用DNA芯片检测结核分枝杆菌耐利福平基因突变的初步研究

目的研制一种新型DNA芯片，用于快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计探针并制作DNA芯片，PCR掺入法荧光标记根据结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的目的片断，与DNA芯片杂交，同时以DNA测序法为对照。结果18株结核分枝杆菌临床分离株中，1株敏感株DNA芯片杂交结果与标准株完全相同；17株耐RFP临床分离株中有17株检测到rpoB基因突变，其中14株单位点突变，1株511和516位双位点突变，与测序结果完全一致。另有两株为517和518、526和517位双位点突变，因为芯片上未点517位突变的探针，所以只检测到518和526位的突变，该突变与测序结果完全一致、结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变，可用于临床耐药性的检测，指导临床用药。     

DNA芯片联合检测耐利福平与异烟肼结核分枝杆菌及其临床应用

目的 开发快速检测耐利福平与异烟肼结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA基因突变的DNA芯片.方法 根据结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA基因序列设计探针并制作基因芯片,从临床样品中分离出结核分枝杆菌的基因组DNA,PCR扩增含有上述几个基因突变位点的特异DNA片段,并事先在PCR引物的5′端作生物素标记,然后与膜条芯片上的检测特异突变位点的寡核苷酸探针进行杂交,通过生物素-链霉亲和素-过氧化物酶体系显色,直接观察突变情况,以此来判断耐药结果 .结果 35个利福平和异烟肼单耐药或多药耐药的结核分枝杆菌中有82.9%用芯片法检出的结果 与药敏培养法一致;其中利福平耐药样品突变检出率为100.0%;有20.0%异烟肼耐药的样品芯片未检出突变,可能是突变发生在芯片检测位点范围之外.结论 用DNA芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性,具有较高的特异性和敏感性,可用于临床结核分枝杆菌耐药性检测.     

单链探针反向杂交试验快速检测结核分支杆菌5种耐药基因

目的:建立可同时检测结核分支杆菌rpoB、katG、rpsL、rrs、embB基因突变的单链探针反向杂交试验技术(PCR-LiPA),评价该技术检测结核分支杆菌利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇耐药性的应用价值。方法:采集临床标本,按照实验规程培养、鉴定结核分支杆菌,并对分离到的结核分支杆菌进行药敏试验;PCR扩增结核分支杆菌rpoB、katG、rpsL、rrs、embB耐药基因,单链探针反向杂交试验技术检测耐药基因。将PCR-LiPA结果与DNA测序比较验证方法的准确性,将PCR-LiPA结果与药敏结果比较,了解结核分支杆菌耐药性表型与耐药基因突变的相关性。结果:50株结核分支杆菌传统药物敏感性试验结果显示,12株耐INH,7株耐RFP,15株耐SM,2株耐EMB。PCR-LiPA方法分析结果:耐RFP菌株中4株rpoB基因突变;耐INH菌株中5株KatG基因突变;耐SM菌株中7株、SM敏感株1株rpsl基因突变;耐EMB菌株1株、EMB敏感株1株embB基因突变。与DNA测序结果的符合率为100%。结论:用PCR-LiPA可简便、快速、灵敏、特异地检测出一部分结核分支杆菌耐药株的rpoB、katG、rpsL、rrs、embB基因突变,可用于临床结核分支杆菌耐药性的辅助诊断手段。     

福建省耐多药结核分枝杆菌耐药相关基因突变特征

目的初步分析福建耐多药结核病(multi-resistant tuberculosis,MDR-TB)临床分离结核分枝杆菌利福平和异烟肼的耐药相关基因突变情况。方法自福建福州肺科医院收集耐多药结核分枝杆菌临床分离菌株,采用PCR测序技术测定利福平和异烟肼耐药相关基因,包括rpoB、katG、inhA和mabA-inhA,并与标准菌株基因序列比对,分析基因突变特点。结果共对67株MDR-TB菌株进行了分析,91.04%的菌株在rpoB81 bp RRDR区发生突变,其中,88.06%(59/67)的MDR-TB菌株在rpoB531、526和516位发生突变;79.10%的菌株在katG、inhA或mabA-inhA上发生突变,59.70%(40/67)的菌株在katG315或者mabA-inhA(-15)位发生突变,没有检测到同时在inhA结构基因和基因调节区发生突变的菌株。结论 PCR-DNA测序分析技术可以用于检测MDR-TB临床分离菌株对RFP和INH的药物敏感性。     

