反义caveolin-1对实质肿瘤细胞中β3-半乳糖基转移酶7表达的调节作用

目的:研究反义caveolin-1对实质肿瘤细胞中β3-半乳糖基转移酶7(β3GalT7)表达的调节,以期阐明caveolin-1与β3GalT7的相关性。方法:运用脂质体介导转染人工合成的caveolin-1反义核苷酸(ASODN)至人类4种实质肿瘤细胞中,通过荧光显微镜、RT-PCR及蛋白质印迹检测β3GalT7表达的变化。结果:转染反义caveolin-1后的4种实质肿瘤细胞中β3GalT7均有明显的增强。结论:表明caveolin-1调节肿瘤细胞中β3GalT7的表达,且与β3GalT7的表达呈负相关。     

β1—4半乳糖基转移酶受体底物的动力学

研究β1-4半乳糖基转移酶（β1-4GT）与受体底物的亲和性、其底物的天线偏爱性以及糖基对亲和性的影响，以及β1-4GT对不同底物的天线特异性（branchspecificity）。用两种荧光标记的底物1（Gnβ1－2Mal－6（Gnβ1—2Mal－3）Mβ1－4Gnβ1—4Gn－PA）和底物2（Gnβ1－2Mal—6（Gnβ1－2Mal－3）Mβ1—4Gnβ1－4（Fucal－6）Gn－PA），用正常雄性大鼠的肝组织的高尔基体作为酶，测定β1－4GT的不同底物的Km值[1]。结果：底物1和2的Km值分别为2．31×10－3mol／L和3.12×10－3mol／L；对底物1，α1，3天线的N-乙酰氨基葡萄糖基比α1，6天线的反应性强，形成Gnβ1－2Mal－6（Gβ1－4Gnβ1－2Mal—3）Mβ1—4Gnβ1－4Gn—PA产物是Gβ1－4Goβ1—2MQl一6（Goβ1－2Mal－3）Mβ1－4Gnβ1－4Gn－PA的2．10倍左右；对底物2，α1，3天线的N-乙酰氨基葡萄糖基比α1，6天线的反应性更强，形成Gnβ1－2Mal－6（Gβ1－4Gnβ1－2Mal－3）Mβ1－4Gnβ1－4（Fucα1－6）Gn－PA的产物是Gβ1－4Gnβ1－2Mal－6（Gnβ1－2Mal－3）Mβ1－4Gnβ1－4（Fucα1—6）Gn－PA的4.59倍左右。结论：核心岩藻糖对酶与受体底物的亲和性有一定影响。     

正、反义β1，4半乳糖基转移酶—I表达质粒的构建

目的：为了探讨不同β1,4半乳糖基转移酶-1（β1,4-galactosyltransferase I, β-1,4-GalT-1）表达水平的生物学意义。方法；通过分子生物学手段，构建正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒。设计β-1,4-GalT-I全长引物；提取小鼠脑总RNA，通过RT-PCR方法，得到全长β1,4-GalT-I基因片段，将其克隆到pGEM-T载体。再通过多克隆酶切位点，将β-1,4-GalT-I全长序列克隆到pcDNA3.1表达载体中。设计反义引物，以pGEM-β1,4-GalT-I质粒为模板，将P CR产物克隆到pcDNA3.1表达载体中。通过酶切和测序鉴定构建的质粒。结果：通过酶切和测序证实，实验得到了正义、反义β-1,4-GalT-I表达质粒。结论：正、反义β-1,4-GalT-I表达质粒的构建，为进一步研究不同β-1,4-GalT-I表达水平的生物学意义奠定基础。     

在大鼠诱发肝癌中β1，4半乳糖基转移酶的高效液相层析测定

研究大鼠诱发肝癌与β１，４半乳糖基转移酶（β１，４ＧＴ）的相关性。用高效液相层析（ＨＰＬＣ）纯化了荧光标记的受体底物（Ｇｎβ１－２Ｍα１－６（Ｇｎβ１－２Ｍα１－３）Ｍβ１－４Ｇｎβ１－２Ｇｎ－ＰＡ），用β１，４ＧＴ的荧光标记受体底物的ＨＰＬＣ测定方法测定了大鼠诱发肝癌中肝组织的酶活性，发现随着诱癌周数的增加，肝脏酶活性逐渐增高，在第１４周癌前期时酶活性达到最高，以后有所回落，但仍保持在高于对照组的水平。同时我们也发现，在胎鼠（孕２０ｄ）及出生第一天中酶活性与癌前期相似，说明在肝组织增生期此酶非常活跃。     

