miR-92a-3p靶向EZH2对IL-1β诱导软骨细胞合成基质降解酶的影响

目的研究miR-92a-3p靶向zeste基因增强子同源物2(EZH2)对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的软骨细胞合成基质降解酶的影响。方法分离培养人软骨细胞,分成Normal、IL-1β(IL-1β处理)、miR-NC+IL-1β(mimics control转染后IL-1β处理)、miR-92a-3p+IL-1β(miR-92a-3p mimics转染后IL-1β处理)组,RT-PCR方法测定miR-92a-3p表达变化,Western blot检测MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表达。靶基因预测软件发现EZH2可能为miR-92a-3p的靶基因,荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。将p CDNA3.1-EZH2和miR-92a-3p mimics共同转染到软骨细胞中,检测MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表达情况。结果与Normal比较,IL-1β组细胞中miR-92a-3p表达减少,MMP-13、MMP-1表达增多,COLⅡ表达减少(P0.05)。与miR-NC+IL-1β比较,miR-92a-3p+IL-1β组细胞中miR-92a-3p表达增多,MMP-13、MMP-1表达减少,COLⅡ表达增多(P0.05)。miR-92a-3p靶向负调控EZH2表达。p CDNA3.1-EZH2可以逆转miR-92a-3p mimics对IL-1β条件下软骨细胞中MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表达影响。结论 miR-92a-3p靶向下调EZH2抑制IL-1β诱导的软骨细胞合成基质降解酶。     

lncRNA MEG3靶向调节miR-27a-3p抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的实验研究

目的:探究lncRNA MEG3对胃癌(GC)细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制。方法:qRT-PCR检测人正常胃上皮细胞GES-1和GC细胞(BGC823、MGC803、SGC7901、AGS、MKN28、MKN451)中MEG3及miR-27a-3p表达差异;将AGS细胞分为对照组、GV144组、GV144-MEG3组、GV144-MEG3+miR-27a-3p NC组、GV144-MEG3+miR-27a-3p mimics组;比较各组AGS细胞中MEG3及miR-27a-3p表达情况;检测细胞增殖、迁移和侵袭能力,Western blot检测ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达,双荧光素酶报告实验验证MEG3与miR-27a-3p的靶向关系。结果:与GES-1细胞相比,GC细胞中MEG3水平降低,miR-27a-3p水平升高(P<0.05);与对照组相比,GV144-MEG3组MEG3水平升高,miR-27a-3p、ki-67、MMP-2、MMP-9水平及增殖、迁移和侵袭能力降低(P<0.05);上调miR-27a-3p表达可减弱MEG3过表达对AGS细胞恶性行为的抑制作用。miR-27a-3p是MEG3的靶基因。结论:过表达MEG3可能通过靶向下调miRNA-27a-3p表达抑制AGS细胞增殖、迁移及侵袭。     

微小RNA-215-5p/锌指结构E-box同源结合框2促进白细胞介素-1β诱导软骨细胞凋亡在骨关节炎中的作用机制

目的探讨微小RNA(miR)-215-5p对白细胞介素(IL)-1β诱导的骨关节软骨细胞凋亡的影响及其机制。方法将骨关节炎软骨细胞ATDC5随机分为磷酸盐缓冲液(PBS)处理对照组和IL-1β处理模型组。为了分析miR-215-5p对IL-1β诱导细胞凋亡的影响, 进一步的将IL-1β组分为:模型组+miR对照组, 模型组+miR-215-5p抑制剂组。细胞转染后采用10 ng/ml IL-1β处理软骨细胞。采用流式细胞术检测细胞凋亡水平。采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-215-5p和锌指结构E-box同源结合框2(ZEB2)的表达水平。蛋白质印迹法(Western blot)检测ZEB2、p65、磷酸化p65、裂解的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)蛋白水平。将野生型ZEB2的3’-非编码区(pmiR-ZEB2-WT)或者突变型ZEB2的3’-非编码区(pmiR-ZEB2-Mut)分别与miR-215-5p模拟物(miR-215-5p mimic)和对照物(miR-NC)共转染细胞, 双荧光素酶报告基因测定实验研究miR...     

