中国脑膜炎奈瑟菌中插入序列1301的分布与分子流行病学研究

目的 研究中国脑膜炎奈瑟菌(Nm)中插入序列IS1301的分布与分子流行病学特征.方法 设计IS1301引物,应用PCR方法检测2007年1月至2008年10月收集全国16个省、市、自治区219株Nm菌株的IS1301,对IS1301扩增产物进行DNA测序和序列比对,PCR扩增IS1301阳性菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析及核酸印迹杂交,研究不同Nm菌株中IS1301的分布特征.结果 219株Nm菌株中,34株携带IS1301(15.53%),A、B、C群和不可分群的Nm菌株IS1301阳性率分别为11.11%、20.75%、6.17%和28.57%;IS1301扩增产物测序结果与GenBank登记编号ZA9092.1的Nm菌株序列相似度为94%～100%,进化树分析可分为两簇;C群Nm菌株与其他血清群菌株IS1301序列存在较大差别;研究的Nm菌株基因组中至少存在6～17个IS1301拷贝,相同PFGE带型Nm菌株所携带的IS1301拷贝数具有多态性特征.结论 IS1301在中国Nm菌株中的分布具有遗传多态性.     

鼠疫菌3种常见质粒的结构特征分析

目的研究鼠疫菌基因组中3种常见质粒的基因构成和分布特征。方法应用编码基因序列相似性比对和生物信息学软件自动分析2种方法,分别对国际上已完成全基因组测序的9株鼠疫菌的鼠毒素质粒(pMT1)、低钙反应质粒(pCD1)和鼠疫菌素质粒(pPCP1)进行整体结构的比较分析。结果 pMT1质粒上存在基因大片段的重新排列,整条质粒被划分成4个主要的基因模块。CO92、KIM和91001菌株分属于东方型、中世纪型和田鼠型3个不同的生物型,他们的p MT1质粒结构各有特点;Nepal 516等其余6株菌均是古典型鼠疫菌,他们的pMT1质粒结构基本一致,且与其他3个生物型鼠疫菌株的p MT1质粒结构不同。pCD1质粒被划分成3个主要的基因模块,但整体结构在不同菌株中并无差异,只有IS100在质粒中的插入位置各不相同。pPCP1质粒上所有编码基因的排列顺序和方向在各菌株中完全相同。结论鼠疫菌pCD1和pPCP1质粒的基因结构比较稳定,而pMT1质粒结构在鼠疫菌的长期进化过程中发生了一定程度的变异。     

布氏田鼠鼠疫菌102 kb pgm基因座结构研究

目的　研究布氏田鼠鼠疫菌株 1 0 2kbpgm基因座结构与其他类型鼠疫菌是否有区别 ,及其与布氏田鼠鼠疫菌株的独特特征的关系。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)的方法 ,共设计 2 5对嵌套的引物 ,以喜玛拉雅旱獭鼠疫菌株和布氏田鼠鼠疫菌株的染色体DNA为模板 ,分段扩增该区域内的DNA ,选择差异较大的扩增片段进行克隆和测序 ,与已发表的序列比较。结果　布氏田鼠鼠疫菌株的 1 0 2kbpgm基因座一端缺失了1 952个碱基 ,即插入序列IS1 0 0。另外 ,在测序的这段基因中 ,一类似于可变数量串联重复序列 (VNTR)的区域 ,布氏田鼠鼠疫菌比已发表的序列多出几个拷贝。结论　布氏田鼠鼠疫菌株的 1 0 2kbpgm基因座序列改变了 ,一端缺失了插入序列IS1 0 0 ,这就使得它的毒力岛不容易丢失 ,保持了 pgm+表现型的稳定 ;与其毒力的关系 ,有待于进一步研究     

中国炭疽芽胞杆菌荚膜质粒基因单核昔酸多态性研究

目的 研究中国炭疽芽胞杆菌(炭疽杆菌)荚膜质粒基因单核苷酸多态性(SNP)特征.方法 选择中国不同分离年代、地点和来源的95株炭疽杆菌,采用PCR方法扩增荚膜质粒基因上的23个SNP位点,然后进行测序并进行聚类分析.结果 通过聚类分析,95株炭疽杆菌可分为5个群,23个SNP位点中17个位点相同,6个位点存在多态性,其中17.89％(17/95)的菌株与参考菌株Pastuer同源,38.95％(37/95)的菌株与参考菌株Ames Ancestor同源,其余菌株则不同于目前已知的全基因组测序菌株;3株菌在PS-34位点扩增基因片段中缺失长度约80bp的序列,待测的SNP位点包括在该缺失片段中;9株菌株在所有SNP位点扩增阴性,经炭疽杆菌荚膜质粒基因特异引物扩增证实这些菌株缺失荚膜质粒基因.结论 中国炭疽杆菌荚膜质粒SNP位点具有遗传稳定性和自身的特异性,6个SNP位点可作为基因分型的指标.     

