来源，获得的ｐＳＶＫ３－ｔｎｆ重组质粒为肝癌的基因治疗奠定了基础。     

α肿瘤坏死因子（TNFα）基因的分离鉴定及在人肝癌细胞中…

应用不连续密度梯度法分离获得人肝癌浸润性单个核细胞（ＴＩＭ），ＲＮＡ斑点杂交提示ＴＩＭ中有明显的ＴＮＦαｍＲＮＡ转录。经ＲＴ－ＰＣＲ扩增反应分离得到一特异的７００ｂｐ左右的ＤＮＡ片段，ＤＮＡ序列分析证实这一ＤＮＡ片段中包含编码人ＴＮＦα成熟肽所需的全部ｃＤＮＡ序列。将这一人ＴＮＦαｃＤＮＡ克隆到真核细胞表达质粒ｐＳＶＫ３，获得真核细胞表达重组质粒ｐＳＶＫ３－ｔｎｆ，用磷酸钙沉淀法将ｐＳＶＫ３－ｔｎ     

nm23H1正反义表达载体的构建

目的;构建ｎｍ２３Ｈ１正反义表达载体ｐｃ３ＡＮ和ｐｃ３ＡＭ。方法：将ｎｍ２３Ｈ１基因正,反向插入质粒ｐｃＤＮＡ３和ｐＲＣ／ＣＭＶ,并转染肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１。结果：转染正义表达载体后ｎｍ２３Ｈ１ｍＲＮＡ和蛋白表达水平增加,转染反义表达载体后ｎｍ２３Ｈ１ｍＲＮＡ和蛋白表达水平降低。结论：构建的载体能在肝癌细胞内有效表达。     

反义凝血酶受体基因表达对猪主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的寻找抑制血管损伤后血管内皮增生的有效方法以预防介入治疗后再狭窄的发生。方法利用重组ＤＮＡ技术构建了含有部分反义凝血酶受体（ＡＴＲ）ｃＤＮＡ片段的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ＡＴＲ,应用超大球囊损伤及高胆固醇饲喂法建立了小型猪主动脉内皮损伤模型并培养了其主动脉平滑肌细胞（ＡＳＭＣ）,通过３Ｈ－ＴｄＲ掺入及Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ观察ＡＴＲ的表达对猪ＡＳＭＣ增殖及生长因子基因表达的影响。结果ＡＴＲ基因的稳定表达：（１）能抑制ＡＳＭＣ的ＤＮＡ合成（正常猪ＡＳＭＣＤＮＡ合成下降４１．８％,而内皮损伤血管下降５０３％）;（２）能从ｍＲＮＡ及蛋白水平抑制ＡＳＭＣ凝血酶受体基因的表达;（３）能使猪ＡＳＭＣ中ＰＤＧＦＡ链及ｂＦＧＦ的表达明显降低。结论ＡＴＲ可有效地抑制猪ＡＳＭＣ的增殖与凝血酶受体所介导的细胞内信号传导有关。     

甲肝病毒减毒活疫苗（H2株）的cDNA克隆及序列分析

本文通过ｍＲＮＡ提取，逆转灵（ＲＴ）－聚合酶链反应（ＰＣＲ），获得甲肝病毒减毒活疫苗株（Ｈ２减毒株）的ｃＤＮＡ片段，再经分子克隆，从而得到贯穿甲肝病毒（ＨＡＶ）全基因组的１０个相互重叠基因片段的ｃＤＮＡ克隆。经双脱氧末端终止法进行核苷酸序列分析，得到了长度为７４７３ｂｐ的甲肝病毒减毒活疫苗株（Ｈ２减毒株）ｃＤＮＡ全序列。计算机分析表明，该株与野毒株ＨＭ１７５的核苷酸和氨基酸同源性分别为９９．４％和     

