丙烯醛单克隆抗体的制备及ELISA方法的建立

目的利用丙烯醛阳性杂交瘤细胞株制备腹水型单克隆抗体,优化并建立丙烯醛的ELISA检测技术。方法采用直接人工合成法,将丙烯醛半抗原与载体耦合制备完全抗原(免疫原)。利用PEG法将免疫效价高的Balb/c小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,采用有限稀释法进行4次亚克隆,筛选得到1株能稳定分泌抗丙烯醛抗体的亚型为IgG2b的杂交瘤细胞株1G7G6,并制备腹水型抗体。在此基础上,优化并建立检测丙烯醛的间接竞争ELISA方法。结果合成适于免疫和ELISA检测的完全抗原丙烯醛-KLH(免疫原)和丙烯醛-BSA(包被原),制备的丙烯醛抗体(腹水)的效价均在8×104以上,与其他丙烯醛类似物交叉反应率均小于1%,特异性高。优化后丙烯醛ELISA方法的检测灵敏度(IC50)为43.2 ng/ml,检测线性范围为4.4~417.2 ng/ml,检测限(LOD)为1.8 ng/ml。结论成功制备得到高亲和力、高效价的丙烯醛腹水型单抗,筛选优化了间接竞争ELISA检测条件,建立了检测液相中丙烯醛的特异、快速、灵敏的ELISA检测技术。     

抗伏马菌素B_1单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立抗伏马菌素B1（FB1）的单克隆杂交瘤细胞株,制备抗FB1的单克隆抗体（McAb）。方法采用FB1-KLH偶联物小剂量长周期免疫BALB/c小鼠后,采用细胞融合方法获得分泌抗FB1的杂交瘤细胞株,采用多次亚克隆的方法建立了4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株。腹水诱生法获得大量McAb,采用抗体亚类测定试剂盒鉴定抗体的亚类,SDS-PAGE测定抗体分子量,McAb的特异性和灵敏度用间接竞争抑制ELISA。结果免疫小鼠血清检测结果显示经过5次免疫后血清的效价稳定在1×10-6,经过4次亚克隆后建立4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株,获得腹水,纯化抗体,抗体亚类属于IgG2a类,轻链为κ,轻链和重链的相对分子质量分别是55000和32000,ELISA检测抗体特异性显示可与FB1发生特异性反应,采用此抗体建立间接竞争抑制ELISA方法的线性范围在2～500ng/ml。结论制备了特异性和灵敏度较高的抗FB1单克隆抗体,为建立伏马菌素免疫学检测方法打下良好基础。     

一对高亲和力抗人肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备及鉴定

目的 获取抗人肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）的单克隆抗体（McAb）.方法 以人cTnI作为抗原,免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备了抗人cTnI高亲和力、高特异性单克隆抗体.随后采用间接ELISA法测定抗血清效价,用protein G亲和纯化法纯化抗体,抗原竞争ELISA法鉴定抗体亲和力,SDS-PAGE法鉴定纯度,Western blotting鉴定抗cTnI单克隆抗体的特异性,竞争ELISA法分析抗原结合位点.结果 筛选出9株稳定分泌抗cTnI的单抗杂交瘤细胞株,其中A3、A9两株免疫球蛋白亚类均为IgG2a,分泌的抗体纯度高,与CK-MB、cTnT无交叉反应,效价均为：1：1024000,亲和力分别为4.21×10^8mol/L、1.07×10^8mol/L,抗原结合位点不同.结论 成功制备出了一对高亲和力、高特异性抗人cTnI单克隆抗体.     

阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法:采用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗原,免疫BALB/c小鼠,取血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,通过Western blot和间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的特性、效价及mAb相对亲和力。结果:获得2株能稳定分泌抗阪崎肠杆菌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1H7、2B12,抗体Ig亚类分别为IgG1和IgG2b;交叉反应显示单抗具有良好的特异性;ELISA分析表明制备的单抗效价在1×107～2×107,相对亲和常数达109L/mol,染色体鉴定分别为104和106条,符合杂交瘤细胞的特性。结论:抗阪崎肠杆菌单克隆抗体的成功制备为其快速检测方法的建立奠定了基础。     