产气肠杆菌新德里金属β-内酰胺酶质粒分子特征分析

目的分析产气肠杆菌携带blaNDM-1质粒的转移性、质粒复制子分型及blaNDM-1的基因环境。方法产气肠杆菌HN-NDM0711为研究对象,接合实验鉴定质粒转移性,PCR方法对质粒复制子分型,染色体步移技术对blaNDM-1上下游测序,基因组序列比对使用BLASTN和BLASTP,注释使用Vector NTI 11.5.1。结果产气肠杆菌HN-NDM0711接合实验阳性,质粒复制子为IncA/C型;blaNDM-1位于不常见的插入序列ISAba14和IS91之间;在blaNDM-1上游出现一个Tn3转座子和I型整合子,整合子上含有一个由庞大镶嵌序列构成的罕见耐药基因盒。结论 IncA/C型质粒pHN-NDM0711携带blaNDM-1及耐药基因盒来源于不同抗菌药物选择压力环境下的基因重组。只有严格控制临床、工业和农业抗菌药物的合理使用才能从源头上减少此类细菌的产生。     

福氏痢疾杆菌2b血清型菌株基因组中SfII和SfX前噬菌体整合位点及排列方式研究

目的 研究福氏痢疾杆菌2b血清型菌株中SfII和SfX前噬菌体整合位点及排列方式.方法 根据2b血清型菌株基因组中SFII和SfX前噬菌体可能的整合位点及排列方式,设计引物,对50株2b血清型菌株进行PCR扩增,并对扩增产物测序,根据扩增和测序结果判断噬菌体的整合位点和排列方式.结果 在2b血清型菌株中,SfII和SfX前噬菌体前后相连,整合于宿主菌染色体proA和yaiC基因间的thrW tRNA基因上;以SfII在前,SfX在后,或SfX在前,SfII在后两种方式排列;而以后一种方式为主,在共50株检测菌株中,有49株为此方式.结论 福氏痢疾杆菌血清型相关噬菌体的整合位点及排列方式,对研究福氏痢疾杆菌血清型转换及血清型相关噬菌体的整合机制具有重要意义.     

福氏痢疾杆菌2b血清型菌株基因组中SfII和SfX前噬菌体整合位点及排列方式研究

目的 研究福氏痢疾杆菌2b血清型菌株中SfII和SfX前噬菌体整合位点及排列方式.方法 根据2b血清型菌株基因组中SFII和SfX前噬菌体可能的整合位点及排列方式,设计引物,对50株2b血清型菌株进行PCR扩增,并对扩增产物测序,根据扩增和测序结果判断噬菌体的整合位点和排列方式.结果 在2b血清型菌株中,SfII和SfX前噬菌体前后相连,整合于宿主菌染色体proA和yaiC基因间的thrW tRNA基因上;以SfII在前,SfX在后,或SfX在前,SfII在后两种方式排列;而以后一种方式为主,在共50株检测菌株中,有49株为此方式.结论 福氏痢疾杆菌血清型相关噬菌体的整合位点及排列方式,对研究福氏痢疾杆菌血清型转换及血清型相关噬菌体的整合机制具有重要意义.     

福氏痢疾杆菌2b血清型菌株基因组中SfII和SfX前噬菌体整合位点及排列方式研究

目的 研究福氏痢疾杆菌2b血清型菌株中SfII和SfX前噬菌体整合位点及排列方式.方法 根据2b血清型菌株基因组中SFII和SfX前噬菌体可能的整合位点及排列方式,设计引物,对50株2b血清型菌株进行PCR扩增,并对扩增产物测序,根据扩增和测序结果判断噬菌体的整合位点和排列方式.结果 在2b血清型菌株中,SfII和SfX前噬菌体前后相连,整合于宿主菌染色体proA和yaiC基因间的thrW tRNA基因上;以SfII在前,SfX在后,或SfX在前,SfII在后两种方式排列;而以后一种方式为主,在共50株检测菌株中,有49株为此方式.结论 福氏痢疾杆菌血清型相关噬菌体的整合位点及排列方式,对研究福氏痢疾杆菌血清型转换及血清型相关噬菌体的整合机制具有重要意义.     

