恶性疟原虫FCC1/HN株MSA1抗原部分保守区基因的序列测定

P190是恶性疟原虫裂殖子表面抗原1(MSA1),是很有希望的疟疾疫苗候选抗原。根据该基因现有序列,我们设计了3对引物,在5′端引物和3′端引物前分别设有BamHI和xbal酶切位点序列,在每个酶切位点前设有保护性碱基GC,用固相亚磷酸酰胺法在AB1391型DNA自动合成仪上自动合成引物,合成的引物氨解、冷冻干燥后经HPLC纯化。采用聚合酶链反应(PCR)方法亚克隆了恶性疟原虫FCC1/HN株P190第3、4保守区和第2保守区部分序列的基因片段,分别定名为P190CR3、P190CR4和P190cR2-2,各片段均定     

恶性疟FCC1/HN株P190基因3端发生遗传重组

恶性疟原虫P190抗原是疟疾疫苗重要的候选抗原。但该抗原存在明显的株间差异。因此了解和弄清这种变异的本质对P190疫苗研究具有重要意义。免疫学分析和基因序列测定结果均显示该分子存在保守区和变异区。但变异是有限的,至今只发现两种变异类型,K1和MAD20型。这两类序列差异主要表现在双态区。Tanabe等经研究后提出,P190是由一对双态等位基因编码的,这对等位基因在疟原虫有性生殖期(在蚊体内进行)可发生有限的基因间重组。近来研究结果亦显示,在P190基因5′端确实存在基因间同源重组现象,并且这种重组是导致该抗原变异的重要因素,但至今尚未在3′端发现这种重组现象。我们克隆了我国恶性疟FCC1/HN株P190双态区和近3′端保守区的2个基因     

恶性疟P190抗原保守区Ⅰ、Ⅴ基因的亚克隆及在大肠杆菌中高效表达

作者采用PCR方法克隆了我国海南省FCC1/HN株P190抗原两个保守区基因,分别定名为P190CRI和P190CRV。基因片段经纯化后连接到pUC18载体中进行DNA序列分析,结果显示:除了P190CRV中有5个碱基变换外,其余序列均与MAD20型序列一致。经序列分析的两个基因片段分别与pGEX-2T载体连接,经双酶切鉴定后转化感受态JM109(DE_3)大肠杆菌进行高效融合表达,并且用Sepharose 4B-谷胱甘肽层析柱进行亲和纯化,结果为:两个插入基因片段均得到高效融合表达,经一步亲和纯化后就取得高纯度的重组蛋白。     

恶性疟原虫红内期SSUrRNA编码基因的克隆与序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株红内期小亚单位核糖体核糖核酸SSUrRNA编码基因(SSUrDNA)片段，并进行序列分析。方法根据献报道恶性疟原虫基因序列设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)方法从海南恶性疟患血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSUrDNA目的基因片段，纯化后与PUC19m-T质粒载体连接构建重组子，并导入大肠杆茵JM109；阳性克隆经双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列，并采用ExPASy Proteomicstools软件分析。结果 恶性疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为431bp；阳性克隆重组质粒作双酶切及PCR扩增均得到预期大小的基因片段；测定的SSUrDNA插入片段核酸序列与巴西恶性疟原虫IMTM／7G8相同基因序列对比。未发现碱基的插入或缺失去，同源性为99．3％；第353位碱基由C取代了G，第371位碱基由T取代了C，其余序列相同。结论 成功克隆了恶性疟原虫海南株红内期SSUrDNA基因片段，该序列在不同恶性疟原虫虫株间相对保守。     

3’末端碱基游移混合引物提高多变区基因片段PCR检测的阳性率

目的：通过使用3′末端碱基游移混合引物，减少引物末端错配，提高多变区基因片段的PCR检阅阳性率。方法：在HBV DNA P基因区设计一对检测阳性率相对较高的引物(原型引物)，在原型引物序列基础上将两根引物的3′末端分别截去1个或2个碱基，设计出两对参数与原型引物近似的突变引物。分别单独用原型引物和原型引物与突变引物组成的混合引物，在相同条件下对27份HBV DNA阳性标本行PCR，比较二者阳性率。用混合引物扩增4例拉米呋丁治疗无效患者血清HBV DNA，将扩增产物测序并评价3′末端错配对PCR的影响。结果：原型引物和混合引物检阅阳性率分别为70．4％(19／27)和85．2％(23／27)，两者差异非常显著(P＜0．05)。引物3′末端错配能导致PCR假阴性。结论：扩增保守性相对较差的基因片段，采用3′末端单个或多个碱基截短的引物，构成3′末端碱基游移混合引物，可以避免因3′末端错配产生的PCR假阴性，提高检测阳性率。     