骨髓间充质干细胞对膝关节炎大鼠软骨损伤及KDM6A/SOX9信号通路的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞对膝关节骨性关节炎大鼠的影响,并探讨其机制。方法 将40只SD大鼠随机分为正常对照组(Control)、膝关节骨性关节炎组(KOA)、骨髓间充质干细胞组(BMSCs),每组10只,剩余10只用于骨髓间充质干细胞的分离。处理4周后进行大鼠关节指数(AI)评分;HE染色观察软骨组织病理学变化;免疫组化检测软骨组织Col II、IL-6、MMP-3、MMP-13表达;ELISA法检测血清IL-6、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量;qRT-PCR检测软骨组织Col II、Col I、TNF-α、IL-6、MMP-13、KDM6A、SOX9、Aggrecan mRNA表达;Western blot检测软骨组织KDM6A、SOX9、Aggrecan蛋白表达。结果 与Control组比较,KOA组大鼠AI评分、血清IL-6、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量、软骨组织IL-6、MMP-3、MMP-13表达明显升高(P<0.05);Col II、KDM6A、Aggrecan、SOX9 mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05)。与KOA组比较,BMS...     

LncRNA FGD5-AS1靶向miR-103a-3p对IL-1β诱导的关节软骨细胞凋亡的机制研究

目的探讨LncRNA FGD5-AS1靶向miR-103a-3p对IL-1β诱导的关节软骨细胞损伤及细胞凋亡的影响与分子机制。方法体外培养大鼠关节软骨细胞,分为NC组、IL-1β组(IL-1β浓度为10 ng/m L)。采用qRT-PCR检测细胞中FGD5-AS1、miR-103a-3p的表达水平。分别将pc DNA-FGD5-AS1、miR-103a-3p mimics转染至软骨细胞,随后使用IL-1β处理48 h。采用ELISA检测IL-6、TNF-α、IL-8水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告实验验证FGD5-AS1与miR-103a-3p的靶向关系; Western blot检测Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表达量。结果与NC组相比,IL-1β组软骨细胞中FGD5-AS1的表达水平显著降低(P0.05),miR-103a-3p、Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3的表达水平显著升高(P0.05),IL-6、TNF-α、IL-8水平显著升高(P0.05),细胞凋亡率显著升高(P0.05); FGD5-AS1过表达后可明显降低IL-6、TNF-α、IL-8、p-NF-κB p65、p-IκBα水平(P0.05),降低细胞凋亡率(P0.05),抑制Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3表达(P0.05);双荧光素酶报告实验证实FGD5-AS1靶向结合miR-103a-3p并可负向调控miR-103a-3p的表达(P0.05); miR-103a-3p过表达可明显逆转FGD5-AS1过表达对细胞凋亡及炎症反应的抑制作用(P0.05)。结论 LncRNA FGD5-AS1可通过靶向负调控miR-103a-3p的表达从而抑制IL-1β诱导的关节软骨细胞炎症反应及细胞凋亡,其作用机制可能通过抑制NF-κB信号通路激活有关。     

hsa_circ_0005105靶向miR-508-3p对关节炎软骨细胞的影响

目的 探讨hsa_circ_0005105对关节炎软骨细胞增殖、凋亡及炎症因子分泌的影响及机制。方法 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测软骨细胞中hsa_circ_0005105和miR-508-3p的表达水平;将软骨细胞分为NC组、IL-1β组、IL-1β+si-NC组、IL-1β+si-hsa_circ_0005105组、IL-1β+miR-NC组、IL-1β+miR-508-3p组、IL-1β+si-hsa_circ_0005105+anti-miR-NC组、IL-1β+si-hsa_circ_0005105+anti-miR-508-3p组;蛋白质印迹法检测凋亡蛋白表达;流式细胞术检测凋亡;CCK-8与平板克隆形成能力检测细胞增殖能力;酶联免疫吸附法检测TNF-α、IL-6水平;双荧光素酶报告实验检测hsa_circ_0005105和miR-508-3p的靶向关系。结果 IL-1β诱导的软骨细胞中hsa_circ_0005105表达水平升高,miR-508-3p表达水平降低（P<0.05）。低表达hsa_circ_0005105或过表达miR-508-3p可降低IL-1β诱导的软骨细胞Bax、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3相对表达水平、细胞凋亡率,升高Bcl-2蛋白水平、细胞活性,细胞克隆形成数增多,TNF-α和IL-6水平降低（P<0.05）。hsa_circ_0005105靶向调控miR-508-3p;低表达miR-508-3p可以逆转hsa_circ_0005105低表达对IL-1β诱导的软骨细胞损伤及炎症因子分泌的影响。结论 低表达hsa_circ_0005105通过靶向上调miR-508-3p抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡及炎症因子分泌,促进细胞增殖。     