产CTX-M超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌传播的分子机制研究

目的 研究肺炎克雷伯菌(KPN)中CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因的其传播机制.方法 用K-B药敏法分析53株肺炎克雷伯菌的耐药性;用多重PCR技术扩增ESBLs、AmpC、ISEcp1B、IS903、IS26等插入序列及Ⅰ类整合子,用套式PCR在Ⅰ类整合子寻找β-内酰胺酶基因盒,用长片段PCR扩增ISEcp1B下游的CTX-M型ESBLs全序列并测序.结果 17株肺炎克雷伯菌中检出CTX-M-G1,其中6株同时检出ISEcp1B、TEM、SHV、CTX-M-G1及Ⅰ类整合子,KPN 49、9检出DHA、IS903,KPN 9检出PSE;套式PCR在Ⅰ类整合子内未检出β-内酰胺酶基因,KPN 49整合子内检出二氢叶酸还原酶(dhfr)和核苷转移酶基因(aad2);KPN 49检出CTX-M ESBLs新的基因亚型,全长876 bp,与blaCTX-M-14相比在825 bp处有1个核苷酸不同,导致1个氨基酸不同,第275位由脯氨酸取代谷氨酰胺;KPN 49、9 blaCTX-M-L1ke的上游是ISEcp1B的遗传元件,提供-35及-10位点两个启动子及1个右反向重复序列(转位酶识别位点),下游是插入序列IS903提供反向重复序列组成复合转座子.结论 ISEcp1B可能对下游CTX-M型ESBLs的高水平表达和传播起重要的调控作用.     

鼠疫耶尔森菌基因组核糖体结合部位识别

目的 通过统计分析鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)CO92株中核糖体结合位点(RBS)与翻译起始位点的距离,探索最适合翻译起始的RBS与起始位点的距离.方法 通过对鼠疫菌所有拷贝的16S rRNA 3’端,及已经通过实验确定的177处RBS进行分析,确定鼠疫菌RBS的序列特征.统计鼠疫菌CO92株中存在的所有RBS序列的位置和数量,及RBS序列与翻译起始序列ATG(GTG,TTG,CTG)的距离.观察已经公布的CO92株的编码序列(CDS)片段前20个碱基序列的特征.结果 在CO92的全基因组序列中搜索,共发现可能的RBS结构5081个,2909个后面一段距离内存在开放读码框架,其中1541与标注的CDS相符,535与标注的CDS终止位点相同,但起始位点不同.CO92序列中的3887 CDS前面20个碱基中,57.7％含有RBS序列.结论 RBS序列与起始位点间隔7个碱基和8个碱基出现的次数最多;RBS可能作为基因识别的重要指征.     

多药耐药肺炎克雷伯菌噬菌体原/噬菌体、整合子、转座子、插入序列及质粒遗传标记分析

目的 调查多药耐药肺炎克雷伯菌(MDRKP)中噬菌体原/噬菌体、整合子、转座子、插入序列和质粒等可移动遗传元件遗传标记的存在情况.方法 收集2008年8月-2010年5月6所医院共47株MDRKP,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法,分析12种噬菌体原/噬菌体、3种整合子、7种转座子插入序列和两种质粒共24种可移动遗传元件遗传标记.结果 该组MDRKP共检出1种噬菌体原/噬菌体、1种整合子、6种转座子和插入序列、两种质粒遗传标记.结论 携带Ⅰ类整合子(intⅠ 1)、插入序列(IS26、IS903、ISEcp1、ISKpn6)、耐药质粒(trbC)是该组MDRKP耐药的一个重要原因,MDRKP同时作噬菌体原/噬菌体、整合子、转座子、插入序列和质粒等遗传标记检测为国内首次.     