抗人甲胎蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测技术的建立

目的制备、筛选多株具有商用价值的可配对的高特异性、高亲和力的抗人甲胎蛋白(hAFP)单克隆抗体,初步建立双抗体夹心ELISA检测方法。方法通过经典的淋巴细胞杂交瘤技术筛选分泌抗hAFP单抗的杂交瘤细胞株;对筛选所得单抗的特性进行鉴定分析;双抗体夹心ELISA法筛选最佳配对抗体;初步建立DAS-ELISA检测方法并检测血样,绘制其标准检测曲线并与进口试剂盒比较。结果共获得12株稳定分泌抗hAFP单抗的杂交瘤细胞株,其中Ab 1~Ab 5 5株单抗的腹水效价均高于600万,Ab 5的效价高达3000万;特异性鉴定结果表明Ab 1~Ab 5均能够特异识别天然hAFP分子,但Ab 5与人血清白蛋白(HSA)存在较强交叉反应;抗体配对实验共筛选出5对(Ab 1/HRP-Ab 2、Ab 1/HRP-Ab 4、Ab 3/HRP-Ab 2、Ab 3/HRP-Ab 4和Ab 4/HRP-Ab 1)能够满足hAFP检测要求且无交叉反应的配对抗体,最终确定Ab 1+Ab 3/HRP-Ab 2和Ab 1+Ab 3/HRP-Ab 4为最佳配对组合;利用最佳配对抗体组合建立标准检测曲线,其线性检测范围为5~250 ng/ml,最低检测限2 ng/ml,检测上限400 ng/ml,优于进口试剂盒的线性范围5~200 ng/ml和最低检测限5 ng/ml;样检结果显示自制试剂盒的阳性血清检测准确率99.2%(119/120例),阴性血清准确率100%(40/40例)。结论筛选获得的4株高亲和力、高特异性抗hAFP单抗均可应用于DAS-ELISA试剂盒的研制,Ab 1和Ab 3适合作为捕获抗体,Ab 2和Ab 4适合作检测抗体;自制试剂盒的线性检测范围和最低检测限均优于进口试剂盒,表明具有商用价值。     

抗狂犬病病毒CVS-11株单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗狂犬病毒单克隆抗体,为建立快速准确的狂犬病毒抗原检测方法奠定基础.方法 将狂犬病病毒CVS-11株纯化浓缩后免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经细胞克隆和间接ELISA筛选,获得稳定分泌抗狂犬病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株.小鼠腹腔注射法制备大量单克隆抗体并测定腹水效价,用G蛋白亲和层析柱进行纯化,间接ELISA法和间接荧光法鉴定单克隆抗体的类型、特异性及敏感性.结果 细胞融合率达100%,经克隆筛选获4株稳定分泌抗狂犬病病毒抗体的杂交瘤细胞株,其腹水效价分别为1×104,1×105,1×104和1×105;4株单抗均为IgG类型且特异性好.结论 制备的单抗具有良好特异性和敏感性.     

人N端脑钠肽前体(NT-ProBNP)单抗制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的获得人脑钠肽前体N端(NT-pro BNP)的高亲和力、高特异性的抗体,建立双抗体夹心ELISA法检测人血浆中NT-pro BNP。方法通过Discovery Studio4.0软件预测抗原表位,合成其表位肽偶联载体蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤细胞融合技术获得分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株,制备腹水型单抗。通过SDS-PAGE、ELISA等方法对获得的抗体性质进行鉴定,建立了双抗体夹心ELISA检测方法,并对120例临床血液样本中NT-pro BNP进行快速检测。结果获得6株能稳定分泌抗人NT-Pro BNP抗体的杂交瘤细胞株,其中4株单抗的腹水型效价高于1×10~(-6)。共筛选出4对能双抗夹心ELISA配对的抗体,其中Ab1与Ab5具有较高的灵敏度和较大的线性范围,其亲和力分别为1.0×10~(10)L/mol与5.9×109L/mol,检测线性范围:300~9 600 pg/ml。样本检测结果显示,自制试剂盒的阳性检出率为97.5%(78/80),阴性检出率为100%(40/40)。结论筛选获得1对高亲和力、高特异性的配对抗体,建立了双抗体夹心ELISA的检测方法,亦为新的快速免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

抗3-硝基酪氨酸单克隆抗体的制备及免疫学特性分析

目的制备抗3-硝基酪氨酸(3-NT)单克隆抗体并鉴定其免疫学特性。方法用化学合成方法将3-NT与OVA用戊二醛偶联合成的人工抗原3硝基酪氨酸-戊二醛-鸡卵白蛋白(3NT-G-OVA)作为免疫原,皮下注射免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,扩大培养并对抗体进行免疫学鉴定与分析。结果获得1株稳定分泌抗3-硝基酪氨酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗亚型为Ig G2a;纯化后的抗体效价为1∶(6.14×106);单抗亲和力常数为7.81×107(L·mol-1);Western blot检测证明该单抗与含有3-硝基酪氨酸的蛋白能特异地结合。结论制备了1株具有较高免疫学活性和特异性的抗3-NT单克隆抗体,并可用于Western blot检测病人样本中的蛋白硝基化水平。     