miR-2053在口腔黏膜修复中对成纤维细胞的影响及其机制研究

目的探索miR-2053在口腔黏膜修复中对成纤维细胞的影响及其作用机制。方法选择口腔黏膜病患者40例为实验组,健康者40例为对照组;采用实时荧光定量PCR检测口腔黏膜组织的miR-2053表达情况。建立人牙龈成纤维细胞转染miR-2053模型,采用CCK-8法检测细胞存活率,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Transwell小室法检测细胞迁移率;应用RT-PCR及Western-blot检测其组织重塑中的关键转录因子CollagenⅠ、CollagenⅢ、MMP-1、MMP-13的基因及蛋白表达水平。结果与对照组比较,实验组miR-2053在口腔黏膜组织中的表达明显升高(P0.05);与对照组及阴性模拟物组比较,转染miR-2053的人牙龈成纤维细胞模型的细胞活力及迁移率均出现明显下降(P0.05),而凋亡显著增高(P0.05)。与对照组及阴性模拟物组比较,转染miR-2053后的人牙龈成纤维细胞中CollagenⅠ、CollagenⅢ、MMP-1、MMP-13基因的表达量均明显下降(P0.05),CollagenⅠ、CollagenⅢ、MMP-13蛋白的相对表达量亦明显降低(P0.05)。结论 miR-2053可能通过影响CollagenⅠ、CollagenⅢ、MMP-1、MMP-13的表达,进而影响人牙龈成纤维细胞的活力、凋亡及迁移能力,从而影响口腔黏膜病的康复及病程。     

小鼠髓核细胞体外衰老模型的建立及评价

【摘要】 目的：建立并评价小鼠髓核细胞（nucleus pulposus cells，NPCs）体外衰老模型。方法：取8周龄C57BL/6雄性小鼠，体外分离培养小鼠NPCs，并采用细胞免疫荧光（immunofluorescence，IF）检测NPCs标志蛋白聚集蛋白聚糖（aggrecan）的表达进行细胞鉴定。取不同浓度（0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L）的叔丁基过氧化氢（tert-Butyl hydroperoxide，TBHP）干预NPCs，采用CCK8法检测干预2h、4h后的细胞活性，筛选TBHP的最佳干预浓度及时间。应用最佳干预浓度TBHP、最佳干预时间干预P1代NPCs后换成完全培养基继续培养24h、48h、72h，采用衰老相关β半乳糖苷酶染色（senescence-associated β-galactosidase staining，SA-β-gal）检测各时间点的衰老NPCs阳性率，观察不同时间点NPCs的衰老变化。将P2代NPCs分为对照组和模型组，对照组在完全培养基中培养，模型组加入最佳干预浓度TBHP干预最佳时间干预后换成完全培养基培养，采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测两组细胞衰老相关基因p53、p21、p16以及Aggrecan、Ⅱ型胶原蛋白（collagen Ⅱ）、含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5，ADAMTS-5）、基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）、基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）mRNA表达，免疫印迹法（Western blot，WB）检测Aggrecan、Collagen Ⅱ、MMP-3、MMP-13、p53、p21蛋白表达水平。结果：分离培养的细胞高表达Aggrecan，为NPCs。TBHP最佳干预浓度为100μmol/L，最佳干预时间为4h。在100μmol/L TBHP干预4h后培养24h、48h、72h，NPCs的SA-β-gal染色阳性率均显著性增加（P＜0.05），三个时间点间无统计学差异（P＞0.05），后续模型组加入最佳干预浓度TBHP干预最佳时间干预后换成完全培养基培养24h，对照组培养相同时间。RT-qPCR检测模型组p53、p21、p16、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5 mRNA表达较对照组显著性升高（P＜0.05），Aggrecan、Collagen Ⅱ mRNA表达较对照组显著性降低（P＜0.05）；WB检测模型组MMP-3、MMP-13、p53、p21蛋白表达较对照组显著性升高（P＜0.05），Aggrecan、Collagen Ⅱ蛋白表达较对照组显著性降低（P＜0.05）。结论：采用TBHP诱导能成功构建小鼠NPCs体外衰老模型，可为椎间盘退行性变的发病机制研究提供良好的研究样本。     

