自噬活性的降低增加人鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性

目的 研究自噬与人鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性之间的关系。方法 采用慢病毒介导的RNA干扰技术建立稳定沉默自噬相关基因ATG5的人鼻咽癌CNE-2细胞系,实验分为未转染的CNE-2细胞组(对照组)、转染NC-shRNA的CNE-2细胞组(NC组)及转染ATG5-shRNA的CNE-2细胞组(ATG5组),应用CCK-8法、流式细胞术及克隆形成实验检测细胞增殖、凋亡及放射敏感性的变化。结果 CCK-8实验结果显示,与对照组和NC组相比,各剂量点ATG5组的细胞存活率均显著降低(F=3.755、46.086、8.609、44.160,P<0.05),绘制细胞生存曲线可见下调ATG5的表达后可以增加CNE-2细胞的放射敏感性;流式细胞术结果显示,经6 Gy X射线照射后,ATG5组细胞的凋亡率较NC组及对照组明显升高(F=394.876,P<0.05);克隆形成实验结果提示沉默ATG5基因可增加鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性。结论 降低鼻咽癌CNE-2细胞的自噬活性可以增强其放射敏感性。     

雷帕霉素激活M2巨噬细胞自噬影响大肠癌放射敏感性的研究

目的 探讨雷帕霉素(RAP)激活M2巨噬细胞(type-Ⅱ macrophage)自噬对大肠癌移植瘤放射敏感性的影响。方法 经佛波酯(PMA)单独及联合人重组白介素4(IL-4)诱导人单核白血病细胞THP-1分化为M0和M2型巨噬细胞。使用RAP激活M2自噬,设置巴弗洛霉素(bafilomycin A1)下调M2已被激活的自噬作为对照。将大肠癌LoVo细胞接种于BALB/c-nu/nu裸鼠,待形成直径10 mm瘤体后,利用随机数表法,将18只裸鼠分为M2自噬未激活组、激活组和激活后下调组,LoVo细胞单独成瘤为阴性对照组,每组6只。对荷瘤鼠行2次8 Gy X射线局部照射,分析各组间移植瘤放射敏感性的变化。结果 M2巨噬细胞标志物Arg-1、CCL-22的相对表达量显著高于M0巨噬细胞(t=78.77、60.02,P＜0.05)。M2自噬未激活组瘤体质量、体积和微血管密度(MVD)[(1.93±0.05)g、(2.14±0.06) cm³、36.37±1.04]较阴性对照组[(1.35±0.05) g、(1.77±0.02) cm³、25.69±1.34]显著提高(t=20.07、14.56、10.92,P＜0.05);激活M2自噬后,瘤体重量、体积和微血管密度均显著下降[(0.89±0.03) g、(1.24±0.01) cm³、13.60±1.52](t=44.37、40.32、21.43,P＜0.05)。利用巴弗洛霉素下调M2自噬后,瘤体质量、体积和微血管密度有所回升[(1.02±0.07) g、(1.37±0.02) cm³、21.06±1.41](t=4.67、13.79、6.23,P＜0.05)。与阴性对照组相比,自噬未激活的M2能够抑制Livin和Survivin在瘤体组织中的表达(t=2.64、7.90,P＜0.05);RAP激活M2自噬后,可进一步下调上述蛋白的表达(t=5.43、9.39,P＜0.05)。利用巴弗洛霉素下调M2自噬后,Livin、Survivin表达量均有所回升(t=2.80、3.17,P＜0.05)。结论 利用RAP激活M2自噬,可抑制M2促进肿瘤微血管形成的能力,从而抑制移植瘤生长;同时,通过下调大肠癌移植瘤中抗凋亡基因Livin与Survivin的表达,诱导大肠癌移植瘤放疗后凋亡的发生,提高大肠癌的放射敏感性。     