江西1010例PCR-线性杂交酶显色法检测结核分枝杆菌耐药性结果分析

目的 评价PCR-线性杂交酶显色法在江西的应用效能，分析江西地区结核分枝杆菌相关耐药基因rpoB、katG、inhA的变异特征。方法 采集江西省肺结核涂阳患者痰标本或经离培养获得的分离株共1010例，采用PCR-线性杂交酶显色法检测rpoB、katG、inhA基因突变情况，同时对其中860例进行了罗氏药敏检测。结果 以罗氏药敏为“金标准”评价PCR-线性杂交酶显色法检测利福平耐药性的敏感度和特异度分别为88.69%和96.24%；检测异烟肼耐药性的敏感度和特异度分别为77.29%和96.39%。在304株利福平耐药rpoB突变株中，突变频率高的位点是531位点、526位点次之；309株katG和inhA基因突变株中，katG S315T1占73.14%、inhA C15T占12.62%。异质性耐药突变菌株占3.61%。结论 PCR-线性杂交酶显色法是耐药结核病快速筛查的有效方法，江西利福平、异烟肼耐药株主要基因突变型为rpoB的S531L和katG的S315T1，高水平耐药菌株所占比例大。     

结核分枝杆菌inhA基因突变的研究

目的：了解我国结核分枝杆菌耐异烟肼（INH）临床分离株inhA基因突变情况,探讨快速检测结核分枝杆菌耐药基因型的分子药敏检测方法。：方法：用PCR单链构象多态性（PCR－SSCP）和PCR直接测序法（PCR－DS）分析30 结核分枝杆菌临床分离株inhA基因。结果：以结核分枝杆菌H37Rv标准株对照观察所有INH敏感株的PCR－SSCP和PCR－DS图谱,均未发现inhA基因突变,在12株INH耐药株中,有5株无PCR－SSCP和PCR－DS图谱异常,占INH耐药株的41．7％,另有5株和2株分别发生核苷酸错义突变和同义突变,共占INH耐药株的58．3％,结果：多数结核分枝杆菌耐INH与inhA基因突变密切相关,但检测inhA基因突变不宜作为临床分离株耐药性的快速检测指标。     

乌鲁木齐市耐多药结核分枝杆菌基因突变特征分析

目的 了解耐四种一线抗结核药物结核分枝杆菌的有关基因突变特征。方法 对19例耐多药结核病患者和254例全敏结核病患者痰液标本中分离的结核分枝杆菌进行药物敏感性试验,提取其DNA进行PCR扩增,对扩增产物测序并与标准株H37Rv进行比对。结果 19株耐多药结核杆菌和254株全敏结核杆菌均未检测到耐异烟肼基因inhA突变;耐多药组突变率最高的为耐异烟肼katG基因,突变位点为315;耐利福平的突变基因是rpoB,耐药位点为526和531,531位点突变率高于526位点;耐乙胺丁醇的突变基因是embB,耐药位点为206;耐链霉素的突变基因是rpsL和rrs,耐药位点分别为43和1401,rpsL基因的突变率高于rrs基因。结论 耐多药结核分枝杆菌耐异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素的突变基因分别为katG、rpoB、embB、rpsL和rrs,这对今后乌鲁木齐市耐多药结核病的快速诊断和控制提供了理论依据。     