人类β3GnT8/β3GalT7对人4IgB7-H3蛋白的翻译后糖基化修饰作用

目的探讨人类β1,3N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶8/β3半乳糖基转移酶7（β3GnT8/β3GalT7）与人4IgB7-H3蛋白的相互作用,以期阐明该糖基转移酶对人4IgB7-H3蛋白的翻译后糖基化修饰作用。方法在线预测软件预测人4IgB7-H3蛋白氨基酸序列上潜在的糖基转移酶作用位点;免疫共沉淀探讨β3GnT8/β3GalT7与人4IgB7-H3蛋白的相互结合作用;细胞免疫荧光化学技术研究两种蛋白质在细胞内的空间定位。结果人4IgB7-H3蛋白氨基酸序列上潜在的N-糖基化位点共有8个,O-β-GlcNAc的附着位置共有18个;β3GnT8/β3GalT7与人4IgB7-H3蛋白能相互结合而被共沉淀;两种蛋白质能在人肺癌A549细胞中共定位。结论人类β3GnT8/β3GalT7可能对人4IgB7-H3蛋白有糖基化修饰作用。     

β-1,4-半乳糖基转移酶的研究进展

β -1,4-半乳糖基转移酶在高尔基体上通过合成 β -1,4糖苷键进行重要的蛋白质糖链修饰作用。同时 β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ在细胞膜上 ,参与多种细胞的增殖、迁移、粘附等信号识别。随着许多编码蛋白具有 β -1,4-GalT活性的新基因被克隆出来 ,有关它们的结构、底物、功能等成为研究热点     

β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅱ、Ⅴ表达的亚细胞结构定位研究

目的 :研究 β1,4-半乳糖基转移酶II和V(β1,4-galactosyltransferaseⅡandⅤ ,β -1,4-GalT -ⅡandⅤ )蛋白表达的亚细胞结构定位。方法 :构建 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ融合绿色荧光蛋白 (greenfluorescenceprotein ,GFP)表达质粒 ,分别将构建的质粒转染到PC12细胞和肝癌 772 1细胞中 ,荧光显微镜下观察 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ在其中表达的亚细胞结构定位。 结果 :β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ主要表达在这两种细胞细胞核旁的高尔基复合体。结论 :β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ主要分布在高尔基复合体上 ,提示它们可能是在高尔基复合体参与蛋白质的糖链修饰     

β-1，4半乳糖基转移酶-Ⅰ对雪旺氏细胞增殖的影响

目的：探讨周围神经雪旺氏细胞表达β-1，4-半乳糖基转移酶-Ⅰ(β-1，4-galactosyltransferase Ⅰ，β-1，4-GalT-Ⅰ)对其增殖的影响。方法：构建正、反义β-1，4-GalT-Ⅰ表达质粒，将其转染到分离培养的雪旺氏细胞中；运用细胞计数分析转染细胞倍增时间、培养细胞3H-TdR掺入检测转染细胞增殖程度；应用流式细胞仪分析转染细胞的细胞周期变化。结果：转染正义β-1，4-GalT-Ⅰ后雪旺氏细胞的增殖受到抑制，且这种抑制作用随转染浓度增大而增强。而转染反义β-1，4-GalT-Ⅰ有相反的作用。转染正义β-1，4-GalT-Ⅰ后，雪旺氏细胞周期主要被阻滞在G1／G0期。结论：β-1，4-GalT-Ⅰ对雪旺氏细胞的增殖有抑制作用，可能在周围神经雪旺氏细胞的有序增殖过程中发挥重要作用。     