鼻咽癌的放射敏感性预测初探

目的　探索原位缺口平移、早熟凝集染色体分析和胞质分裂阻断微核法等技术成为判断鼻咽癌放射敏感性预测指标的可能性。方法　以原位缺口平移法研究了鼻咽癌细胞株ＣＮＥ、ＣＮＥ－ ２Ｚ细胞对γ射线的放射效应;以早熟凝集染色体分析技术和胞质分裂阻断微核法研究了鼻咽癌活检组织的放射敏感性。结果　在０ ～８ Ｇｙ 之间,ＣＮＥ 及ＣＮＥ－ ２Ｚ 的脱氧三磷酸核苷（ｄＮＴＰ） 掺入率与照射剂量间有良好的剂量效应关系,来源于低分化肿瘤的ＣＮＥ－ ２Ｚ细胞株的放射敏感性高于ＣＮＥ;３２ 例鼻咽活检标本进行早熟凝集染色体分析,其早熟凝集染色体周期分布与鼻咽癌患者放疗疗效有明显关系,临床上对放疗呈高敏的患者,晚Ｇ１ 细胞比例显著升高;胞质分裂阻断微核法提示２０ 例患者照射后微核形成有显著个体差异,其中低反应者２ 例有复发倾向。结论　实验结果提示上述３ 项指标可望成为综合判断鼻咽癌放射敏感性的重要参数。     

沉默STAT1基因增强放射抗拒鼻咽癌CNE-2R细胞放射敏感性

目的 研究基因STAT1沉默对人放射抗拒鼻咽癌细胞放射敏感性的影响.方法 慢病毒介导的STAT1基因转染放射抗拒鼻咽癌细胞CNE-2R,荧光定量RT-PCR技术检测沉默效果.MTT法检测转染前后细胞增殖活性,流式细胞技术检测细胞周期及凋亡,克隆形成实验检测转染前后细胞放射敏感性变化.结果 慢病毒转染后放射抗拒鼻咽癌细胞STAT1表达降低(F=429.87,P<0.05)、细胞生长抑制(F3=.88~4.63,P<0.05)、凋亡率增加(F=38.13,P<0.05)、放射敏感性增加(F=252.80,P<0.05)、细胞周期中G₀/G₁、S和G₂/M期未见明显差异(P>0.05).结论 沉默STAT1基因能增加放射抗拒鼻咽癌细胞 CNE-2R的放射敏感性.     

鼻咽癌细胞系放射敏感性的异质性

鼻咽癌多发于我国南方 ,放射治疗为首选治疗手段。鼻咽癌患者放射治疗后 5年生存率为 34%～ 5 3% ,多数死于局部复发和 或远处转移。肿瘤细胞群中存在放射敏感性差的亚群是复发和转移的主要原因 ,更有效的治疗方案的设计应针对这些放射抵抗的细胞。本室已从鼻咽癌细胞系ＣＮＥ 2Ｚ中分离出 2 5个单克隆株 ,这些克隆株在倍增时间、细胞分裂指数、成瘤率、体外侵袭能力、转移能力和途径等方面存在异质性[1 ] 。为分离出放射敏感性不同的细胞亚系并研究产生放射抵抗的机理 ,本实验对这 2 5个克隆株中生物学特性差异较大的 10个克隆作进一步研究…     

鼻咽癌细胞系CNE-2Z放射敏感性的异质性及其机理探讨

目的　进一步证实人鼻咽癌细胞系CNE 2Z确实存在着放射敏感性的异质性 ,并探讨其有关机理。方法　观察人鼻咽癌细胞系CNE 2Z亚克隆株H5和S1的裸鼠移植瘤放射敏感性的不同 ;用流式细胞仪、荧光显微镜、Western blot检测H5和S1凋亡能力的不同及凋亡相关蛋白表达的差异 ;用3H掺入法说明DNA合成抑制率与放射敏感性的不同 ;用RT PCR观察相关癌基因 (fas、p5 3)的表达与放射敏感性的关系。结果　鼻咽癌细胞系CNE 2Z中确实存在放射敏感性的异质性 ,H5、S1两种细胞的凋亡率都随着照射后时间的延长而增加 ,但H5比S1高且差异有统计学意义 (P <0 0 5 )。两种细胞的DNA合成率于放射前无差别 ;照射后都较放射前受到抑制 (P <0 0 5 ) ,H5受抑制程度大 (P <0 0 5 )。H5与S1细胞fas、p5 3基因的表达差异无统计学意义 (P >0 0 5 )。结论　本实验再次证实了鼻咽癌细胞系CNE 2Z确实存在放射敏感性异质性 ,并证实了其异质性的机理与细胞受射线照射后引起凋亡的能力不同有关、与DNA合成的抑制率成正相关、与癌基因fas、p5 3的表达无关。     