反向斑点杂交技术在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用研究

目的利用反向斑点杂交技术，建立结核分枝杆菌对利福平（RFP）、异烟肼（INH）、链霉素（SM）和乙胺丁醇（EMB）耐药相关基因突变的快速检测方法。方法根据结核分枝杆菌标准株H37Rv序列，自行设计针对rpoB、katG、inhA、rpsL和embB基因中常见耐药突变区的系列寡核苷酸探针，制成膜芯片，并对64例结核分枝杆菌临床株的基因突变情况进行检测。结果在36株RFP耐药菌中，有32株被检出在rpoB基因上发生突变，突变检出率为88．89％（32／36）；在39株INH耐药菌中，有30株被检出在katG或inhA基因上发生基因突变或缺失，检出率为76．92％（30／39）；在34株SM耐药菌中，有25株被检出在rpsL基因分析部位发生突变，检出率为73．5％（25／34）；在32株EMB耐’药菌中，有19株在embB基因分析部位发生突变，检出率为59．4％（19／32）。膜芯片检出的突变与基因测序结果一致。结论用膜芯片检测结核分枝杆菌对利福平（RFP）、异烟肼（INH）、链霉素（SM）和乙胺丁醇（EMB）四种主要一线抗结核药的耐药性，具有较高的特异性和敏感性，可作为常规药敏方法的补充，用于指导开展早期、有效的临床化疗。     

基因芯片技术在新发涂阳肺结核患者结核杆菌菌种鉴定及药敏试验中的应用

目的探究分子芯片技术在新发涂阳肺结核患者结核杆菌菌种鉴定、药敏试验中的应用。方法入组526株菌株分离自2018年7月-2019年9月间下属7个县市区收治的新发涂阳结核患者,采用间隔区寡核苷酸分型法(Spoligotyping法)及基因芯片技术进行菌种鉴定,对鉴定为结核分枝杆菌的菌株采用绝对浓度法进行利福平、异烟肼药敏性分析,采用基因芯片技术对利福平耐药基因rpoB、异烟肼耐药基因katG、inhA突变位点进行检测,以Spoligotyping法、绝对浓度法作为金标准,分析基因芯片技术对结核杆菌菌种鉴定、药敏分析的应用价值。结果 526株分离株经Spoligotyping法鉴定,414株为结核分枝杆菌复合群,112株为非结核杆菌,其中胞内分枝杆菌57株,龟或脓肿分枝杆菌30株,鸟分枝杆菌25株;基因芯片法对结核分枝杆菌复合群鉴定符合度为100.00%,对非结核分枝杆菌鉴定符合度为95.54%。基因芯片技术共检出33株存在rpoB突变,突变频率最高的位点为531,占比为45.45%,其次为526位点,占比36.36%;共检出42株存在katG/inhA突变,其中78.57%为katG单一位点突变,19.05%为inhA单一位点突变,2.38%为katG、inhA双突变。基因芯片技术诊断利福平耐药的敏感度、特异度、准确度分别为90.90%、99.21%、98.54%,两者一致性Kappa值为0.901;对异烟肼耐药分析的敏感度、特异度、准确度分别为65.08%、99.72%、94.44%,两者一致性Kappa值为0.751;对多药耐药分析的敏感度、特异度、准确度分别为90.48%、99.23%、98.79%,两者一致性Kappa值为0.877。结论基因芯片技术可较好的鉴别结核分枝杆菌菌种及耐药性,与常规菌培养、药敏试验结果具有较高的一致性。     

反向杂交膜片检测结核菌耐利福平基因突变

目的利用一种新型的反向点杂交膜片,快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变.方法根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计寡核苷酸探针并固定于尼龙膜上,用生物素标记的引物增扩结核分枝杆菌rpoB基因片断,与膜片上探针杂交,膜片检测结果与常规药敏试验结果和测序结果进行对照.结果对63株临床分离株进行检测,10株利福平敏感株未检测到突变,53株耐利福平株,其中48株检测到突变.灵敏度为90.6%,特异度为100%,阳性预测值100%,阴性预测值66.7%.用反向点杂交膜片检测27份肺结核患者的痰标本,17份非结核的痰液标本.12份耐利福平的痰标本中,11份检测到突变,膜片检测与药敏结果的符合率为92.3%;15份利福平敏感的痰标本中,膜片检测结果有6份出现突变信号;17份非结核病的其他患者的痰液标本中有1份检测到突变.检测痰标本的灵敏度为91.7%,特异度为78.1%,阳性预测值61.1%,阴性预测值96.1%.结论反向点杂交膜片可简便、快速、较准确地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变.