细胞因子对HCV基因疫苗诱生免疫反应的增强作用

目的 探讨细胞因子对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因疫苗诱生免疫应答强度的增强作用。方法 将包含ＨＣＶ－Ｃ蛋白的基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,构建重组质料ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,将此重组质粒单独或与包含鼠ＩＬ－２或ＩＬ－１２基因的表达质粒共免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,ＥＬＩＳＡ法检测ＨＣＶ Ｃ特异性抗体产生情况,以ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ转梁小鼠ＳＰ２／０细胞,表达ＨＣＶ Ｃ抗原为靶细胞,进行     

利用PCR技术构建GM—CSF／Fcγ2融合蛋白载体

目的：构建 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体。方法：利用 Ｐ Ｃ Ｒ技术,将人 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ基因与人免疫球蛋白 Ｉｇ Ｇ２ 的 Ｆｃ 段基因联接,构建融合基因ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２;并将此片段定向克隆到真核表达质粒ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２ 载体。结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示 Ｐ Ｃ Ｒ扩增出了 １．３ ｋｂ 的融合基因片段;限制性内切酶图谱分析,成功地完成了 Ｇ Ｍ  Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体的构建。结论：（１）经 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增技术由质粒 Ｐ Ｃ Ｄｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ和 Ｐ Ｓ Ｖ Ｖ Ｎ Ｐ Ｈ Ｖ２ 分别扩增到了所需的ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段和 Ｉｇ Ｇ２ 从绞链区到 Ｃ Ｈ３ 的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 片段。（２）利用 Ｐ Ｃ Ｒ介导,扩增出了融合基因片段ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２。（３）构建了真核细胞表达载体ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２／ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２ 。     

人B7.2cDNA的克隆及其核表达

为克隆人Ｂ７．２ｃＤＮＡ，构建Ｂ７．２真核表达质粒，并在哺乳动物细胞中表达。分离正常人淋巴结淋巴细胞，经ＬＰＳ诱导后，以ＲＴ－ＰＣＲ，克隆Ｂ７．２ｃＤＮＡ；构建真核表达质粒ｐＢＣＭＧＳＮｅｏ－Ｂ７．２，转染哺乳细胞，进行表达。结果成功克隆了Ｂ７．２ｃＤＮＡ，并经测序证实：所构建的Ｂ７．２抗原真核表达质粒可在哺乳动物细胞中高效表达。表明经ＬＰＳ诱导的人淋巴细胞可表达Ｂ７．２ｍＲＮＡ，所建立的ｐＢＣＭ     

乙型肝炎病毒DNA转染细胞的一种内参标准:真核细胞报告基因SEAP

目的 建立用真核细胞报告基因ＳＥＡＰ转染人肝癌细胞系及鸡肝癌细胞系（ＬＭＨ）的表达系统,供研究ＨＢＶ基因功能应用。方法 分别将带有分泌性碱性磷酸酶（ＳＥＡＰ）报告基因的ｐＢＣ１２／ＰＬ／ＳＥＡＰ及ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＳＥＡＰ质粒ＤＮＡ转染Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２及ＬＭＨ细胞,并用ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＳＥＡＰ质粒ＤＮＡ与Ｓ基因区变异体的克隆ＨＢＶ ＤＮＡ共转染ＨｅｐＧ２细胞。培养后收取细胞培养液,用ＥＬ     

人心肌内肌球蛋白轻链mRNA测定新方法

采用异硫氰酸胍－苯酚－氯仿一步法提取心肌内总ＲＮＡ，随机引物将所有ｍＲＮＡ逆转录成ｃＤＮＡ；用特异肌球蛋白轻链２（ＭＬＣ２）ｃＤＮＡ扩增引物增产ＭＬＣ２ｃＤＮＡ，以１８ｓｒＲＮＡ为内标，用激光光密度扫描仪扫描ＭＬＣ２及１８ｓｒＲＮＡ之扩增条带，计算出ＭＬＣ２ｍＲＮＡ的相对量。依此确定在不同心脏疾病状态下心肌内ＭＬＣ２ｍＲＮＡ的量。此方法重复性好，为直接从人心肌研究ＭＬＣ２对心肌收缩力的调节作用提供     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