放射敏感性不同鼻咽癌细胞株的蛋白质组学比较研究

鼻咽癌（NPC）是我国南方常见的恶性肿瘤，放射治疗是鼻咽癌治疗最有效的手段之一。预测肿瘤的放射敏感性将有助于制定合理的放疗方案。目前采用的常规放疗方案没有考虑到不同个体存在放射敏感性的差异，影响了肿瘤的放疗控制率。所以，寻找能准确地预测肿瘤细胞的放射敏感性的蛋白质，对不同患者采用更合理的个体化放疗方案极为重要。蛋白质组学方法使高通量地研究生物个体功能成为可能。在本研究中，将应用蛋白质组学技术初步研究放射敏感性不同鼻咽癌细胞株中差异表达蛋白。     

电离辐射诱导结肠癌细胞自噬以及自噬在辐射中的作用

目的 观察辐射诱导结肠癌SW480细胞发生自噬的情况,以及自噬在辐射中的作用。方法 采用透射电镜观察细胞超微结构,免疫荧光观察自噬泡,蛋白质免疫印迹法检测LC3水平,MTT检测细胞增殖情况,Tanswell小室观察细胞的侵袭,划痕实验观察细胞迁移。结果 重离子与X射线辐射能够诱导SW480细胞发生自噬,且自噬水平随辐射剂量的增加而增加(F=458.526,P<0.05);雷帕霉素(rapamycin, RAPM)能够诱导SW480细胞发生自噬,联合照射时,具有协同作用(F=189.393,P<0.05);氯喹(chloroquine,CQ)能够抑制辐射所诱导的SW480细胞发生的自噬;单纯照射组、照射联合RAPM组细胞的侵袭力、迁移力及活性减弱(F=194.692、629.917、302.903,P<0.05);辐射与CQ联合处理组细胞的侵袭力、迁移力及活性增强(F=194.692、629.917、302.903,P<0.05)。结论 电离辐射可诱导结肠癌SW480细胞发生自噬,自噬对细胞有杀伤作用。     

自噬研究新进展

自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性降解途径,是细胞进行自我保护的一种重要机制,在维持细胞存活、更新、物质再利用和内环境稳定中起着重要作用.近年来,针对自噬的研究日益深入,本文对新提出来的受损自噬(frustrated au-tophagy)概念及意义、自噬与凋亡间分子联系的新发现,以及雷帕霉素靶蛋白(mamalian target of mpamycin,mTOR)自噬调节的新动态概述如下.     

鼻咽癌细胞放射敏感性的比较蛋白质组学研究

目的 探讨与鼻咽癌细胞放射敏感性相关的并可能预测鼻咽癌细胞放射敏感性的蛋白质。方法 以人鼻咽癌细胞株CNE-2诱导建立放射抗拒的鼻咽癌细胞株CNE-2(R743),通过克隆形成实验及流式细胞术检测以比较CNE-2和CNE-2(R743)细胞的放射敏感性及细胞周期的特征。提取细胞总蛋白质,进行双向凝胶电泳,Image Master 7.0图像分析软件分析图谱以识别差异蛋白质点,MALDI-TOF/TOF肽质量指纹图谱分析,蛋白质质谱数据库搜索鉴定差异蛋白。应用RT-PCR和Western blot验证2种细胞中相关差异蛋白的表达。 结果 得到7个差异表达较显著的蛋白质,与CNE-2相比较,CNE-2(R743)细胞中6个上调,1个下调。Western blot及 RT-PCR证实膜联蛋白A2、原肌球蛋白及糖调节蛋白78在CNE-2(R743)的表达均上调(t=24.22、24.20和29.19,P<0.05),与蛋白质组学结果一致。结论 不同放射敏感性鼻咽癌细胞存在差异表达的蛋白质,其中膜联蛋白A2、原肌球蛋白及糖调节蛋白78有可能成为预测鼻咽癌细胞放射敏感性的候选生物标志物。     

