力达霉素辅基蛋白荧光衍生物的制备

目的：建立力达霉素辅基蛋白荧光衍生化的方法。方法：采用FITC和9-氨基芴分别对力达霉素辅基蛋白的氨基端和羧基端进行衍生化。偶联产物用Sephadex G15葡聚糖凝胶柱和半透膜分离纯化，并用MALDI—TOF质谱检测连接效果。结果：在本试验条件下，力达霉素辅基蛋白分别与FITC和9-氨基芴成功偶联，偶联连接分子比均为1：1。结论：此法简单和准确，可用于制备力达霉素辅基蛋白荧光衍生物。     

小分子靶向肽（RGD）2C与力达霉素的偶联物抗肿瘤作用研究

目的：考察小分子靶向肽（RGD）：C与力达霉素的偶联物的抗肿瘤作用。方法：MTr法观察偶联物和力达霉素在体外对人口腔鳞癌KB细胞、人乳腺癌MCF-7细胞以及人肝癌Bel7402细胞的细胞毒性。克隆形成法观察其对人肝癌Bel7402细胞克隆形成的抑制作用。采用C57BIM6小鼠Lewis肺癌移植瘤模型观察其实验治疗作用。结果：MrlT法结果表明,偶联物对人口腔鳞癌KB细胞、人肝癌Bel7402细胞和人乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒性比力达霉素分别下降13倍、46倍和186倍。克隆形成法表明．偶联物对人肝癌Bel7402细胞的克隆形成抑制率比力达霉素下降10倍。0．2,0．1,O．05mg·kg-1偶联物对C57BL／6小鼠Lewis癌皮下原发瘤的生长抑制率分别为35．8％,25．6％和10．3％;0．05mg·kg-1素对肿瘤生长的抑制率为32．4％。0．2,0．1,0．05mg·kg-1偶联物对小鼠Lewis癌肺转移的抑制率分别为69．6％,50．5％和34．2％,0．05mg·kg-1达霉素、0．05mg·kg-1力达霉素＋1mg·kg-1（RGD）：C肽的抑制率分别为53．3％和54．9％。结论：按等细胞毒性剂量来计算,偶联物体内抗肿瘤活性和抗肿瘤转移活性比力达霉素强,提示小分子靶向肽RGD与力达霉素偶联后发挥了一定的导向作用。     

烯二炔类抗生素及其靶向药物研究新进展

烯二：炔类抗生素因强的抗肿瘤活性而受到重视。近年报道与单抗偶联的烯二炔类抗生素有力达霉素（Lidamycin LDM）、新制痛菌素（Neocarzinostatin,NCS）和卡利奇霉素（Calicheamicins,CLM）。本文突出阐明了其靶向药物的研究进展,同时也介绍了其辅基蛋白、新型筛选模型、产生菌发酵方面的最新动态。     

基因工程重组力达霉素的制备及抗肿瘤活性

目的 制备重组力达霉素rLDM,研究其抗肿瘤活性。方法 构建完整力达霉素辅基蛋白表达载体pET30-sldp,并在大肠埃希菌中诱导表达重组辅基蛋白rLDP,纯化后的rLDP蛋白与力达霉素发色团AE在体外进行组装制备rLDM,MTT法检测rLDM和LDM的体外抗肿瘤活性,利用流式细胞仪检测两者对肿瘤细胞周期的影响。结果 rLDP蛋白以可溶形式在大肠埃希菌中分泌表达,与发色团组装后经HPLC检测在340nm处出现特定吸收峰,表明rLDM制备成功;MTT实验结果显示rLDM和LDM对SKOV3细胞的IC50值相近,无显著性差异;流式细胞仪检测结果证明两者对SKOV3细胞周期的影响趋势相似。结论     

