细菌核糖体23 S亚单位基因芯片在感染性疾病快速诊断中的应用研究

目的研究建立快速检测细菌DNA的方法,建立含有10种细菌探针的检测用基因芯片模型. 方法使用合成的扩增细菌核糖体23 S亚单位(23S rDNA)寡核苷酸探针,制备基因芯片;设计23S rDNA通用引物,应用PCR(聚合酶链反应)法,扩增细菌核糖体23S亚单位基因(23S rDNA),扩增后产物与芯片上的探针杂交,用荧光扫描仪检测信号;对23种临床常见致病菌、培养物及临床病例标本采用本方法进行检测,并与常规细菌培养法比较. 结果基因芯片检测临床致病菌具有较高的特异性和灵敏性. 结论利用寡核苷酸探针基因芯片检测系统具有一定的种属鉴别能力,比常规培养法快速、准确.     

荧光原位杂交法快速鉴定临床标本中的常见病原菌

目的建立一种快速检测临床标本中常见病原菌的方法. 方法采用荧光同位素标记的,针对细菌核糖体16s rRNA或真菌18s rRNA序列互补的DNA寡核苷酸探针,将标本涂片后于50℃下杂交1h,同时将标本转种培养基平板,阳性标本采用VITEK仪器法鉴定,评价杂交法的特异性和灵敏度. 结果杂交法与仪器法测定了 103份临床标本,杂交法的特异性和灵敏度分别为88.5%和88.7%,两法一致率为90.3%. 结论该方法适用于临床标本中常见病原菌的快速鉴定.     

应用长臂光敏生物素核酸探针检测医学真菌的研究

[目的]建立PCR结合长臂光敏生物素核酸探针杂交检测医学真菌的方法。[方法]首先合成医学真菌通用引物，用PCR扩增白色念珠菌18S rRNA基因，用长臂光敏生物素标记纯化的扩增产物作为核酸探针，然后用此探针对PCR后的基因扩增产物进行Southern杂交检测医学真菌。通过用白色念珠菌感染人鼠，建立念珠菌病的实验动物模型，验证血培养法、PCR法和PCR扩增及Southern杂交检测医学重要真菌的敏感性。[结果]通用引物可以扩增白色念珠菌、热带念珠菌、新型隐球菌、黄曲霉菌、烟曲霉菌等9种医学常见真菌的18S rRNA基因，扩增片段长度为621-687bp。此引物只扩增真菌DNA，不扩增临床常见的细菌、病毒和哺乳动物组织细胞DNA。利用实验动物模型比较了血培养法、PCR法和PCR扩增及长臂光敏生物素核酸探针Southern杂交法检测真菌血症的灵敏度，实验证明后者的敏感性最高。[结论]本方法快速、敏感、不需放射性同位素，有较好的临床应用前景。     

通用真菌引物和探针检测人全血标本中侵袭性真菌DNA载量的方法

目的 建立实时定量PCR(RQ-PCR)以真菌通用引物和探针快速准确检测人全血标本中侵袭性真菌DNA载量的方法,并与细菌相鉴别及进行初步临床应用.方法 选择临床常见的真菌基因组多拷贝基因5.8S rDNA作为靶基因设计特异性通用真菌引物和TaqMan探针,采用QIAamp(R)血液DNA小提试剂盒提取多种致病真菌基因组DNA,建立20μl RQ-PCR反应体系,对含有不同载量致病真菌的模拟人全血标本和71份外科发热患者全血标本进行侵袭性真菌基因组的定量检测.结果 本方法的特异性良好,检测限为101拷贝/μl上机待测液(即约105拷贝/ml全血);检测灵敏度和特异度分别为95.5％和97.6％,阳性预告值和阴性预告值分别为98.7％和92.0％;标准曲线R2在0.9931～ 0.9977;批内及批间平均变异系数分别为(10.4±4.0)％和(27.9±2.0)％;人血标本中真菌基因组DNA平均回收率为(91.0±7.6)％,相对回收率平均变异系数为(14.9±4.0)％.71份外科发热患者血标本中未检测出侵袭性真菌基因组.结论 RQ-PCR可以借通用真菌引物和TaqMan探针快速、特异、灵敏地定量检测人血标本中侵袭性真菌DNA的载量并可与细菌相鉴别,且有着较好的准确度与精密度.外科发热患者血中侵袭性真菌基因组的存在率可能很低.     