和厚朴酚对鼻咽癌细胞生长及其放射敏感性的影响

目的 研究和厚朴酚对人鼻咽癌CNE-1和CNE-2细胞生长和放射敏感性的影响。方法 采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测CNE-1和CNE-2细胞生长;流式细胞术检测细胞周期变化;磷脂酰丝氨酸外翻分析法检测细胞凋亡;Western blot法测定相关蛋白表达水平;采用细胞克隆形成法观察和厚朴酚对细胞放射敏感性的影响。结果 和厚朴酚明显抑制CNE-1和CNE-2细胞生长,且存在着明显剂量和时间依赖性,半数抑制浓度(IC₅₀)在CNE-1和CNE-2细胞分别为2.84和2.68 μmol/L(24 h),2.50 和2.20 μmol/L(48 h)。2.5 μmol/L和厚朴酚处理24 h后,CNE-1细胞的早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞分别达到24.53%、23.05%和7.13%,与未经处理的对照组之间差异均有统计学意义(t=-41.17、-8.18、-6.08, P<0.05)。4和3 μmol/L的和厚朴酚分别使CNE-1细胞和CNE-2细胞中促凋亡蛋白Bax和凋亡效应蛋白Caspase 3的表达水平出现2.31倍和1.89倍(t=-15.92、-17.15,P<0.05)及4.43倍和1.85倍(t=-29.39、-13.47,P<0.05)的增加,同时抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达降低45.05%和36.50%(t=26.94、66.14,P<0.05)。和厚朴酚24 h预处理可以明显提高CNE-1和CNE-2细胞对X射线的放射敏感性,SER分别为1.41和1.88。3 Gy X射线照射明显增加两种细胞的G₂/M期细胞数量(t=-14.96、-19.26, P<0.05),和厚朴酚降低了辐射导致的G₂/M期细胞阻滞(t=7.65、4.98,P<0.05),同时Cyclin B1蛋白表达明显增加(t=-33.07、-73.49,P<0.05)。结论 和厚朴酚诱导人鼻咽癌CNE-1和CNE-2细胞凋亡和细胞坏死而导致细胞生长的抑制。干预X射线诱导G₂/M期细胞阻滞可能是和厚朴酚预处理提高两种鼻咽癌细胞放射敏感性的重要作用机制。     

黄连素对乏氧环境中鼻咽癌放射增敏作用机制的研究

目的 探究黄连素对乏氧环境中鼻咽癌细胞系CNE-2及裸鼠移植瘤的增敏效应及其分子机制。方法 四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测黄连素对CNE-2细胞的增殖抑制作用,克隆形成实验观察5 μmol/L黄连素对常氧和乏氧环境中CNE-2细胞放射敏感性的影响。黄连素乏氧下作用24 h后给予8 Gy X射线照射,流式细胞技术检测CNE-2细胞凋亡率。建立鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤模型,观察黄连素及单次8 Gy照射对移植瘤的抑制作用。Western blot检测乏氧条件下黄连素对HIF-1α及VEGF蛋白表达的抑制作用。 结果 黄连素显著抑制CNE-2细胞增殖,且存在时间、浓度依赖效应,24 h药物作用后半数抑制剂量IC₅₀为（14.9±2.2）μmol/L。乏氧环境下,5 μmol/L黄连素处理后的克隆形成率较单纯乏氧组下降,其增敏比（SER_D0）为1.27。在常氧环境中克隆形成率较乏氧组显著增加,常氧组和常氧加药组的SER_D0分别为1.45和1.74。5和15 μmol/L黄连素能在乏氧环境中单独发挥促凋亡作用,与对照组比较差异有统计学意义（t=5.01、9.02,P<0.05）,黄连素联合照射后,凋亡率较单纯照射组增加（t=5.31、9.91,P<0.05）。 体内实验显示,照射给药组肿瘤体积的增长显著延迟于对照组及单纯给药组,肿瘤倍增时间联合组较单纯照射组及对照组差异有统计学意义（t=2.96、14.52,P<0.05）。Western blot显示乏氧条件下HIF-1α、VEGF表达升高,黄连素作用24 h后表达显著下调。结论 黄连素对乏氧环境中的CNE-2细胞及裸鼠移植瘤有放射增敏作用,其与下调乏氧环境中HIF-1α及下游因子VEGF的表达有关。     

鼻咽癌放疗后继发性皮肤晚期放射损伤

目的 通过分析皮肤早期放射反应对皮肤晚期放射反应的影响,探讨皮肤的继发性晚期放射损伤。方法 对门诊随访的放疗后生存5年以上的335例鼻咽癌患者进行调查研究,其中放疗时中位年龄41岁(12～67岁),240例伴颈部淋巴结转移。鼻咽原发灶首程放疗中位剂量为70Gy(55～86Gy),以面颈野为主野放疗71例,以耳前野为主野放疗264例。颈部根治性放疗中位剂量为64Gy(46～72Gy),预防照射中位剂量为55Gy(21～67Gy)。48例合并化疗。根据1995年SOMA标准评价皮肤晚期放射反应。结果 随访间隔中位时间为14年(5～38年)。63例无皮肤晚期反应,1、2、3、4级皮肤晚期反应发生率分别为43.9%(147例)、20.9%(70例)、13.7%(46例)、2.7%(9例)。44例放疗中出现湿性脱皮反应,其中1、2、3、4级皮肤晚期反应发生率分别为41%(18例)、23%(10例)、30%(13例)和5%(2例);无湿性脱皮患者的相应发生率分别为44.3%(129例)、20.6%(60例)、11.3%(33例)和2.4%(7例),两者差异有统计学意义(χ²=17.42,P=0.002)。分层分析结果显示初诊时是否伴颈部淋巴结转移、放疗野及颈部淋巴结放疗剂量均对皮肤晚期反应发生有关,而性别、年龄及是否联合使用化疗与皮肤晚期反应的发生无关。 结论 严重的皮肤早期放射反应可能增加皮肤晚期放射反应,可能存在继发性皮肤晚期放射损伤。     