小分子靶向肽修饰壳聚糖作为基因载体的研究

目的:将小分子靶向肽RGD(Arg-Gly-Asp)偶联到壳聚糖(CS)上,并包载质粒DNA(pDNA),制成一种具有靶向性的壳聚糖载基因纳米粒。方法:将RGD肽上的羧基和CS上的氨基通过酰化反应发生偶联,运用红外(FT-IR)和元素分析对RGD偶联壳聚糖(CS-RGD)的化学结构进行确证;采用复凝聚法制备CS-RGD/pDNA纳米粒(CS-RGD/pDNA);应用凝胶阻滞实验和DNA酶(DNase I)降解实验考察CS-RGD对pDNA的复合和保护能力;通过激光粒度仪和原子力显微镜对纳米粒的粒径分布和形态进行考察。结果:CS和RGD肽通过酰胺键偶联;CS-RGD/pDNA在N/P≥2时完全复合,在N/P≥4时具有抗DNase I酶降解能力,N/P=2～30的CS-RGD/pDNA复合物粒径在90～260 nm之间,Zeta电位在4～39 mV之间,原子力显微镜结果证明复合物为类球形且分布良好。具有良好的稳定性和易于进入细胞的性质。结论:CS-RGD是一种制备工艺简单,具有应用前景的非病毒基因载体。     

内皮抑素-力达霉素辅基蛋白融合蛋白对乳腺癌、胰腺癌和食管癌的靶向性研究

目的研究内皮抑素-力达霉素辅基蛋白融合蛋白(ES-LDP)对人乳腺癌、胰腺癌和食管癌组织的靶向性。方法分别采用人体乳腺癌、胰腺癌和食管癌组织芯片,利用免疫组化的方法,研究ES-LDP与癌细胞的亲和力;并采用Image-Pro Plus6.0软件计算吸光度值,进行统计分析。结果与辅基蛋白比较,ES-LDP对乳腺癌、胰腺癌和食管癌亲和力显著增高(P0.001)。在胰腺癌组织,这种亲和力也显著高于对正常组织的亲和力(P0.05)。结论 ES-LDP对不同组织器官,亲和力有所不同;在进行体内抗肿瘤活性评价时要注意选择合适的模型。     

头孢他啶活性硫酯的制备

头孢他啶活性硫酯（1），化学名为2-[（2-氨基噻唑-4-基）-（苯并噻唑-2-基硫基羰基）-亚甲胺氧基]-2-甲基丙酸叔丁酯，是制备抗菌剂头孢他啶（ceftazidime）的重要中间体。本研究参考文献，用2-[（2-氨基噻唑-4-基）羧基亚甲胺氧基]-2-甲基丙酸叔丁酯（2）和二硫二苯并噻唑（3）反应制得1（图1），优化了反应溶剂及投料量配比，确定用甲苯为溶剂，2-3-三苯基膦-三乙胺为1：1．16：1．16：0．4，收率85．4％，纯度99．3％（HPLC法）。     

RGD肽修饰的异长春花碱-粉防己碱脂质体的制备及体外抑瘤作用研究

目的:制备RGD肽修饰的异长春花碱(VRB)-粉防己碱(TET)脂质体,研究其对脑胶质瘤C6细胞的抑制作用。方法:采用薄膜分散法和硫酸铵梯度法制备RGD肽修饰的VRB-TET脂质体,观察其形态和粒径分布,测定其中VRB的含量;以磺酰罗丹明B法分别测定空白靶向脂质体、VRB普通脂质体和RGD肽修饰的VRB-TET脂质体对C6细胞的抑制作用。结果:所制RGD肽修饰的VRB-TET脂质体呈圆球状或类圆球状,表面光滑,粒径为120 nm左右,其中VRB的平均含量为28.27μg/m L(RSD=0.38%,n=3)。空白靶向脂质体对C6细胞生长无显著影响;RGD肽修饰的VRB-TET脂质体能明显抑制C6细胞生长,其作用后细胞存活率明显低于VRB普通脂质体(P<0.05)。结论:成功制得RGD肽修饰的VRB-TET脂质体,其具有明显的抑制C6细胞生长的作用。     

穿膜肽-抗体-微球偶联物的制备方法研究

目的：探讨制备穿膜肽-抗体-微球新型药物传送系统的可行性。方法：采用N-琥珀酰亚胺基-3-（2-吡啶二硫）-丙酸酯（SPDP）交联法将穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白（CPPs-EGFP）、牛血清白蛋白微球（BSA-NS）、乙肝高效价免疫球蛋白（HBIg）分别采用一次偶联法和二次偶联法两种交联方案进行共价交联,采用还原和非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫荧光法评价穿膜肽、抗体、微球间的交联。结果：两种交联方案制备的穿膜肽-抗体-微球偶联物,SDS-PAGE还原电泳均可见在低分子量端形成三条蛋白条带,非还原电泳均未见条带;在不同激发波长的荧光显微镜下,均可见微球表面分别发出绿色荧光和红色荧光。结论：应用SP-DP交联剂,无论是一次偶联法还是二次偶联法均能够将穿膜肽、抗体、微球有效地进行偶联,为进一步研究穿膜肽-抗体-微球新型药物传送系统的特性奠定了基础。     