实时荧光PCR方法分型检测细菌16S rRNA基因的临床应用

目的建立快速、准确、特异的检测细菌16S rRNA基因的实时荧光PCR法。方法根据Taq Man探针技术实时荧光PCR反应原理结合细菌16S rRNA基因序列,在高保守区域设计通用引物和特异性探针,对10种标准菌株及15种临床培养分离菌株进行PCR检测,优化反应体系,评价该方法的特异性、灵敏度、重复性,并对187份标本采用培养法和实时荧光PCR法进行检测比较。结果 10种标准株和15种临床培养株采用通用引物检测全阳性,9株革兰阳性菌株通过革兰阳性探针检测全阳性,16株革兰阴性菌株通过革兰阴性探针检测也全阳性。187例临床标本经实时荧光PCR检测阳性率为16.22%(30/185),培养法检出率为9.73%(18/185),2种方法革兰菌分型结果一致,细菌检出率前者明显高于后者,差异有统计学意义(P0.05)。结论多探针实时荧光PCR法检测细菌16S rRNA具有敏感性高、特异性强、方便快捷等特点,可在细菌感染性疾病中给临床医生提供更全面的病原学资料,早期指导抗生素的应用。     

病毒感染的快速诊断——核酸杂交检测法

病毒核酸检测法在病毒感染的快速诊断方面具有许多潜在优势。该法可确定病毒基因组的核苷酸序列,并可由此制备具高度特异性的探针。核酸股相互间的高亲和力使杂交法具有很高的灵敏度,而分子克隆技术又为制备大量标准化检测剂提供了可能条件。核酸杂交试验现已用于检测临床有关样本的病毒核酸。DNA 是一种极稳     

巢式PCR检测人乳头状瘤病毒的方法学建立及临床应用

目的建立巢式PCR(nPCR)检测人乳头状瘤病毒的方法学及作临床应用。方法以MY09/MY11为外引物,GP5+/GP6+为内引物建立nPCR,优化体系,评价其特异性和灵敏度,同时检测了54例HPV DNA阳性、4例弱阳性、42例阴性的标本,与基因导流杂交法作一致比较。结果检测到单一目的片段;最低能检测到1∶16 384稀释的HPV18阳性对照品,明显高于MY09/MY11方法;nPCR法检测到60例HPV DNA阳性标本,40例HPV DNA阴性的标本,与基因导流杂交法具有较好的一致性(χ2=39.518,P0.001;Kappa=0.628,P0.001)。结论所建立的nPCR具有较好的特异性和灵敏度,与基因导流杂交法具有较好一致性。     

PNA与DNA探针对漏声表面波传感器特异性的影响

目的探讨以PNA作为杂交探针与普通的DNA探针相比,在漏声表面波生物传感器生物杂交反应中的优越性。方法用巯基固定法将PNA、DNA两种探针分别固定在漏声表面波生物传感器的金膜表面,分别与完全匹配、1个及2个碱基错配的靶序列进行杂交反应,观察两种不同的探针与靶序列反应所引起的相位变化及反应平衡时间。结果与DNA探针相比,PNA探针识别碱基错配的能力显著提高,且杂交平衡时间更短。结论 PNA探针可提高漏声表面波生物传感器的检测特异性。     

临床标本中未知病毒基因芯片检测方法探索

目的探索可用于检测临床标本中未知病毒的基因芯片技术。方法设计合成1～4型登革病毒基因芯片探针,制备成登革病毒基因芯片。提取1～4型登革病毒标准毒株的核酸RNA,以phi29DNA聚合酶结合带标签序列的随机引物进行全基因组扩增,再以Cy3荧光染料标记的标签序列引物进行PCR随机扩增标记,标记产物进一步用登革病毒芯片进行杂交检测,随后用广州白云机场出入境检验检疫局国境口岸收集的登革热病人血清标本对新建立的方法进行验证。结果1～4型登革病毒标准毒株培养液提取的RNA,经扩增、标记及芯片杂交检测,相应探针阵列均可检测到明显杂交信号,探针阳性率均达100％;从3份临床登革热病人血清标本中提取的RNA,同样也可得到明显的杂交信号,而背景干扰信号很低,从相应达到100％探针阳性率的探针阵列可判断,3份病人血清标本中分别为含1、2、3型登革病毒。结论该研究新建立的基因芯片方法,可用于检测临床血清标本中的登革病毒,如果设计更多针对不同病原体的特异性芯片探针,该方法还可用于临床标本中一些未知病原体的鉴定。     