雪旺氏细胞表达β-1，4半乳糖基转移酶-Ⅰ对神经元轴突生长的影响

为了探讨周围神经雪旺氏细胞中不同β-1，4半乳糖基转移酶-I(β-1，4-galactosyltransferase 1，β-1，4-GalT-I)表达水平对神经元轴突生长的影响，本实验首先构建了正、反义β-1，4-GalT-I表达质粒；然后将构建的不同浓度的正、反义表达质粒超表达于分离、纯化的大鼠雪旺氏细胞；最后将转染的雪旺氏细胞与分离的大鼠背根神经节共培养，根据共培养神经元轴突延伸的数目和面积，分析雪旺氏细胞中不同β-1，4-GalT-I表达水平对神经元轴突生长的影响。结果发现：转染正义β-1，4-GalT-I的雪旺氏细胞能促进共培养神经节轴突的长出和延伸。在一定的转染浓度内，这种促神经生长作用随转染浓度增大而增强，而转染反义β-1，4-GatT-I却有相反的作用。提示周围神经雪旺氏细胞中表达β-1，4-GalT-I可能在维持正常神经的功能和促进损伤神经的修复发挥重要作用。     

β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ影响雪旺细胞衰老的研究

目的:探讨β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ与雪旺细胞衰老的相关性.方法:以不同浓度的β-1,4-GalT-Ⅰ表达质粒转染雪旺细胞,观察衰老相关半乳糖苷酶染色情况.以Ha-Ras转染雪旺细胞诱导衰老,采用Northern blot 方法检测转染后不同时间β-1,4-GalT-Ⅰ表达变化.结果:随着转染β-1,4-GalT-Ⅰ表达质粒浓度的提高,细胞衰老相关半乳糖苷酶染色阳性率增高;随着Ha-Ras转染时间的延长,β-1,4-GalT-Ⅰ表达逐渐增高.结论:β-1,4-GalT-Ⅰ与雪旺细胞的衰老相关,并可能在周围神经雪旺细胞的增殖调节中发挥重要作用.     

共刺激分子B7-H3与糖基化相关性的初步探讨

目的：探讨共刺激分子B7-H3与N．乙酰氨基半乳糖转移酶之间的相关性。方法：采用RT-PCR的方法检测同一细胞系上B7-H3和N．乙酰氨基半乳糖转移酶（T1-T7）的表达，从而探讨它们之间可能的相关性。结果：成功地检测到了B7-H3与N．乙酰氨基半乳糖转移酶（T1-T7）表达的差异性和一致性。结论：共刺激分子B7-H3和N-乙酰氨基半乳糖转移酶（T1-T17）在T1、T2存在可能的结合点，为进一步的研究提供了线索。     

原发性肝癌患者血清可溶性B7-H4的检测及其临床意义

目的：检测原发性肝癌患者血清中可溶性B7-H4（sB7-H4）的水平并探讨其临床意义。方法：应用ELISA夹心法检测38例原发性肝癌患者与51例正常人血清sB7-H4水平,探讨其临床意义。结果：原发性肝癌患患者血清sB7-H4水平为（52．90±23．26）μg／L,正常人血清sB7-H4水平（32．67±12．28）μg／L,两者比较差异有显著性意义（P〈0．01）,且原发性肝癌患者血清sB7-H4水平与AFP水平呈正相关;I／II期原发性肝癌患患者血清sB7-H4水平显著高于III／IV期患者;术后原发性肝癌患患者血清sB7-H4水平显著低于术前。结论-原发性肝癌患患者血清sB7-H4水平显著增高,且与临床分期、治疗情况呈正相关,提示sB7-H4可能与原发性肝癌的发病有关,检测sB7-H4对原发性肝癌的诊断及疗效评估有一定的意义。     

小鼠B7-H4重组蛋白的表达及鉴定

目的:构建小鼠B7-H4胞外区基因的真核表达载体,转染酵母细胞以表达mB7-H4,并检测其生物学活性.方法:以mB7-H4的重组质粒为模板,在克隆引物上加入Xho I和EcoR I酶切位点,并用PCR方法扩增得到mB7-H4胞外区的基因片段,经Xho I和EcoR I双酶切后接入酵母表达载体Ppic9上,构建成Ppic9-mB7-H4重组质粒.经双酶切和核酸测序鉴定,将该重组质粒转染至酵母细胞,用PCR、Western Blot及ELISA等方法检测重组基因的表达,并鉴定表达蛋白的生物学活性.结果:转染Ppic9-mB7-H4重组质粒的酵母细胞内表达mB7-H4,诱导表达的mB7-H4能有效抑制CD3单抗活化的T淋巴细胞的增殖(相对抑制率为28.3%)和IL-2(相对抑制率为68.8%)、IL-4(相对抑制率为78.8%)、IL-10(相对抑制率为67.6%)、IFN-γ(相对抑制率为77.7%)等细胞因子的分泌.结论:成功构建了mB7-H4真核表达系统,并获得了有生物学活性的mB7-H4分子.     

pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠体内表达的实验性研究

目的 获得重组pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在肝内的高效稳定表达.方法 采用流体动力法将表达mB7-H4-hIg融合蛋白的真核表达载体输注小鼠体内,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和实时定量PCR(RT-PCR)的方法,定量检测pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠体的内表达.结果 经尾静脉注射的pcDNA3.1/mB7-H4-Fc能在肝组织中稳定表达,在48 h时间点分泌的量达到最高,最大量约120 ng/mL.结论 成功将pcDNA 3.1/mB7-H4-Fc表达载体导入了小鼠肝脏,并获得了pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在肝内的高效稳定表达.     

协同刺激分子B7-H4在恶性肿瘤中的表达意义

协同刺激分子B7-H4是B7家族中的一个新成员,它能通过抑制T细胞的增殖、细胞因子的产生和细胞周期负性调控T细胞的免疫应答,同时大量表达B7-H4可以促进上皮细胞的恶性转化,保护表皮细胞免于失巢凋亡,在肿瘤的发生、进展和转归中发挥重要作用。研究B7-H4在恶性肿瘤中的表达及意义对于临床诊断具有重要作用,也为新的分子靶点治疗恶性肿瘤提供新的策略。     

结直肠癌组织中B7-H1和B7-H4表达与Foxp3+调节性T细胞浸润的关联性

目的：探讨B7-H1和B7-H4在结直肠癌（CRC）组织中的表达及其与肿瘤中Foxp3⁺调节性T细胞（Treg）浸润的关系,为判定CRC的生物学行为及预后提供依据。方法：免疫组织化学法检测56例CRC患者肿瘤标本及癌旁正常组织样本中B7-H1、B7-H4蛋白的表达和Treg的浸润情况,并与CRC患者的临床病理特征进行关联性分析。结果：CRC患者CRC组织中B7-H1阳性表达率高于癌旁正常组织（χ²=72.34,P<0.01）。不同浸润深度的CRC组织中B7-H1表达频数比较差异有统计学意义（P<0.01）;淋巴结转移阳性者CRC组织中B7-H1高表达频数高于淋巴结转移阴性者（P<0.01）;Duke's分期C+D者CRC组织中B7-H1高表达频数高于Duke's分期A+B者（P<0.01）。CRC组织中B7-H4阳性表达率高于癌旁正常组织（χ²=78.92,P<0.01）。不同浸润深度的CRC组织中B7-H4高表达频数比较差异有统计学意义（P<0.05）,淋巴结转移阳性者CRC组织中B7-H4高表达频数高于淋巴结转移阴性者（P<0.05）;肿瘤组织中Treg阳性细胞数明显高于癌旁正常组织（P<0.01）;分化程度不同CRC组织中Treg阳性细胞数比较差异有统计学意义（P<0.01）;淋巴结转移阳性者CRC组织中Treg阳性细胞数高于淋巴结转移阴性者（P<0.01）。Treg浸润与B7-H1的表达有相关性（P<0.01,Cramer's=0.463）,Treg浸润与B7-H4的表达有相关性（P<0.05,Cramer's=0.320）。结论：B7-H1和B7-H4在CRC组织中呈异常高表达,并与肿瘤中Treg浸润增加有关,可作为评估CRC预后的指标。     

可溶性 B7-H 4在子宫内膜异位症患者血清中的表达及其临床意义

目的：探讨可溶性B7-H4（sB7-H4）在子宫内膜异位症（EM ）患者血清中的表达水平及其临床意义。方法用ELISA夹心法检测58例子宫内膜异位症患者手术前后、27例卵巢良性肿瘤患者及36例健康女性血清中 sB7-H4的含量。结果子宫内膜异位症患者血清sB7-H4水平为（39．45±6．21）μg/L明显高于卵巢良性肿瘤患者（31．56±6．15）μg/L、体检健康者（30．85±5．57）μg/L （ P ＜0．05）及其术后（33．48±5．46）μg/L （ P ＜0．05）,且各期EM 患者血清sB7-H4水平之间有统计学差异（ P ＜0．05）。结论可溶性B7-H4与子宫内膜异位症的发病有关,且随着病情进展逐渐升高,检测sB7-H4对子宫内膜异位症的辅助诊断及疗效观察具有重要的临床意义。     