RGD肽修饰重组高密度脂蛋白载药纳米粒的制备和表征以及肿瘤细胞对其摄取作用

目的：制备和表征RGD肽修饰的重组高密度脂蛋白（RGD—rHDL）载药纳米粒,考察肿瘤细胞对其摄取作用。方法：合成RGD与载脂蛋白AI（ApoAI）的偶联物（RGD—ApoAI）,并以藤黄酸（GA）作为模型药物,采用薄膜分散法制得GA脂质体（LP—GA）,再将RGD—ApoAI与LP—GA共孵育,制备载有GA的RGD—rHDL纳米粒（RGD—rHDL—GA）;随后,对RGD—rHDL—GA进行表征,且采用荧光标记示踪法,通过RGD—rHDL-香豆素-6来考察人肝癌细胞HepG2对载药RGD—rHDL纳米粒的摄取作用。结果：制备的RGD—rHDL—GA呈现规则圆整的类球形,粒径分布均一[（110,70±3．25）nm],Zeta电位为（-39．21±0．10）mV,包封率为（92．20±0．28）％,载药量为（9．03±0．75）％,且其体外释药缓慢,稳定性良好;RGD—rHDL-香豆素-6的肿瘤细胞摄取率明显高于rHDL-香豆素-6。结论：rHDL经RGD修饰后可有效促进所载药物进入肿瘤细胞,提高其肿瘤靶向性。     

新抗癌抗生素C1027及其单克隆抗体组装偶联物的抗肿瘤活性

C1027是链霉菌株产生的大分子肽类新抗癌抗生素,对肿瘤细胞具有显著的杀伤作用,它由一条肽链和一个发色团组成,后者是主要活性部分。本研究用甲醇拆分C1027并重新组建,重建的C1027与天然C1027活性相似;C1027的重建是特异的,肽链与发色团的结合不受BSA竟争影响。肽链不能与表阿霉素组建;单抗H16(IgG₁)不能与发色团组建。我们用不同的方法分别制备了C1027与抗人肝癌单抗H16直接偶联物和组装偶联物(单抗与肽链连接后再加入发色团);克隆形成测定,前者IC₅₀为42pmol·L^-1,后者为5.5pmol·L^-1;C1027与无关抗体M3组装偶联物的IC₅₀为240pmol·L^-1。结果表明H16-C1027组装偶联物对肝癌细胞的抑制作用比直接偶联物明显增强,并具有选择性杀伤作用。     

以二硫键连接尿嘧啶核苷C-5位肽缀合物的合成

为了方便快捷地制备嘧啶核苷-肽缀合物,我们发展了一种一釜合成的方法。从尿嘧啶核苷出发,经过4步制备了关键中间体5-乙酰巯亚甲基-2′,3′-二-O-异亚丙基尿苷（4）。在酸性条件下,脱除化合物4的乙酰基,同时游离的巯基与PySS-R（8,12,15,Py=2-吡啶基,R=氨基酸或肽）反应形成新的二硫键,即形成了尿苷与氨基酸或肽以二硫键连接的缀合物（9,13,2）。     

含NSG残基取代的RGD相关肽的固相合成

目的：应用固相肽合成方法制备RGD肽类似物。方法：用NSG残基Ida代替Asp,用酰甲胺或酰乙胺代替c末端的羧基,生成N取代类肽型的产物。结果：五个RGD肽类似物结构经LC—MS分析证明,总收率均在85％以上。结论：通过本合成工作,为建立经济、可行的类肽合成提供了一种途径。     

穿膜肽与蛋白微球偶联物的制备及鉴定

目的:制备穿膜肽TAT-EGFP与白蛋白微球(BSA-NP)偶联物,并检测其对膀胱癌EJ细胞的穿膜活性.方法:通过异型双功能交联剂N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡基二硫 )-丙酸酯 ( SPDP) 交联的方法制备穿膜肽TAT-EGFP与白蛋白微球偶联物.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、电镜、荧光显微镜及...     