实时荧光定量RT-PCR快速检测星状病毒方法的研究

目的建立以特异性荧光探针为特点的Taq Man荧光定量RT-PCR检测星状病毒。方法根据星状病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析荧光定量RT-PCR的重复性、特异性、敏感性;以所建立方法对128例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果所建立的荧光定量RT-PCR检测方法对星状病毒具有很好的特异性和重复性,灵敏度达102copy/μl。128例粪便标本中星状病毒的检出率为3.1%,与基因测序比对结果相符。结论构建的星状病毒荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异且灵敏的特点,可用于临床病原诊断和流行病学调查。     

常见7种食源性致病菌xMAP液相芯片快速筛查方法的建立及应用

目的采用xMAP液相悬浮芯片检测方法,建立一管同时检测金黄色葡萄球菌、沙门菌、副溶血弧菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7、创伤弧菌和空肠弯曲菌的快速筛查方法。方法根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌肠毒素nuc基因、沙门菌侵袭性基因ssaR、副溶血弧菌通用基因toxR、单增李斯特菌的hlyA基因、大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因、创伤弧菌的vvh基因和空肠弯曲菌的gyrA基因,设计特异性引物和探针,利用上游引物和生物素标记的下游引物对7个靶序列进行不对称实时PCR扩增,7重实时PCR扩增产物和制备的7种偶联探针的微球在同一体系中进行杂交,最后利用藻红蛋白和生物素的亲和作用报告荧光,从而建立7种食源性致病菌的xMAP液相悬浮芯片检测法。结果 xMAP液相悬浮芯片体系检测140株菌株,均出现特异性荧光中值信号,7种食源性致病菌检测互不干扰。DNA和菌液检出限分别为1～100ng和105～108cfu/ml对56份各类食品标本进行检测,检出金黄色葡萄球菌2份、沙门菌4份、副溶血弧菌7份、单增李斯特菌1份、创伤弧菌3份,未检出大肠杆菌O157∶H7和空肠弯曲菌,此结果与传统方法分离结果相一致。结论xMAP液相悬浮芯片技术从样品处理到检测结果需3.5h左右,该方法可应用于食品安全风险监测中食源性致病菌的快速筛查和食源性致病菌的分型鉴定。     

基于非对称发夹探针的杂交链反应技术应用于病原菌检测的实验研究

目的 应用基于非对称发夹探针的杂交链反应技术,检测肺炎克雷伯菌不对称PCR产物,建立一种新的病原菌快速检测方法.方法 采用Array Designer 4.0软件,针对肺炎克雷伯菌的16S rDNA可变区域设计非对称发夹式DNA探针,优化探针浓度,以不对称PCR扩增肺炎克雷伯菌16rDNA可变区所制备的单链DNA为靶序列,采用HCR进行检测和分析.结果 HCR体系中发夹探针最佳浓度为1μmol/L;当靶序列初始浓度≥0.05μmol/L时,通过琼脂糖凝胶电泳可观察到明显的HCR聚合物;不对称PCR法制备的单链DNA可以启动杂交反应.结论 应用基于非对称发夹探针的杂交链反应技术检测病原菌具有反应体系简单,无需酶促反应等优点,可对血流感染病原菌基因组进行简便、快速、特异的检测.     