自制NSE单抗的鉴定及其双抗夹心ELISA方法的建立

目的:制备并鉴定NSE(Neuron-specific enolase)单克隆抗体,建立可检测NSE蛋白的双抗夹心ELISA方法。方法:用本实验室已表达纯化的NSE融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体。采用WB、IP、IF、IHC等方法对获得的NSE单抗进行鉴定及亚型检测。利用辣根过氧化物酶标记纯化后的NSE单抗,建立一个可检测NSE蛋白的双抗夹心ELISA法。结果:通过分析和鉴定,选定2株可稳定分泌抗NSE抗体的杂交瘤细胞株,效价达4.2×107～6.5×107,亚型为IgG2b。免疫印迹结果显示,该抗体不仅能识别细胞内源NSE蛋白,还能识别分泌到细胞培养上清液中的NSE蛋白,此外还可用于免疫荧光及免疫组化检测。文中所建立的双抗夹心ELISA法,最低检测极限为8.85 ng/ml。结论:成功获得了效价高、灵敏度好及特异性强的NSE单抗,建立了一个双抗体夹心ELISA检测系统,具有良好的临床应用前景。     

一株中和人IL-17免疫活性的单克隆抗体的制备

目的制备抗人IL-17单克隆抗体,并鉴定其中和活性。方法用hIL-17作为免疫和检测抗原,用间接ELISA法筛选分泌抗人IL-17抗体的杂交瘤细胞株,并对抗体进行中和活性鉴定。结果获得1株稳定分泌抗人IL-17单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型重链为IgG2b,轻链为κ;该株杂交瘤细胞腹水效价为1∶8.192×105;传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;Western Blot检测证明该单抗与人IL-17蛋白特异地结合;单抗亲和常数为8.192×10-9 mol/L;ELISA及Real-time-PCR检测证明该单抗能够有效地阻断人IL-17刺激Hela细胞产生IL-6的作用。结论所制备的抗人IL-17单克隆抗体具有高度的特异性、稳定性及中和活性,为针对IL-17为靶点的抗体药物的开发奠定了基础。     

神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

用本科从人脑中提纯的神经元特异性烯醇化酶(NSE),免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,成功地制作了8株分泌特异性抗NSE-McAb的杂交瘤细胞。分别用正辛酸和DEAE纤维素纯化法获得了高纯度McAb。经鉴定分属IgG1和IgG2a。用改良过碘酸钠法,对4株McAb分别标记辣根过氧化物酶,经多次方阵滴定,建立了双McAb-ELISA夹心法,初步应用于SCLC血清学检测,阳性率83％。免疫组化ABC法研究结果表明,69例APUD肿瘤免疫染色均为阳性。62例非APUD肿瘤9例呈弱阳性。与丹麦DAKD公司NSE-McAb对比,特异性及敏感性无显著差别。     

不同镉离子浓度诱导饲养对参环毛蚓体腔细胞溶酶体膜的影响

目的 观察不同浓度镉离子诱导饲养对参环毛蚓体腔细胞溶酶体膜的毒性效应.方法 选取健康参环毛蚓70只,按照饲养土壤镉离子浓度的不同随机分为7组,每组10只.各组土壤镉离子浓度分别为0.28(对照组)、3.28、6.28、12.28、18.28、24.28和30.28 mg/kg,采用不同浓度镉离子诱导参环毛蚓染毒并饲养14 d.诱导饲养7 d和14 d时观察参环毛蚓体腔细胞的形态变化,测定其体腔细胞溶酶体中性红保留时间.结果 高浓度镉离子诱导参环毛蚓体腔细胞溶酶体的损害明显.诱导饲养7 d,对照组、3.28、6.28、12.28、18.28、24.28和30.28 mg/kg镉离子浓度组参环毛蚓体腔细胞溶酶体中性红保留时间随着镉离子浓度的增加而逐渐缩短,分别为(71.3±2.4)、(60.5±1.6)、(55.1±2.9)、(51.9±3.6)、(46.0±2.5)、(38.8±1.8)、(34.2±2.0)min.与对照组比较,诱导饲养7 d、14d时各实验组参环毛蚓溶酶体中性红保留时间明显缩短(均P＜0.05).结论 体腔细胞溶酶体中性红保留时间可用于评价土壤中重金属镉对参环毛蚓的毒性效应.     