蒿甲醚对人鼻咽癌细胞CNE-1放射敏感性的影响及其机制研究

目的 研究蒿甲醚(artemether)对人鼻咽癌CNE-1细胞放射敏感性的影响及其作用机理。方法 用MTT法检测蒿甲醚对CNE-1细胞生长的抑制效应;克隆形成法检测蒿甲醚对CNE-1细胞放射敏感性的影响;流式细胞仪检测不同处理因素对CNE-1细胞的细胞周期的影响;Western blot分析蒿甲醚对电离辐射诱导的CNE-1细胞中的细胞周期调控蛋白Cyclin B1和Wee1表达水平的影响。结果 蒿甲醚可抑制CNE-1细胞的增殖,且药物浓度和作用时间相关;20 μmol/L蒿甲醚对CNE-1细胞有放射增敏作用,其放射增敏作用随作用时间的延长而延长,作用24 h 后增敏作用最强,放射增敏比(SER)为1.481。流式细胞仪分析表明,单纯⁶⁰Co γ射线照射后G₂/M期细胞比例上升,而G₀/G₁期细胞比例下降;药物和射线联合作用后,与单纯照射组相比,G₀/G₁期细胞比例上升(t=4.59,P<0.05),G₂/M期细胞比例下降(t=10.60,P<0.05)。蒿甲醚可降低照射后CNE-1细胞内Wee1蛋白表达水平,提高Cyclin B1蛋白表达水平。结论 低浓度蒿甲醚对CNE-1 细胞有放射增敏作用;蒿甲醚通过改变细胞周期调控蛋白Cyclin B1和 Wee1表达水平,诱导G₂/M 期阻滞而发挥放射增敏作用。     

鼻咽癌放射抗拒相关的信号通路

目的 研究具有不同放射抗拒性的人鼻咽癌细胞株CNE-2R与CNE-2的基因表达谱差异,筛选与鼻咽癌放射抗拒相关的基因信号通路.方法 验证已构建的鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R的放射抗拒性,选用Human-6v3.0全基因组表达谱微珠芯片,筛选这2种细胞的差异表达基因.对差异基因进行生物信息学分析,寻找与鼻咽癌放射抗拒...     

3-甲基腺嘌呤增强食管鳞癌Eca-109细胞放射敏感性的研究

目的 研究自噬在照射致人食管鳞癌Eca-109细胞死亡过程中的作用。方法 选用食管鳞癌Eca-109细胞,分为对照组、5 mmol/L给药组、10 mmol/L给药组、单纯照射组、照射+5 mmol/L组、照射+10 mmol/L组,共6组。采用Western blot检测不同处理组自噬标志物LC3B表达水平;GFP-LC3转染食管鳞癌Eca-109细胞后监测自噬体数量变化;MTT法检测不同处理组细胞活力;荧光染料Hoechst 33342观察不同处理组细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术检测不同处理组细胞周期和细胞凋亡;克隆形成实验检测食管鳞癌Eca-109细胞不同处理组放射敏感性。结果 Western blot显示,照射后自噬水平升高,自噬抑制后LC3BⅡ和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值明显下降(F=25.64,P<0.05);GFP-LC3转染食管鳞癌Eca-109细胞后,可见照射后自噬体荧光斑点明显增多,自噬抑制后自噬体明显减少(F=127.36,P<0.05);抑制自噬协同照射后细胞活力明显低于单纯照射组(F=129.54,P<0.05);抑制自噬后也增加了照射诱导的凋亡率和G₂/M期阻滞细胞比;线性二次模型拟合剂量存活曲线显示,抑制自噬能增加食管鳞癌Eca-109细胞的放射敏感性。结论 抑制自噬能提高食管鳞癌Eca-109细胞的放射敏感性,协同杀伤肿瘤细胞,提示抑制自噬或可用于辅助食管鳞癌的放射治疗。