通用型基因悬浮芯片检测生物恐怖细菌的方法研究

目的 建立快速、高通量的基因悬浮芯片检测方法,用于生物恐怖病原体的快速筛检.方法 选择保守的细菌16 S rDNA序列,并针对炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis,B.a)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis,Y.p)、布鲁菌属(Brucella spp.,Bru)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis,F.t)和类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,B.p)等5种生物恐怖细菌设计种(属)特异性探针,经16 S rDNA通用引物341A、519B扩增基因组DNA,用基因悬浮芯片方法进行检测,并对方法的灵敏度、特异度、重复性、检测能力进行验证.结果 经16 S rDNA通用引物扩增,特异性探针杂交检测,能将样本细菌鉴定到属水平,同属菌出现交叉反应;检出限分别为类鼻疽伯克霍尔德菌1.5 pg/μl,布鲁菌属20 ps/μl,炭疽芽孢杆菌7 pg/μl,土拉弗朗西斯菌0.1 pg/μl,鼠疫耶尔森菌1.1 pg/μl;15次重复检测各探针变异系数(CV)为5.18%～17.88%,具有较好的重复性;方法可正确检出模拟白色粉末样本中炭疽芽孢杆菌和鼠疫耶尔森菌.结论 建立了通用型基因悬浮芯片检测体系快速高通量筛查生物恐怖细菌的方法.     

多重半套式聚合酶链反应在检测脑脊液病原菌中的应用

目的：建立多重半套式聚合酶链反应（PCR）快速检测脑脊液标本中常见的病原菌。方法：通过对病原菌16S rRNA基因保守区和变异区的序列分析，设计通过引物及革兰阴性菌、革兰阳性菌的特异性引物，分别作为外、内侧引物，对脑脊液标本中不同细菌的DNA进行多重半套式PCR扩增；同时与常规细菌培养法作比较，并检测了该方法的敏感性。结果：外侧扩增后革兰阳性菌、革兰阴性菌经扩增后均有长约1032bp的片段产生；内侧扩增两种细菌除1032bp的产物外，革兰阳性菌另有一336bp的特异性产物，革兰阴性菌另有一127bp的特异性产物。该方法最低可检测出8cfu/ml的大肠埃希菌；62份脑脊液标本扩增结果与培养法相比，敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预没值分别为93．8％、5．7％、88．2％、97．8％。结论：多重半套式PCR方法能特异、敏感、快速地检测出脑脊液感染的常见病原菌。     

Molecular methods in the diagnosis of infectious diseases

In the long term, many of the conventional diagnostic approaches to detection and characterisation of infectious diseases is complemented or even replaced by recognition of DNA/RNA specific sequences. The molecular procedures are based on two distinct types of methods--nucleic acid hybridization techniques with specific molecular probes, and DNA amplification by the polymerase chain reaction PCR. In the first method DNA fragments generated by restriction endonucleases are separated by electrophoresis, transferred to proper membrane and annealed with specific oligonucleotides which are labelled with 32P or with a non-radioactive marker. PCR reaction utilizes a DNA extension enzyme (polymerase) which can add nucleotide bases to primers once a template is provided. Oligonucleotides primers have to recognize target molecule. The single cycle is then repeated and each time DNA segments are doubled. Multiplex polymerase chain reactions have been designed to identify an organism as well as its virulence-specific sequences or antibiotic resistance plasmids simultaneously. The major drawback of PCR procedure which result from its exquisite sensitivity have to be consider. The problem is contamination and many strategies have been developed to avoid it. To these research tools were added probes for in situ hybridization. Advantages provided by this technique include the ability to detect latent (non-replicating) viruses and to localize their genomes to nuclear or cytoplasmic regions within cells. Nucleic acid probes or the hybridization conditions can be manipulated so that a broad spectrum of genotypes could be detectable. This is particularly valuable in those emerging infections where the individual serotypes are unknown. Recombinant DNA approaches have now been described for detection of a wide range of infectious agents. Some remain research activities, others are more appropriate to the routine diagnostic laboratory. An understanding of a pathogen's life cycle and the host's responses to the infectious agent is enhanced by characterisation of the former's genome using molecular technology. The spread of epidemics or hospital-acquired (nonsocomial) infections is followed and characterised with more accuracy by the identification of unique DNA fingerprints for individual pathogens. The prospects for molecular medicine in microbiology are vast and will have profound effects in laboratory and clinical practice.     