恶性疟P190抗原双态区三肽重复序列基因的缺失

恶性疟P190(亦称裂殖子表而抗原1,MSA1)是疟原虫红内期裂殖体产生的一种塘蛋白,分子量约190 kD。由于该抗原在疟疚病人和实验动物中均能诱生很强的保护性免疫力,因而已将它列入重要的疟疾疫苗候选抗原。P190存在株间抗原差异,但该变异属于等位基因双态变异。至今经序列分析鉴定的虫株中只发现两种变异类型序列,MAD20型和Kl型。比较不同虫株该基因序列可将该分子划分为保守区、双态区和多态区。近来研究提示,双态区可能是该分子重要保护性免疫控制区。我们克隆了我国恶性疟FCC1/HN株该双态区的基因。方法为设计和合成一对引物,在引物的5’端设有     

套式PCR用于海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1和2的分型研究

目的了解海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(pfMSP1)和表面蛋白2(pfMSP2)等位基因型的分型特征。方法采用套式PCR法分别扩增pfMSP1基因第2区与第3区部分片段和pfMSP2基因的中间可变区(第3区)，对海南省恶性疟原虫分离株进行基因分型。结果 55份血样中有52份恶性疟疾患扩增pfMSP1基因片段，以MAD20型为主导型(84.6％)，K1型为次要型，未检出RO33型，两种不同等位基因混合感染率为15．4％。同时，55份血样中有53份恶性疟疾患扩增出pfMSP2基因片段，以3D7型为主导型(83％)，FC27型为次要型，混合感染率为17％。结论 海南省恶性疟原虫的MSPl存在MAD20型和K1型两种等位基因型，以MAD20型为优势虫株；其MSP2存在3D7型和FC27型两种等位基因型，以3D7等位基因家族为主。     

转基因植物表达质粒中SBR基因的序列分析

【目的】对转基因植物表达质粒pROP1中含SBR基因P1片段（184～1946bp）进行序列测定和分析。【方法】从E.coliDH5α中提取质粒pROP1,用PCR测序试剂盒和DNA自动测序仪检测P1片段的序列,并与GenBank上的变形链球菌表面蛋白基因序列比较,检测其准确性。【结果】测定了P1片段5′端616个碱基序列和3′端466个碱基序列,其准确性达98％。【结论】PCR扩增的P1片段5′端和3′端的DNA序列与变形链球菌表面蛋白pac基因唾液粘附区相一致,为转基因番茄防龋疫苗的研究提供了基础资料。     

恶性疟原虫肝期抗原1基因3′端的克隆及序列分析

【目的】克隆并测定恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)肝期抗原 1基因 (LSA 1) 3′端序列 ,比较FCC1/HN株与国外分离株LSA 13′端序列的差异。【方法】应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增LSA 13′端序列 ,用T A克隆法将其克隆入pMD18 T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后 ,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA 13′端序列的同源性分析。【结果】PCR扩增得到特异的FCC1/HNLSA 13′端序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的 pT LSA 1重组质粒。测序表明 ,所克隆的LSA 13′端大小为 795bp ,编码 2 6 4个氨基酸。序列分析表明 ,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的NF5 4、T9/ 96、KEN、PNG及BRA株LSA 13′端编码的氨基酸序列只在 3个位点存在不同。【结论】克隆了恶性疟原虫FCC1/HNLSA 13′端片段。序列测定及同源性分析表明 ,FCC1/HNLSA 13′端序列与其它分离株有高度的同源性。     

Channel catfish重组激活基因克隆与鉴定

目的尝试用简并引物扩增序列未知的channel catfish基因组DNA中ragl基因的片段并测序,为ragl基因的早期进化模式和遗传学变异情况的研究提供直接的证据.方法基于ragl基因的高度保守设计简并引物,PCR扩增channel catfish基因组DNA中ragl基因的片段,TA克隆并双向测序.将所得序列资料拼接,用多种生物信息学方法分析其ORF、内含子、与其它物种ragI基因及Ragl蛋白的相似性,并做多序列比较和系统进化树分析.结果扩增出3条chan-nel catfish ragl基因的DNA片段.从拼接后的序列中找到一2 235bp的ORF和一293bp的内含子,所得序列与其它物种ragl基因的相似程度高(多大于70%),去除内含子后的channel catfish ragl基因序列与zebrafish、rainbow trout、bull shark的ragl基因cDNA全序列碱基一致的位点占43.9%,自第1 352位碱基至2 925位碱基为53.1%,而自第1位碱基至1 351位碱基为33.2%,有非常显著的差异(P＜0.01).结论用简并引物成功扩增出channel catfish ragl基因的DNA片段.序列在GenBank中的登记号是:AY423858(去除内含子序列),AY423859.ragl基因进化缓慢,高度保守,不同物种ragI基因的变异相对集中在氨基末端的区域.系统进化树分析显示了13种硬骨鱼在进化上关系的亲疏.     