lncRNA XIST靶向miR-302a-3p对IL-1β诱导软骨细胞损伤的调控机制

目的 探讨lncRNA X染色体失活特异转录因子（XIST）靶向miR-302a-3p对白细胞介素-1β（IL-1β）诱导软骨细胞损伤的调控机制。方法 SW1353细胞分为Control组、IL-1β组、IL-1β+si-NC组、IL-1β+si-XIST组、IL-1β+si-PDK1组、IL-1β+si-XIST+miR-NC inhibitor组、IL-1β+si-XIST+miR-302a-3p inhibitor组。检测XIST、miR-302a-3p以及3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）mRNA表达;噻唑蓝（MTT）实验测定细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;qRT-PCR检测炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10）水平;双荧光素酶报告基因检测实验证实miR-302a-3p与XIST或PDK1的靶向关系;免疫印迹法检测凋亡蛋白（Bcl-2、Bax）及PDK1蛋白表达。结果 与IL-1β组相比,IL-1β+si-XIST组XIST表达下调,细胞活力升高,凋亡率降低,Bax表达及TNF-α、IL-1β、IL-6水平下降,Bcl-2表达及IL-4、IL-10水平升高（P<0.05）。XIST直接靶向下调miR-302a-3p表达,miR-302a-3p下调可恢复si-XIST介导的促增殖、抗凋亡和炎症反应作用（P<0.05）。PDK1是miR-302a-3p的靶基因,沉默PDK1可抑制细胞的炎症反应（P<0.05）。结论 敲低XIST可提高IL-1β诱导软骨细胞的细胞活力,减轻OA样软骨细胞损伤,其作用机制与靶向上调miR-302a-3p进而抑制PDK1表达有关。     

通络止痛凝胶制剂对KOA滑膜组织中p53/miR-502-5p/NF-κBp65的影响

目的:观察通络止痛凝胶制剂对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)滑膜组织中p53、miR-502-5p、NF-κBp65的影响,探讨通络止痛凝胶制剂治疗KOA的作用机制。方法:选取8周龄Wistar大鼠36只,体重200～220 g,平均208 g,采用随机数字表法分为正常组、模型组、中药组,每组12只。采用改良Hulth法建立KOA模型,造模4周后,中药组给予通络止痛凝胶制剂外擦,3次/天,共2周;正常组和模型组正常饲养、不干预。治疗结束后,观察各组标本形态学变化;采用qPCR检测滑膜组织miR-502-5p的变化,再分别采用qPCR、Western Blot法检测滑膜组织p53、NF-κBp65、IL-1β、TNF-α、MMP-13的含量。结果:(1)标本形态学观察结果,模型组关节软骨透明度下降、表面不平整,滑膜肥厚增生并有大量炎性细胞浸润,关节液质地较黏稠;中药组关节软骨透亮度下降不明显,关节面较平整,滑膜轻度增生并有少量炎性细胞浸润,关节液质地较清晰。(2)与正常组比较,模型组、中药组滑膜组织miR-502-5p含量升高(P0.05),p53的mRNA及蛋白表达下降(P0.05),NF-κBp65、IL-1β、TNF-α、MMP-13的mRNA及蛋白表达升高(P0.05)。(3)与模型组比较,中药组滑膜组织miR-502-5p含量降低(P0.05),p53的mRNA及蛋白表达升高(P0.05),NF-κBp65、IL-1β、TNF-α、MMP-13的mRNA及蛋白表达降低(P0.05)。结论 :滑膜组织中p53、miR-502-5p、NFkBp65的表达与滑膜的增生及炎症反应密切相关,通络止痛凝胶制剂可能是通过调控滑膜组织中p53、miR-502-5p、NF-κBp65的表达,从而减轻KOA滑膜的增生及炎症反应。     