烧伤创面耐药黄杆菌产β-内酰胺酶机制的初步研究

目的探讨黄杆菌临床分离多重耐药株产生β-内酰胺酶的机制. 方法质粒和染色体抽提以市售试剂盒进行;黄杆菌产β-内酰胺酶用纸片法定性;质粒和染色体携带β-内酰胺酶基因检测用PCR扩增法;PCR扩增产物进行基因测序和同源性比较. 结果纸片法定性显示该菌产β-内酰胺酶;经PCR扩增和产物序列分析表明其染色体和质粒均携带有β-内酰胺酶PSE-1基因. 结论该多重耐药株对β-内酰胺类抗生素的耐药性由染色体和质粒共同介导的PSE-1基因所决定.     

革兰阴性杆菌质粒介导AmpC酶耐药基因型研究

目的:了解我地区革兰阴性杆菌携带质粒介导的AmpC酶的分布情况及基因型别特征。方法:采用Kirby-Bauer琼脂扩散法对临床分离的革兰阴性杆菌进行AmpC酶初筛;头孢西丁三维试验确证AmpC酶;多重聚合酶链反应(PCR)引物扩增ampC基因及序列测序以确定AmpC酶基因型别。结果:653株革兰阴性杆菌中共筛查出26株产质粒AmpC酶菌株(检出率为3.98%),主要分布于克雷伯菌属、大肠埃希菌以及沙雷菌属。PCR扩增和测序结果证实有25株为DHA-1型,1株为CIT型。结论:我院存在质粒介导AmpC酶流行菌株,质粒AmpC酶主要以DHA-1型为主。     

产气肠杆菌携带基因bla_(NDM-1)的质粒特征及基因环境分析

目的了解产气肠杆菌携带bla_(NDM-1)质粒的转移性、复制子分型及周围环境。方法产气肠杆菌HNNDM0711为实验菌株,利用接合实验研究其质粒的转移性,对接合子进行稳定性试验,采用质粒复制子分型法对质粒进行分型,利用染色体步移技术对基因bla_(NDM-1)上下游进行测序,使用BLASTN和BLASTP对基因组序列进行比对,使用Vector NTI 11.5.1注释并生成序列管道图,序列通过软件Banklt递交至Genbank。结果产气肠杆菌HN-NDM0711接合实验阳性,阳性接合子稳定传代4 d后,所有克隆株对亚胺培南和美罗培南的最低抑菌浓度(MIC)均未发生变化,基因bla_(NDM-1)均为阳性。质粒复制子为IncA/C型;基因bla_(NDM-1)位于不常见的插入序列ISAba14和IS91之间,在bla_(NDM-1)的上游出现一个Tn3转座子和I型整合子,整合子上含有一个由庞大镶嵌序列构成的少见耐药基因盒。结论 IncA/C型质粒pHN-NDM0711携带基因bla_(NDM-1)及耐药基因盒,可能源于不同抗菌药物选择压力下的基因重组,建议严格控制临床、工业和农业抗菌药物的使用,从源头上减少此类细菌的产生。     

插入序列ISAba1及IS1133在鲍氏不动杆菌临床分离株中的分布

目的分析插入序列ISAba1及IS1133在鲍氏不动杆菌临床分离株中的分布。方法选择分离自2009年1-6月医院门诊和住院患者的各类临床标本分离出的鲍氏不动杆菌172株,使用PCR和PCR产物测序的方法检测插入序列ISAba1和IS1133在临床分离株中的分布。结果 172株中有159株含有ISAba1,阳性率为92.4%,未检出IS1133序列。结论大部分鲍氏不动杆菌临床分离株都含有插入序列ISAba1,可能与多药耐药密切相关。     

临床常见持续高产AmpC β-内酰胺酶菌株中染色质ampD及其突变的研究

目的检测临床常见AmpCβ-内酰胺酶产酶菌株中染色质ampD及其高概率突变位点。方法41株临床常见AmpCβ-内酰胺酶产酶菌株(阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌)分离自医院感染患者样本,头孢西丁三维试验确定持续高产产酶类型,经抽提细菌染色质DNA,PCR法扩增ampD基因并连接入pMD19-T载体,双链测序后与同种非突变标准菌株的ampD序列比对,得到高概率突变位点。结果41株细菌的基因组中,使用PCR法扩增出染色质ampD基因有36株,并成功测定了其ampD基因的序列;并且统计出突变率50.00%的位点,其中阴沟肠杆菌有62个,肺炎克雷伯菌1个,鲍氏不动杆菌23个,铜绿假单胞菌4个。结论ampD基因不伴随ampC基因同时存在;ampD基因的高概率突变位点可能成为致持续高产酶的关键位点。     