手足口病病原液相芯片检测方法的建立

目的：建立检测手足口病病原的液相芯片方法。方法：设计、合成并修饰基因特异性引物和寡核苷酸探针,将寡核苷酸探针和荧光编码微球进行偶联,制备液相芯片;将样本核酸多重PCR扩增产物与液相芯片进行杂交,并通过液相芯片检测仪读取检测结果。结果：同时检测多种肠道病毒（EV）,肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CAV16）的病毒核酸最低检出量均为1pg,检测特异性高。与参照方法相比,EV、EV71、CAV16的检测灵敏度分别为：91．4％、92．9％、100．O％,检测特异度分别为100．0％、97．1％、98．2％,检测准确度分别为：100．0％、96．3％、87．5％。结论：构建的检测手足口病病原的液相芯片方法,具有高通量、灵敏度高、特异性强和检测时间短等优点,为手足口病的快速诊断奠定了基础。     

分子检测与常规培养在中重度皮肤软组织感染病原学诊断中的比较

目的探讨分子检测方法在中重度皮肤软组织感染(SSTI)病原诊断中的可行性。方法收集2016年1—10月北京大学第一医院整形烧伤外科收治的中重度SSTI病例,符合入组标准共50例,留取伤口深部组织,分别行常规培养及细菌涂片检查;提取各标本DNA,以9种常见细菌基因组保守区为靶序列,设计特异性引物行PCR-膜杂交法检测细菌结果;将分子检测、常规培养及涂片的结果进行比较。结果常规培养38份阳性,分子检测结果28份阳性,细菌涂片仅8份阳性,培养结果在检测的9种细菌范围内,分子检测与常规培养检查结果的完全符合率为82.1%(32/39),分子检测结果为多种细菌,而培养结果为单一细菌者占7.7%(3/39);分子检测结果为阳性而培养结果为阴性者占5.1%(2/39)。结论分子检测技术可以对中重度SSTI常见致病菌进行检测及鉴定,并在复合细菌混合感染的病原检测中更具优势。     

应用通用引物PCR检测诊断细菌和真菌性中枢神经系统感染的价值

目的了解细菌和真菌性中枢神经系统（CNS）感染病原谱,并探讨通用引物聚合酶链反应（PCR)检测技术的病原学诊断价值。方法收集某院2009年1月—2015年3月疑似或确诊CNS细菌或真菌性感染患者资料,分析其脑脊液培养病原菌种类,采用细菌16S rRNA和真菌28S rRNA通用引物对患者脑脊液DNA进行PCR扩增和序列测定,并与同期脑脊液培养及鉴定结果进行比较。结果共收集确诊或疑似CNS细菌或真菌感染者400例,其中脑脊液培养阳性132例。共分离病原菌150株,其中革兰阳性菌48株,革兰阴性菌90株,真菌12株;居前3位的细菌为鲍曼不动杆菌（32株）、凝固酶阴性葡萄球菌（16株）和肺炎克雷伯菌（13株）;最常见真菌为新生隐球菌（8株）。选取88份感染患者脑脊液标本和20例非感染患者脑脊液进行PCR扩增,PCR扩增法灵敏度（35.23％,31/88）高于培养法（28.41%,25/88）（χ2＝4.17,P＜0.05）。PCR扩增和培养法阴性预测值分别为25.97%、24.10%,两种方法的特异度、阳性预测值均为100.00%。PCR扩增测序与培养结果符合率为84.00%（21/25）;PCR检测平均报告时间（48 h）较培养结果报告时间（细菌平均约72 h,真菌平均约96 h）更快速。结论CNS 感染病原分布广泛,以革兰阴性菌为主;通用引物PCR检测具有快速、灵敏、准确等特点,具有良好的临床推广和应用价值。     

导流杂交基因芯片技术在肠道致病菌检测中的应用研究

目的建立导流杂交芯片技术检测粪便标本中8种肠道致病菌。方法以细菌16S rDNA和23S rDNA序列设计通用引物和寡核苷酸探针,将活性氨基标记的探针依次固定在BiodyneC膜上,制成检测芯片,用标记生物素的引物进行PCR扩增,将扩增产物与检测芯片在核酸分子快速杂交仪上进行杂交,以POD和TMB进行显色,判断结果;应用该方法检测8种肠道致病菌标准菌株和120份腹泻患者粪便标本,通过细菌培养结果比较该方法的有效性。结果120份临床粪便标本中,采用导流杂交芯片共检出68份（56.67%）携带肠道致病菌;细菌培养鉴定出63份（52.50%）携带肠道致病菌,其中58份导流杂交芯片与细菌培养结果一致,准确率为85.29%。结论导流杂交芯片技术能够快速准确检测8种常见肠道致病菌,而且适用于流行病学调查研究。