异丙酚通过调控miR-506对骨肉瘤细胞增殖、迁移侵袭及凋亡的影响

目的:研究异丙酚是否通过调控微小RNA(miRNA/miR)-506影响骨肉瘤细胞增殖、迁移侵袭及凋亡。方法:骨肉瘤HOS细胞分为NC组(未处理)、Pro-L组(1 μg/mL异丙酚)、Pro-M组(5 μg/mL异丙酚)、Pro-H组(10 μg/mL异丙酚)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-506组(转染miR-506 mimic)、Pro+anti-miR-NC组(转染antimiR-NC+10 μg/mL异丙酚)、Pro+anti-miR-506组(转染miR-506 inhibitor+10 μg/mL异丙酚)。应用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法测定细胞增殖,免疫印迹实验(Western blotting)评估细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达,Transwell实验检测迁移侵袭,流式细胞术分析细胞凋亡,荧光定量PCR测定miR-506表达。结果:与NC组比较,Pro-L、Pro-M、Pro-H组HOS细胞的抑制率、p21、Bax蛋白水平、凋亡率和miR-506表达水平逐渐增加,CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平、迁移细胞数和侵袭细胞数逐渐减少,且呈浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-506组HOS细胞的抑制率、凋亡率、p21、Bax蛋白水平比miR-NC组升高,迁移细胞数、侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平比miR-NC组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Pro+anti-miR-506组较Pro+anti-miR-NC组降低HOS细胞中miR-506表达水平、抑制率、凋亡率、p21、Bax蛋白水平,提高迁移细胞数、侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平,差异有统计学意义(P<0.05)。结论: 1、5、10 μg/mL异丙酚上调miR-506的表达,抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移侵袭,并且促进其凋亡。     

LncRNA MEG3调控miR-133a-3p/TGF-β1/Smads轴促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制

目的 探究LncRNA MEG3调控miR-133a-3p/TGF-β1/Smads信号轴对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cell, hBMSC)成骨分化中的影响。方法 通过构建慢病毒载体及慢病毒包装,将含有目的基因的慢病毒感染细胞。将hBMSC分为Control组、NC组、MEG3、sh-MEG3、MEG3+miR-133a-3p sponge及MEG3+miR-133a-3p组,成骨诱导后,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色和茜素红染色检测ALP活性及钙盐沉积,qRT-PCR检测各组细胞中MEG3、miR-133a-3p、TGF-β1、TGF-βR1、smad2、smad3、smad4、Runx2及OPN mRNA表达水平,Western blot检测TGF-β1、TGF-βR1、smad2、smad3、smad4、Runx2及OPN蛋白表达量。结果 与NC组比较,MEG3组的ALP活性及茜素红钙盐沉积明显减弱,MEG3 mRNA上调,miR-133a-3p mRNA表达显著升高,TG...     

miR-21靶向PTEN调节PI3K/AKT通路对狼疮性肾炎患者肾小球系膜细胞增殖及炎性因子分泌的影响

目的:探讨miR-21靶向磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)调节磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路对人肾小球系膜细胞(human mesangial cells, HMCs)增殖及炎性因子分泌的影响。方法:选取在我院经肾穿刺活检诊断为LN的30例患者的肾组织标本,qRT-PCR和western blot检测狼疮性肾炎肾组织中miR-21和PTEN的表达水平;HMCs随机分为5组:NC mimics组、miR-21 mimics组、pcDNA3.1-NC组、pcDNA3.1-PTEN组和miR-21 mimics+pcDNA3.1-PTEN组;TargetScan预测miR-21与PTEN的结合位点;双荧光素酶报告基因验证miR-21与PTEN的靶向关系;细胞克隆形成实验检测miR-21靶向PTEN对HMCs增殖能力的影响;细胞流式术检测miR-21靶向PTEN对HMCs凋亡率的影响;ELISA检测miR-21靶向PTEN对HMCs炎性因子生成的影响;Western blot检测miR-21靶向PTEN调节PI3K/AKT通路相关蛋白的表达。结果:miR-21在狼疮性肾炎肾组织中高表达(P=0.043),PTEN在狼疮性肾炎肾组织中低表达(P=0.037);miR-21与PTEN存在靶向关系,且miR-21靶向下调PTEN的表达(P=0.003);与NC mimics组比较,miR-21 mimics组细胞集落数目增加(P=0.003),凋亡率下降(P=0.003),TNF-α、IL-1β和IL-6的含量增加(均P=0.000),PTEN蛋白表达水平下调(P=0.003)、PI3K和AKT蛋白表达水平上调(P=0.025,P=0.004);与pcDNA3.1-NC组比较,pcDNA3.1-PTEN组细胞集落数目减少(P=0.032),凋亡率上升(P=0.035),TNF-α、IL-1β和IL-6的含量减少(P=0.003,P=0.037,P=0.029),PTEN蛋白表达水平上调(P=0.002)、PI3K和AKT蛋白表达水平明显下调(均P=0.003);与miR-21 mimics组比较,miR-21 mimics+pcDNA3.1-PTEN组细胞集落数目减少(P=0.003),凋亡率上升(P=0.000),TNF-α、IL-1β和IL-6的含量减少(P=0.003,P=0.004,P=0.004),PTEN蛋白表达水平上调(P=0.003)、PI3K和AKT蛋白表达水平下调(P=0.031,P=0.039);与pcDNA3.1-PTEN组比较,miR-21 mimics+pcDNA3.1-PTEN组细胞集落数目增加(P=0.029),凋亡率下降(P=0.031),TNF-α、IL-1β和IL-6的含量增加(P=0.000,P=0.003,P=0.003),PTEN蛋白表达水平下调(P=0.003),PI3K和AKT蛋白表达水平上调(P=0.002,P=0.003)。结论:miR-21靶向PTEN对人肾小球系膜细胞的增殖、凋亡及炎性因子的分泌有一定影响,可能与PI3K/AKT通路有关。     