人脑源性神经营养因子cDNA克隆及在酵母中的表达

目的：克隆和表达人脑源性神经营养因子（ｈＢＤＮＦ）。方法和结果：从原代培养人雪旺细胞中提取总ＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ法获取了编码带前导肽的和成熟的ｈＢＤＮＦ２个ｃＤＮＡ片段，经ＤＮＡ测序表明其顺序与文献报道一致。将这２个ｃＤＮＡ片段分别插入到大肠－酵母穿梭质粒ｐＶＴ１０２Ｕ／α上。用酵母整体细胞法将重组质粒转化酵母宿主细胞，经筛选后，获得分泌性表达。表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定，大小都在１５０     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６～４５４ｂｐ一段长５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得的ｕＰＡＲｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细胞株９５Ｄ，ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ证实转染细胞克隆有ｕＰＡＲ反义ＲＮＡ的表达。结论重组质粒ｐＵＲＡＳ能在肺癌细胞株９５Ｄ中表达尿激酶受体反义ＲＮＡ，尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ表达质粒的构建获得成功。     

显微注射法建立含荧光素酶和HCV-C基因细胞模型

目的 建立带有报告基因的ＨＣＶ５’ＮＣＲ，Ｃ区细胞模型，方法 通过亚克隆技术，重组ＨＣＶ ｃＤＮＡ片段与荧光素酶基因（１ｕｃ）融合的真核表达质粒，经显微注射导入人肝癌细胞Ｈｅｐｇ２，ｇ４１８筛选后检测Ｃ蛋白 表达和荧光素酶活性。结果 成功地将ＨＣＶ５’ ＮＣＲ和Ｃ区ｃＤＮＡ与１ｕｃ融合，并与ｐｃＤＮＡ３载体重组，构了该事例基因的真核表达质粒ｐｃＨＣＶｃｌｕｃ；染ＨｅｐＧ２细胞后获得有效表达，持续１     

小鼠造血干细胞因子基因克隆及在CHO细胞中的表达

克隆造血干细胞因子并在ＣＨＯ细胞中表达。方法：采用ＰＣＲ方法从ｐＲＣ／ＣＭＶ（含ＳＣＦｃＤＮＡ）中钓取ＳＣＦｃＤＮＡ膜外段活性区，克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３，转染入ＣＨＯ细胞；用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ｍＲＮＡ水平表达及通过协同刺激骨髓细胞集落形成来检测转染细胞上清的生物活性。     

HCV核心蛋白DNA疫苗诱导的小鼠体液免疫应答

目的：观察丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白ＤＮＡ疫苗诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠体液免疫应答的效力，为研制应用于人类的ＨＣＶ ＤＮＡ疫苗提供实验依据。方法：将全长ＨＣＶ核心蛋白基因插入真核表达质粒载体ｐｃＤＮＡ３．１，构建ＨＣＶ核心蛋白重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＨＣＶｃｏｒｅ，肌注ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，以ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清ＨＣＶ抗体。以此重组质粒转染小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞，以ＨＣＶ抗体阳性小鼠血清为捕获抗     

大鼠肝氨甲酰磷酸合成酶I基因在非肝细胞中的表达

氨甲酰磷酸合成酶Ｉ（ＣＰＳＩ）ｃＤＮＡ全序列基因片段与ｐＳＶ２载体的重组及重组质粒ｐＳＶ２－ＣＰＳｃｆ在７４０２人肝癌细胞、ＣＨＯ细胞和ＮＩＨ／３Ｔ３细胞中的表达结果表明，ｐＳＶ２－ＣＰＳｃｆ转染的以上３株细胞均可稳定、高效地表达ＣＰＳＩ。通过核Ｒｕｎ－ｏｆｆ转录活性的检测和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实，表达的ＣＰＳＩ转录产物结构完整。提示ＣＰＳＩ肝组织特异表达主要与转录改变有关。