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备SARS冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白特异性单克隆抗体(McAb)，为SARS的快速诊断及致病机制的研究提供实验材料。方法 用纯化的重组SARS-CoVN蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合和亚克隆后获得分泌针对N蛋白的杂交瘤细胞株，用Western blot和间接免疫荧光法检测这些细胞株分泌的单克隆抗体特异性，并将N蛋白分3段表达初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。结果 通过细胞融合和3轮克隆化，筛选出分泌抗N蛋白的6个杂交瘤细胞株。Western blot及免疫荧光显示，获得的McAb可与SARS-CoVN蛋白及SARS-CoV发生特异性反应，有4个细胞株分泌的抗体的识别位点位于N蛋白N端，2个位于C端。结论 获得了SARS-CoV特异性单克隆抗体并进行了初步定位，可用于SARS的早期诊断及致病机制研究。     

Production of monoclonal antibodies for Plasmodium vivax lactate dehydrogenase and patient sera screening using sandwich ELISA

Malaria is a worldwide infectious disease. There are many diagnostic kits to detect malaria infection. However, the sensitivity of these diagnostic kits remains a problem. To develop a diagnostic kit for malaria that has high sensitivity, it is necessary to produce monoclonal antibodies (McAbs) with high affinity. The present study was undertaken to produce hybridoma cells that can be used to generate McAbs with high affinity and specificity against Plasmodium vivax lactate dehydrogenase (pvLDH). In this study, BALB/c mice were immunized with purified recombinant polypeptides that encode pvLDH. McAbs against pvLDH were produced according to the protocol of hybridoma technique using myeloma cells (SP2/0 cell lines). The McAbs were characterized by isotyping and by Western blot analysis. Two McAbs (D2H and D7E) against pvLDH antigen were obtained. The isotypes of D2H and D7E were IgG2b. They recognize 33?kDa proteins that were defined as pvLDH by Western blot analysis. In the affinity test, D2H and D7E showed positively optical density value until each McAbs were serially diluted at concentrations of 0.156 and 0.078?μg/ml, respectively. To evaluate sensitivity and specificity against clinical specimens of P. vivax, purified McAbs were tested with alkaline phosphatase-conjugated monoclonal antibodies and blood samples (n?=?180) of P. vivax patients using the sandwich enzyme-linked immunosorbent assay, showing the 98?% sensitivity. We suggest that McAbs produced in this study may be used for developing efficient and rapid diagnostic kits.     

乙型脑炎病毒单克隆抗体制备及其特性鉴定

目的制备乙脑病毒单克隆抗体并对其各项生物学性质进行鉴定。方法通过免疫、融合、克隆和筛选等方法制备乙脑单抗,使用ELISA、IFA、中和试验和Westernblot等方法鉴定单抗的敏感性、特异性、种内反应广谱性以及中和活性。结果最终获得3株稳定分泌的乙脑单克隆抗体细胞株,其滴度均超过106。3株单抗只与乙脑病毒反应,与其他9种虫媒病毒皆不反应。ELISA相加试验证明3株单抗的作用位点非常相近,选择其中的F12.37与10个代表性乙脑病毒株反应,F12.37能够敏感地检测到所有10个在细胞内复制的病毒株。F12.37还能够中和乙脑P3株(基因Ⅲ型)和SH03-103株(基因Ⅰ型),保护50%细胞不产生病变的稀释度分别为1∶3.2×105和1∶105,Westernblot结果显示F12.37与乙脑病毒E蛋白相互作用。结论本研究获得了3个高滴度、高特异性的乙脑单克隆细胞株,其中F12.37具有较高的敏感性和较好的种内反应广谱性,能够中和两个基因型乙脑病毒,其作用位点位于乙脑病毒E蛋白。     

人胱抑素C单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备人胱抑素C(Cystatin C,Cys C)的单克隆抗体(McAb),并建立检测人血清Cys C的颗粒增强透射免疫浊度分析法(PETLA).方法:构建人Cys C的原核表达载体pET32a( )/Cys C,纯化Cys C重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,杂交瘤技术制备Cys C的McAb;以自制的McAb包被乳胶颗粒,建立PETIA法测定血清Cys C,并对其分析性能进行初步方法学评价.结果:建立分泌抗Cys C单克隆抗体的杂交瘤细胞株3株,其分泌的McAb为IgG1,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合;将杂交瘤细胞注射于小鼠腹腔,腹水中Cys C McAb效价为1∶4×106;用自制的McAb建立定量测定Cys C的PETIA,方法学评价试验结果证实我们建立的PETIA法,与进口试剂有很好的可比性,具有较满意的方法学性能.结论:成功制备了抗Cys C单克隆抗体,该抗体可用于建立定量检测Cys C的PETIA法.     