B7-H4在卵巢癌的表达及意义

目的 探讨B7-H4在卵巢上皮来源肿瘤中的表达及其与卵巢癌临床病理学特征的关系,并与卵巢癌抗原CA125的表达进行分析比较.方法 采用免疫组织化学S-P法检测B7-H4和CA125在31例卵巢浆液性囊腺癌、13例卵巢黏液性囊腺癌、9例卵巢子宫内膜样癌、18例卵巢透明细胞癌、20卵巢浆液性囊腺瘤、15例卵巢黏液性囊腺瘤中的表达.结果 B7-H4在卵巢浆液性囊腺癌(100%),子宫内膜样癌(77.8%)及透明细胞癌(83.3%)中均出现过表达,而在黏液性囊腺癌中低表达(23.1%);B7-H4在浆液性囊腺癌(100%)和浆液性囊腺瘤(50%)中阳性率的差异有统计学意义(P<0.01);与CA125比较,非黏液性卵巢癌中B7-H4的阳性率高于CA125,其中浆液性囊腺癌,透明细胞癌中二者的差异有统计学意义(P<0.05),B7-H4和CA125的表达正相关(P<0.05);B7-H4的阳性率与卵巢癌的组织学类型有相关性(P<0.05),其在浆液性囊腺癌中有更突出的表达;B7-H4阳性细胞百分比与肿瘤的分化水平及FIGO临床分期无相关性(P>0.05);但各组B7-H4平均阳性细胞百分比均高于CA125,其中低分化组及Ⅲ～Ⅳ期组,二者的差异有统计学意义(P<0.05).结论 在非黏液性卵巢癌中,B7-H4出现优于CA125的高表达,其可能成为新的卵巢癌诊断标志物及治疗的新靶点.     

B7-H4在大鼠创伤性关节炎模型关节腔中的表达情况

目的：观察B7-H4在大鼠创伤性关节炎模型中的表达及变化情况,探讨其在创伤性关节炎中的作用及可能的机制。方法：将52只健康雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组,每组26只。实验组行右后膝关节内侧副韧带和内侧半月板切除术;对照组行单侧膝关节切开术作为假手术对照。两组分别在术后24 h、48 h、1周、2周、4周5个时间点抽取关节液,采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定关节液中B7-H4含量表达。结果：对照组术后各时间点B7-H4含量表达均较低,各时间点B7-H4含量差异无统计学意义（P〉0.05）;实验组术后各时间点B7-H4含量均高于对照组（均P〈0.05）;实验组术后48 h膝关节液中B7-H4含量较其他时间点明显增高（P〈0.05）;术后2周B7-H4表达较术后48 h明显降低（P〈0.05）;术后48 h、2周、4周3个时间点的B7-H4表达呈降低趋势。结论：B7-H4在创伤急性期的关节中表达增高,其在创伤愈合后期表达逐渐降低,同时对自身免疫反应抑制减弱与创伤性关节炎的发生、发展密切相关。     

B7-H4在原发性卵巢上皮性癌中的表达及临床病理意义

目的探讨B7-H4在原发性卵巢上皮性癌(EOC)中的表达情况及其临床病理意义。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术及免疫组织化学PV-9000二步法研究86例原发性EOC(EOC组)、40例良性卵巢肿瘤(良性组)和10例正常卵巢组织(对照组)B7-H4 mRNA及B7-H4蛋白表达情况,并结合临床病理参数进行分析。结果 B7-H4 mRNA在3组卵巢组织中均有表达,且3组卵巢组织的 mRNA光密度值比较差异均有统计学意义(P<0.05);B7-H4蛋白在EOC组中呈细胞质和(或)细胞膜表达,阳性率为77.9%(67/86),显著高于良性组5.0%(2/40)及对照组0%(0/10)的表达(P<0.05)。EOC组的卵巢癌组织中B7-H4蛋白表达与组织病理学类型、临床分期、病理分级、患者年龄、腹水细胞学和淋巴结转移差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 B7-H4在原发性EOC的高表达提示其可能与肿瘤的发生有关,可为卵巢恶性肿瘤的诊断及治疗提供新的依据。