红景天苷通过JAK2/STAT3通路抑制退变髓核细胞的炎症反应和凋亡

目的观察红景天苷对退变髓核细胞凋亡和炎症反应的影响,并探究其与JAK2/STAT3信号通路的关系。方法通过氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)培养建立退变髓核细胞模型,退变细胞分别予浓度为10μg/mL、30μg/mL和50μg/mL的红景天苷培养液。后续实验选择30μg/mL浓度进行,分为Control组、OGD组、红景天苷组、AG490(JAK2/STAT3信号通路抑制剂)组和红景天苷联合AG490干预组。RT-PCR法检测髓核细胞蛋白聚糖(Aggrecan)和Ⅱ型胶原(Col2a1)表达水平;Western blot检测红景天苷对髓核细胞p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的影响;ELISA检测上清液中炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平,流式细胞术检测髓核细胞的凋亡。结果与Control组相比,OGD组Aggrecan和Col2a1 mRNA表达明显降低,炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平明显上调。与OGD组相比,红景天苷组显著抑制细胞凋亡以及炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放,同时,我们发现,AG490组和红景天苷联合AG490干预组上述指标均明显降低,其中红景天苷联合AG490干预组各检测指标较AG490组略低。红景天苷联合AG490干预明显改善髓核细胞的凋亡和炎症反应,并抑制JAK2和STAT3的磷酸化水平。结论红景天苷可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路的活化而减轻退变髓核细胞炎症因子的产生和细胞凋亡。     

雷公藤红素对IL-1β致软骨终板退变的影响

目的通过IL-1β与雷公藤红素体外刺激小鼠椎间盘软骨终板细胞,探讨雷公藤红素能否抑制IL-1β对软骨终板细胞的影响。方法不同浓度的雷公藤红素刺激软骨终板细胞,CCK-8法检测不同时间点其对软骨终板细胞增殖作用的影响;实验共分3组:空白对照组(无血清DMEM培养基),IL-1β诱导组(IL-1β5 ng/mL共同孵育2 h),雷公藤红素干预组(经IL-1β5ng/mL共同孵育2 h后,再以雷公藤红素共同孵育24 h)。分组处理后,ELISA法检测MMP-1、MMP-3的水平,同时荧光定量PCR检测蛋白多糖及II胶原的mRNA表达水平。结果与空白对照组相比,IL-1β刺激软骨终板细胞2 h后,MMP-1、MMP-3表达水平明显增高,雷公藤红素可抑制细胞中IL-1β介导的MMP-1、MMP-3的表达,同时IL-1β明显抑制软骨终板细胞的蛋白多糖及II胶原mRNA的表达,而雷公藤红素可上调IL-1β诱导的蛋白多糖及II胶原mRNA的表达水平。结论雷公藤红素能够抑制IL-1β介导的软骨终板退变进程,上调蛋白多糖及II胶原mRNA的表达水平,可能在防治椎间盘退变性疾病中发挥重要作用。     