Alu-LTR PCR检测整合型HIV-1实验方法的优化

目的对Alu-LTRPCR检测整合型HIV-1的实验方法进行优化。方法收集20例HIV-1感染患者及10例健康对照者的抗凝血标本,纯化CD4+T细胞并提取DNA,根据整合型HIV-1DNA的特点设计引物,首轮PCR5′端引物来自于人类保守的Alu序列,3′端引物来自于HIV-1LTRU5区序列,扩增片段包含了整合位点上游的人类基因组DNA序列和整合的HIV-1LTR的序列。第二轮引物针对HIV-1LTRU3区的序列。在首轮PCR基础上,PCR产物稀释后进行第二轮PCR。结果经过优化的Alu-LTRPCR,20例HIV病人全部检测到整合的HIV-1。结论经优化后,Alu-LTRPCR检测整合型HIV-1的实验方法的灵敏度明显提高。     

恶性疟虫肝期抗原1基因3′端的克隆及序列分析

目的：克隆并测定恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）肝期抗原1基因（LSA－1）3′端序列,比较FCC1／HN株与国外分离株LSA－1,3′端序列的差异。方法：应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增LSA－1,3′端序列,用T－A克隆法将其克隆入pMD18－5载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA－1,3′端序列的同源性分析。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN LSA－1,3′端序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pT－LSA－1重组质粒。测序表明,所克隆的LSA－1,3′端大小为795bp,编码264个氨基酸。序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1／HN株国外的NF54、T9／96、KEN、PNG及BRA株LSA－1,3′端编码的氨基酸序列只在3个位点存在不同。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN LSA－1,3′端片段。序列测定及同源性分析表明,FCC1／HNLSA－1,3′端序列与其它分离株有高度的同源性。     

贵阳腐霉几丁质酶的活性及基因片段克隆与序列

目的: 研究贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)几丁质酶的活性及其基因片段的克隆与序列分析.方法: (1) 采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定贵阳腐霉分泌的几丁质酶活性;(2)根据NCBI Protein 数据库中多种生物的几丁质酶氨基酸序列的保守区设计引物,以贵阳腐霉基因组DNA为模版,通过PCR扩增获得特异性DNA片段;(3)将该片段克隆并进行测序分析.结果: 贵阳腐霉经诱导后可以分泌几丁质酶.诱导24 h是该酶分泌高峰期.克隆到一207bp的DNA片段,其第182～207碱基序列与狗(Canis familiaris)的几丁质酶基因的部分序列相同.结论: 本实验证明贵阳腐霉核DNA含有几丁质酶基因,在几丁质类似物的诱导下,该菌可以分泌几丁质酶.所克隆的DNA片段可能是几丁质酶基因的部分序列.     

应用体外DNA同源重组技术构建pcDNA3.1-NGF和pcDNA3.1-TrkA

目的:利用体外DNA 同源重组的方法分别构建含神经生长因子(NGF)和神经生长因子受体(TrkA)基因的真核表达载体.方法:在引物5′加上一段与载体克隆位点两端碱基序列相同的序列,PCR扩增目的基因NGF和TrkA,线性载体片段和目的基因片段经T4 DNA 聚合酶的外切产生互补的单链DNA,然后37℃退火实现体外同源重...     

Pf332抗原的结构和抗原表位的初步研究

目的　了解恶性疟原虫FCCl／HN株Pf332抗原(Ag332)的初级结构和潜在的抗原表位。方法　根据Pf332基因已知序列，合成9对引物用于从恶性疟原虫FCCl／HN株基因组DNA中扩增Pf332基因片段。将扩增得到的9个Pf332基因片段插入pMD-18T载体后测序。用DNAstar软件将测定的Pf332基因片段序列拼接出成完整的Pf332基因序列。分别用SAPS、Tmpred、SingalP和Blastn程序来分析Ag332的初级结构和序列同源性。将与Pf332基因的9595－10083、10339－10767和10855－11247位碱基对应的RO、R1和R2片段分别插入真核表达载体pcDNA3-S。将pcDNA3-R0、pcDNA3-S-R1和pcDNA3-S-R2分别免疫Balh/c鼠，并通过免疫组化检测表达产物。通过ELISA和体外疟原虫生长抑制实验来鉴定DNA免疫所诱导的保护性免疫反应。结果扩增到特异的9个Pf332基因片段，并正确插入pMD-18T载体。序列测定和拼接结果显示，恶性疟原虫FCC1/HN株Pf332基因长16377bp，编码5458个氨基酸，相对分子质量约615.28ku。Ag332包含17个调度简并的富谷氨酸重复序列，抗原中谷氨酸占30.18%。恶性疟原虫FCCl/HN株和3D7株Ag332的氨基酸残基同源性达94.55%。免疫组化检测显示R0、R1和R2在鼠肌肉组织中表达。分别免疫了pcDNA3-S-R0,pcDNA3-S-R1和pcDNA3-S-R2的实验组IgG含量显大于空白对照组和pcDNA3组（P＜0.05)。体外疟原虫生长抑制实验结果表明，pcDNA3-S-R0,pcDNA3-S-RI和pcDNA3-S-R2组的免疫血清在1：5稀释度时对恶性疟原虫的生长有抑制作用。结论　Pf332抗原是一包含很多调度简并的富谷氨酸重复序列的大蛋白，Pf332基因片段R1和R2编码潜在的抗原表位重复序列。     