单纯性肥胖患者血液生化指标检测分析

目的：研究单纯性肥胖患者血液生化指标检测结果的变化。方法：采用日本奥林巴斯AU2700全自动生化分析仪对100例单纯性肥胖患者常规测定血液生化。结果：单纯性肥胖患者总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、载脂蛋白B（ApoB）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL—C）、血糖（GLU）、γ-谷氨酰基转移酶（GGT）、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（CysC）水平高于正常对照组（P〈0．05）;而载脂蛋白A—I（ApoA—I）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL—C）两组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：血液生化检测结果和单纯性肥胖患者密切相关。     

力达霉素-单抗Fab'片段不同连接偶联物的抗肿瘤作用比较

研究力达霉素与抗Ⅳ型胶原酶单抗的不同连接键的小型化免疫偶联物的抗肿瘤作用。制备长短链的二硫键以及硫醚键抗肿瘤抗生素力达霉素(LDM)与抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11的Fab'片段连接的免疫偶联物,ELISA法测定偶联物的免疫活性,体外细胞克隆形成测定和体内荷瘤裸小鼠模型观察两种偶联物的抗肿瘤作用。体外研究显示,Fab'-LDM偶联物部分保留了抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11对抗原的亲和力,硫醚键偶联物对体外培养的人纤维肉瘤HT-1080细胞的杀伤作用强于LDM和二硫键偶联物。实验结果显示,LDM等剂量条件下硫醚键偶联物Fab'-SSMPB-LDM和Fab'-SMBS-LDM组的抑瘤率分别为87.7%和78.0%,二硫键偶联物Fab'-SPDP-LDM和Fab'-LCSPDP-LDM组分别为74.8%和72.3%,游离LDM组为70.9%,相比较长连接键的硫醚键偶联物抑瘤作用显著增强。Fab'-SSMPB-LDM和Fab'-SMBS-LDM组动物的平均生存时间延长为165.8%和145.2%,Fab'-SPDP-LDM和Fab'-LCSPDP-LDM组分别为82.2%和107.5%,LDM组为71.9%。与二硫键偶联物组比较...     

家兔体内思密达对左氧氟沙星药动学的影响

目的:探讨口服思密达和左氧氟沙星后左氧氟沙星的药动学有无改变。方法:取家兔6只随机交叉(间隔1周)经口灌胃左氧氟沙星(A组)、左氧氟沙星+思密达(B组)、左氧氟沙星2h后+思密达(C组)。采用高效液相色谱法测定不同时间血样中左氧氟沙星浓度,计算并比较药动学参数。结果:A组与C组比较,Cmax、tmax、AUC、t1/2均无显著性差异(P>0.05);B组除tmax与其它组无差异外(P>0.05),t1/2延长,AUC、Cmax值降低(P<0.05)。结论:同时使用左氧氟沙星和思密达,可明显改变前者的药动学参数;使用左氧氟沙星2h后再用思密达,此用药方案较为合理。     

Solid-phase peptide synthesis on proteins

A new method for solid-phase peptide synthesis in which a protein is used as the solid support has been developed. Two aspects of the method have been demonstrated. The peptides H-Phe-Leu-Glu-Glu-Val-OH (1) and H-Leu-Leu-Ala-Glj-Val-OH (2), respectively, were synthesized on the amino groups of BSA via a cleaveable linker, using the Fmoc group protecting scheme. The free peptides were obtained by cleavage from the protein with 95% TFA. precipitation in diethyl ether and additional work-up by either dialysis or centrifugation through a membrane followed by gel filtration. The identity of the products was determined by amino acid analysis and HPLC. The peptide-protein conjugates, H-Ser-Met-Asp-Thr-Ser-Asn-Lys-Glu-Glu-Lys-BSA (3) and H-Thr-Val-Leu-BTG (4), were obtained in the same manner, omitting the cleavable linker group. It was found that 35-50 peptide chains were conjugated per molecule BSA and BTG, respectively. Immunization of rabbits with conjugate 3 gave rise to peptide specific antibodies. This method will be useful for generation of sequence specific antibodies, since the peptide is conjugated to the carrier protein exclusively via its C-terminus, and will allow synthesis of highly specific peptide-protein conjugates.