萝卜硫素改善LPS诱导肾小管上皮细胞损伤的作用机制研究

目的:探讨萝卜硫素对脓毒症肾损伤的影响和可能机制。方法:体外培养肾小管上皮细胞HK-2，用不同剂量(5、10、20μmol/L)萝卜硫素孵育24 h后，再用LPS干预8 h。酶联免疫吸附法检测IL-6、IL-1β和TNF-α表达，流式细胞术检测凋亡，蛋白质印迹法检测cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达，qRT-PCR检测miR-22-3p表达。转染miR-22-3p模拟物或抑制剂至HK-2细胞后，用LPS干预8 h或用20μmol/L萝卜硫素孵育24 h后再用LPS干预8 h，上述相同方法检测IL-6、IL-1β和TNF-α表达、细胞凋亡及cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达。结果:与LPS组比较，萝卜硫素降低LPS诱导的HK-2细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平、细胞凋亡率及cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达，增加miR-22-3p表达。上调miR-22-3p降低LPS诱导的HK-2细胞IL-6、IL-1β和TNF-α水平、细胞凋亡率及cleaved-caspa...     

长链非编码RNA NEAT1调控miR-486/FOXO1轴参与椎间盘髓核细胞退变的机制研究

【摘要】 目的：明确长链非编码RNA核富集转录本1（lncRNA NEAT1）、miR-486、FOXO1之间的相互关系,探讨三者在椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IDD）组织中的表达及相关性,阐明NEAT1通过调控miR-486/FOXO1轴参与IDD进展的具体机制。方法：利用双荧光素酶报告基因、RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation,RIP）试验等明确NEAT1、miR-486与叉头框蛋白O1（forkhead box protein O1,FOXO1）的生物学关系;采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）、免疫印迹（Western blot）检测15例对照和30例IDD髓核组织中NEAT1、miR-486与FOXO1的表达,统计其与Pfirrmann分级的关系;采用白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）诱导法构建髓核细胞退变模型,NEAT1小干扰RNA（NEAT1 small interfering RNA,si-NEAT1）和过表达质粒转染髓核细胞构建细胞沉默或过表达模型;细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）和流式细胞术检测髓核细胞增殖和凋亡;RT-qPCR检测细胞NEAT1与miR-486表达;Western blot检测FOXO1及细胞外基质（extracellular matrix,ECM）中聚集蛋白聚糖（aggrecan）、二型胶原（collagen Ⅱ）、基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase, MMP-13）和含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样基质金属蛋白酶4（a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type l motifs 4,ADAMTS4）的表达。结果：NEAT1可通过碱基互补配对方式海绵吸附miR-486;miR-486靶向FOXO1的3′-非编码区（3′-UTR）抑制FOXO1蛋白表达。在IDD髓核组织中,NEAT1与FOXO1表达上调,与Pfirrmann分级呈显著正相关（P<0.001）;而miR-486表达下调,与Pfirrmann分级呈显著负相关（P<0.001）。分子细胞学实验证实,IL-1β诱导髓核细胞退变后,NEAT1的过表达进一步促进了髓核细胞凋亡（P<0.01）,加重了Aggrecan和Collagen Ⅱ的表达抑制（P<0.01）,增强了MMP-13和ADAMTS4的表达（P<0.01）;相比之下,NEAT1的沉默则逆转了髓核细胞凋亡（P<0.01）,有效恢复了Aggrecan和Collagen Ⅱ表达（P<0.01）,同时显著降低了MMP-13和ADAMTS4的表达（P<0.01）。结论：NEAT1调控miR-486/FOXO1分子轴并促进髓核细胞凋亡和ECM降解进而参与IDD病理机制过程。     

红花提取物对高糖处理的小鼠足细胞损伤的影响

目的:探讨红花提取物对高糖处理的小鼠足细胞增殖、凋亡和炎症因子分泌的影响及分子机制。方法:将小鼠足细胞MPC5分为对照(NC)组、高糖(HG)组、不同浓度红花提取物组、红花提取物+HG组、miR-NC+HG组、miR-516a-5p+HG组、anti-miR-NC+HG组、anti-miR-516a-5p+HG组、红花提取物+miR-NC+HG组、红花提取物+miR-516a-5p+HG组。MTT检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;RT-qPCR检测miR-516a-5p表达水平;ELISA检测白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果:红花提取物处理后,高糖处理的小鼠足细胞中细胞活性升高,细胞凋亡率降低,IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低,miR-516a-5p表达水平降低(P0.05)。过表达miR-516a-5p促进高糖处理的小鼠足细胞炎症因子表达和细胞凋亡,抑制细胞增殖;抑制miR-516a-5p表达与其作用相反。miR-516a-5p过表达可以逆转红花提取物对高糖处理的MPC5细胞增殖、凋亡,炎症因子表达的影响。结论:红花提取物可能通过下调miR-516a-5p表达抑制高糖处理的小鼠足细胞炎症因子表达和细胞凋亡,促进细胞增殖。     