间日疟原虫深圳株红内期SSUrDNA基因片段的克隆与序列分析

目的 体外扩增间日疟原虫深圳株红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因(SSUrDNA)片段，研究其结构与功能。方法 设计一对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)从间日疟原虫患者血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段，以PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109；阳性克隆双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列。结果 间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小为341bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；序列测定插入片段为341bp，与Sal I株顺序相比，仅在第151位处缺失一个碱基C。结论 成功克隆了间日疟原虫SSUrDNA片段．该序列在间日疟原虫虫株间高度保守。     

3’末端碱基游移混合引物提高多变区基因片段PCR检测的阳性率(英文)

目的:通过使用3’末端碱基游移混合引物,减少引物末端错配,提高多变区基因片段的PCR检测阳性率。方法:在HBV DNA P基因区设计一对检测阳性率相对较高的引物(原型引物),在原型引物序列基础上将两根引物的3’末端分别截去1个或2个碱基,设计出两对参数与原型引物近似的突变引物。分别单独用原型引物和原型引物与突变引物组成的混合引物,在相同条件下对27份HBV DNA阳性标本行PCR,比较二者阳性率。用混合引物扩增4例拉米呋丁治疗无效患者血清HBV DNA,将扩增产物测序并评价3’末端错配对PCR的影响。结果:原型引物和混合引物检测阳性率分别为70.4％(19/27)和85.2％(23/27),两者差异非常显著(P<0.05)。引物3’末端错配能导致PCR假阴性。结论:扩增保守性相对较差的基因片段,采用3’末端单个或多个碱基截短的引物,构成3’末端碱基游移混合引物,可以避免因3’末端错配产生的PCR假阴性,提高检测阳性率。     

两种DNA的PCR产物克隆入同一载体的构建策略

目的：以克隆小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛可变区首尾区域的双独立片段为例,探讨克隆入同一载体的基因数多于一个时可采取的构建策略。方法：在一个基因A正义引物与另一基因B负义引物的5′端分别设计与克隆载体相匹配的酶切位点,在 B基因正义引物与A基因负义引物的5′端设计相同的酶切位点。分别进行PCR扩增,再通过引物的5′端相同的酶切位点进行两PCR产物的酶切与连接,以连接产物为模板,应用A基因正义引物和B基因负义引物进行PCR扩增,将此次PCR产物经常规方法克隆入载体。     

恶性疟原虫FCCl／HN株LDH基因的克隆及序列分析

目的 克隆并测定恶性疟原虫海南(FCCl／HN)株LDN基因序列,比较FCCl/HN株与国外分离株LDH基因序列的差异。方法 根据LDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCCl/HN株基因组DNA中扩增LDH基因,并将其克隆入pMDl8-T载体。用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定,并用分子生物学软件进行不同分离株LDH基因序列的同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCCl／HN株LDH基因片段并构建了pT—LDH重组质粒。恶性疟原虫FCCl／HN株LDH基因全长951bp,编码316个氨基酸。序列分析表明,我国恶性疟原虫FCCl／HN株与国外的3所、Honduras 1株LDH基因编码氨基酸序列完全一致。结论 成功克隆恶性疟原虫FCCl,HN株LDH基因。序列测定及同源性分析表明,FCCl/HN株与其它分离株的LDH基因序列高度保守。     

用锅柄聚合酶链反应法克隆卡地腐霉Pr1基因的未知片段

目的：分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因已知片段的3′端未知序列。方法：采用PANHANDLE PCR，以基因组DNA为模板，通过链内退火及延伸形成一个类似锅柄形状的结构，经嵌套式PCR扩增得到未知目的片段。通过已知cDNA片段设计引物，PCR扩增得到该蛋白酶部分基因组序列，采用限制性内切酶BamH Ⅰ消化卡地腐霉基因组DNA，经去磷酸化处理后，在消化片段3′端连接一段与卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因5′端已知序列互补的5′端磷酸化寡核苷酸链NA，经链内退火及聚合酶延伸形成一锅柄状结构。结果：获得一大小为876bp的PCR产物，经序列分析验证，该panhandle PCR产物包含了已知卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因3′端未知的853bp核苷酸序列。结论：这种特殊的PCR方法可以高度有效地克隆和鉴定已知片段两侧的未知基因片段。