The effect of cadmium on antibody responses to antigens with different cellular requirements

Six week old BDF1 or CD-1 female mice were exposed to cadmium chloride in the drinking water at concentrations ranging from 0 to 50 ppm cadmium for 3 weeks. The in vivo antibody response against dinitrophenyl-aminoethylcarbamylmethyl-Ficoll (DNP-Ficoll), a T-lymphocyte independent, macrophage dependent response, was enhanced by cadmium. Similarly, the in vivo antibody response against Escherichia coli 0127 (LPS), a T-lymphocyte and macrophage independent response, was also enhanced by cadmium. In contrast, the in vitro antibody response against sheep red blood cells (SRBC), a T-lymphocyte and macrophage dependent response, was suppressed in spleen cell cultures that contained cadmium-exposed non-adherent cells (lymphocytes). Cultures containing cadmium-exposed adherent cells (macrophages) were not suppressed by cadmium. These results suggest that the immunosuppressive effects of cadmium as it relates to humoral immunity involve T-lymphocyte function rather than macrophage or B-lymphocyte activity. The enhanced T-lymphocyte independent antibody responses which accompany suppressed T-lymphocyte-dependent responses following cadmium exposure are an indication of compensatory mechanisms that are associated with the immune system.     

抗HCMV不同多肽McAb的鉴定

目的为了将单克隆抗体 (Mc Ab)用于诊断技术 ,我们首先建立了 13株抗人巨细胞病毒 (HCMV)的 Mc Ab,选取 6株 Mc Ab作进一步鉴定。方法这 6株 Mc Ab的鉴定主要采用间接免疫荧光试验、免疫印迹试验等方法。结果间接免疫荧光试验表明 :Mc Ab8B8相应的多肽为早期抗原 ;而 Mc Ab7B4、7D7、7E7、7E11、8D6的相应病毒多肽为晚期抗原。免疫印迹试验的结果表明 :Mc Ab7B4、7D7、7E7、7E11、8B8、8D6相应的病毒多肽分子量分别为 46、15 0、38、5 1、72、6 5 kd。结论 Mc Ab8B8可不用于 HCMV的快速诊断。     

抗猪囊虫单克隆抗体的制备及应用

目的利用杂交瘤技术制备抗猪囊虫单克隆抗体,建立抑制性酶联免疫吸附法I-ELISA并应用于临床.方法运用自提的猪囊虫囊液与福氏不完全佐剂加干扰素混合免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,反复筛选及克隆化;用低温无水乙醇沉淀法分离纯化单抗IgG(腹水抗体效价13200);用改良的过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标单抗;用I-ELISA检测患者脑脊液和血清中囊虫特异性抗体.结果获得了3株稳定分泌抗猪囊虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株,单抗的免疫球蛋白亚类鉴定为2株IgG3,1株IgM.标记的HRP-IgG酶标单抗,经临床病例标本验证,确诊的脑囊虫病患者脑脊液63例,抗体阳性61例,阳性率为96.83%;血清标本60例,抗体阳性53例,阳性率为88.33%;其他颅内感染性疾病患者脑脊液标本240例、血清标本240例,肝肺包虫病患者血清10例,正常脑脊液25例(阑尾炎手术腰麻患者),健康志愿者血清32例,检测结果均为阴性.结论本研究制备的HRP-IgG酶标单克隆抗体经临床应用,证实对脑囊虫病有良好诊断价值.     

Identification of viral antigenic determinants by monoclonal antibodies directed against Chilo Iridescent Virus (Iridovirus type 6)

Summary Monoclonal antibodies (McAbs) obtained against Iridovirus type 6 (CIV) were characterized by Western blotting and/or immunoprecipitation. Seven McAbs were found to be strongly reactive with viral polypeptides of molecular weights 16K and 18K by Western blotting. Two McAbs were directed against a complex composed of 30K, 50K, and 100K polypeptides, but failed to react with either of these free polypeptides. This finding could explain the faint reactivity of these McAbs in Western blotting and immunoprecipitation. The reactivity of the other McAbs with their antigenic determinants is also discussed.