微小RNA-27b-3p与基质金属蛋白酶13在人软骨细胞的对应关系

目的探讨微小RNA-27b-3p(miR-27b-3p)与基质金属蛋白酶-13(MMP-13)在人软骨细胞表达及其靶向对应关系。 方法运用蛋白质印迹法(WB)与实时定量PCR技术(qRT-PCR)明确miR-27b-3p与MMP13在正常和骨关节炎(OA)人软骨细胞的表达。利用不同浓度的白介素(IL)1β干预原代人软骨细胞24 h,或利用不同时间点的IL-1β(10 ng/ml)干预原代人软骨细胞。利用原位杂交、转染及双荧光素酶报告技术确定miR-27b-3p与MMP13的靶向对应关系;结合运用核转录因子-κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路抑制剂评估其作用机制。两组资料比较采用独立样本t检验,多组资料比较采用单因素方差分析,LSD法多重比较检验。 结果WB、qRT-PCR和原位杂交检测结果显示,与正常软骨相比,OA软骨中miR-27b-3p表达降低(t＝5.07,P<0.01),MMP13表达升高(t＝－6.31,P<0.01)。IL-1β干扰后的结果显示miR-27b-3p表达降低(F＝129.54,P<0.05),MMP-13表达升高(F＝394.50,P<0.05)。通过TargetScan数据库和荧光素酶报告基因检测结果分析,野生型-MMP13组荧光素酶活性降低(F＝55.27,P<0.001),突变型-MMP-13荧光素酶活性变化没有统计学意义(P＝0.654)。利用特异性MAPK信号抑制剂和NF-kB抑制剂干预IL-1β诱导软骨细胞模型结果提示,与对照组相比,抑制剂组的MMP13表达水平降低(F＝28.43,P<0.001),miR-27b-3p表达水平增高(F＝35.04,P<0.001)。 结论miR-27b-3p在OA软骨细胞呈现低表达,并负向调控MMP13的表达,其作用机制可能是通过NF-κB和MAPK信号通路,这结果提示这miR-27b-3p可能作为OA诊断与治疗的潜在靶点。     

miR-140对早期骨关节炎软骨细胞衰老的调控作用及机制

[目的]探索miR-140对早期骨关节炎(OA)软骨细胞衰老的调控作用及机制。[方法]收集人膝关节正常、早期OA(E-OA)和中晚期OA(ML-OA)软骨组织,酶消化法获得相应组别软骨细胞。首先,PCR检测各组miR-140水平,流式细胞仪分析细胞周期,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-βGal)试剂盒分析SA-βGal活性,PCR和免疫细胞化学法检测衰老分子p16~(INK4a)、p21和p53的表达。然后,取E-OA软骨细胞设空白、IL-1β、miR-Scr和miR-140 mimic组并给予相应干预,检测并比较各组miR-140水平。最后,取E-OA软骨细胞设空白、IL-1β、miR-Scr+IL-1β和miR-140 mimic+IL-1β组并给予相应干预,分析和比较各组细胞周期、SA-βGal活性及衰老分子表达情况。[结果]正常、E-OA和ML-OA三组间miR-140水平、G0/G1期细胞比例(G0/G1%)、SA-βGal活性及衰老分子水平比较差异均有统计学意义(P<0.05),miR-140水平与OA分级呈显著负相关(P<0.05),而G0/G1%、SA-βGal活性及衰老分子阳性率与OA分级呈显著正相关(P<0.05)。在E-OA软骨细胞中,与空白组相比,IL-1β组miR-140水平显著降低(P<0.05),miR-Scr组无明显改变(P>0.05),miR-140 mimic组显著升高(P<0.05)。在E-OA软骨细胞中,IL-1β组G0/G1%、SA-βGal活性及衰老分子表达均显著高于空白组(P<0.05)、与miR-Scr+IL-1β组相比差异无统计学意义(P> 0.05),miR-140+IL-1β组G0/G1%、SA-βGal活性及衰老分子表达均显著低于miR-Scr+IL-1β组(P<0.05)。[结论]软骨细胞衰老与OA发生发展密切相关,上调miR-140表达可有效抑制E-OA软骨细胞衰老,是延缓E-OA进展的潜在治疗策略。