利用插入序列IS285对云南玉龙鼠疫耶尔森菌进行初步分析

目的了解新发现的玉龙鼠疫菌的遗传特征，分析其与中国各型鼠疫菌的亲缘天系。方法根据鼠疫菌C092株基因组DNA中的6个IS285位点设计引物，利用聚合酶链反应（PCR）对五龙鼠疫菌及我国其他各型鼠疫菌进行分析，通过SPSS软件对结果进行聚类。结果与CO92相比，我国鼠疫菌的某些IS285位点存在变异。5株玉龙鼠疫菌中有4株结果一致，另1株的一个位点发生变异。通过6个位点的PCR，可以将我国鼠疫菌聚为8类。所研究的5株玉龙鼠疫菌分别属于2种聚类，其中4株与滇西纵谷型、滇闽居民型及大部分灰旱獭菌株、全部喜马拉雅旱獭菌株聚为一类。结论对玉龙鼠疫菌的遗传特征获得初步了解，提示玉龙菌株在我国鼠疫菌传播演化过程中可能具有较重要地位．     

产气荚膜梭菌α毒素基因片段克隆的测序与应用

目的为了获得A型产气荚膜梭菌C57株α毒素基因片段克隆质粒,作为实时定量PCR检测标本产气荚膜梭菌标准,以备临床应用。方法采用两轮高保真PCR扩增A型产气荚膜梭菌C57株α毒素基因片段(Cpa900),经EcoRⅠ酶切后插入质粒pUC19并连接,构建重组质粒pUC19-Cpa900,转化大肠埃希菌Top10感受态菌株并予以增菌后测序,并提取质粒进行实时定量PCR测试。结果 pUC19下游引物匹配Cpa900上、下游引物双PCR筛选电泳结果表明,116-2株中含单拷贝、反向插入pUC19的Cpa900,并为测序结果所证实;测序结果表明,克隆片段与美国典型菌种保藏中心标准株ATCC 13124的全基因序列CP000246.1中的磷脂酶C(PLC)基因(CPF_0042)相应序列相比,符合率高达99.8%;变异位点不在两实时定量PCR引物和探针区,经实时定量PCR实测对扩增效率无影响,完全可用作实时定量PCR检测标准。结论 A型产气荚膜梭菌α毒素克隆片段序列高度保守,作为模板具有高扩增效率,可作为标准品用于实时定量PCR检测A型产气荚膜梭菌,质粒引物匹配插入片段双引物双PCR筛选转化菌株,不但可鉴定阳性克隆,还能确定重组质粒中插入基因拷贝数量和插入方向、有效避免假阳性,不失为很好的筛选方法。     

利用串联重复序列研究炭疽芽胞杆菌的基因分型

目的 应用基因组中多位点串联重复序列遗传标记对不同地区88株炭疽芽胞杆菌进行基因分型。方法炭疽芽胞杆菌染色体DNA基因组中存在着串联重复序列。在串联重复序列两侧设计引物，PCR扩增，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶影像分析软件对PCR扩增产物碱基含量进行测算，并与测序结果进行比较，计算出串联重复拷贝数，对拷贝数进行聚类分析。结果 （1）聚类分析发现，88株菌株可分为三大群，45个基因型，基因型与生态环境存在一定的关系。就某一地区炭疽暴发而言，其可变数目串联重复序列遗传标记具有相似性。（2）研究发现，A16R疫苗株作为中国的疫苗株具有代表性。结论 炭疽芽胞杆菌基因组中的串联重复序列具有遗传稳定性和特异性，可作为炭疽芽胞杆菌基因分型的指标，在炭疽暴发和生物恐怖事件中的病原体溯源上具有重要的意义。     

鼠疫耶尔森菌遗传学研究进展

染色体、质粒作为鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的遗传基础,决定着鼠疫菌的生物学特征及致病力.在现有的鼠疫菌全基因组序列中,各型菌株基因组都表现出G+C含量偏差、存在丰富的插入序列、大量的假基因及频繁的基因重组等特征,这些都是鼠疫菌迅速进化的关键.鼠疫菌遗传学通过基因组学、比较和进化基因组学的研究,确定鼠疫菌对人体的毒力因子和致病机制,探索鼠疫菌致病性和进化的遗传学机制,从而为鼠疫的流行监测及疫苗研制等防治工作提供科学的理论依据.