肺炎链球菌毒力因子ClpP蛋白酶的体外表达及纯化

目的构建ClpP原核表达载体,获取原核表达的ClpP蛋白分子。方法分离培养TIGR4型肺炎链球菌,获取其染色体DNA,采用基因体外重组的方法将完整的ClpP读码框克隆到pET-32a原核表达载体,并经测序鉴定,所表达的抗原蛋白用Western blot鉴定,镍柱纯化并透析复性,真空冷冻干燥保存。结果测序结果证实克隆的基因与GenBank中的序列相符,Western blot证实获得了ClpP融合蛋白。结论获得了高表达的重组抗原蛋白,经镍柱纯化后纯度可达90％以上。     

肺炎链球菌毒力相关基因检测及临床意义

目的:检测肺炎链球菌临床分离株毒力基因存在情况。方法:以临床分离出的91株肺炎链球菌作为研究对象,利用PCR法对肺炎链球菌5种毒力基因实施检测。结果:在全部的91株肺炎链球菌中LytA、PsaA、NanA、PspA、Ply这5种基因的检测阳性率分别为94.5%、85.7%、85.7%、61.5%、82.4%。结论:肺炎链球菌毒力因子是肺炎链球菌致病的基础,5种常见的毒力基因在肺炎链球菌检测中,其阳性率都比较高,此实验为进一步阐明毒力因子的作用机制并应用于指导抗肺炎链球菌新药和新型疫苗研制奠定了一定的基础。     

HtrA基因缺陷对肺炎链球菌毒力影响的研究

目的:HtrA基因可编码肺炎链球菌的一种重要蛋白酶,本文目的是探索HtrA基因缺陷对细菌毒力的影响. 方法:用插入复制失活的方式使HtrA基因缺失,通过RT-PCR分析毒力因子表达,并通过动物试验观察HtrA基因缺陷株毒力改变情况. 结果:RT-PCR显示HtrA缺陷株毒力因子表达低于野毒株,两组比较P＜0.05;转化试验发现缺陷菌株转化力下降;小鼠毒力试验表明野毒株半数致死时间22 h,而缺陷株半数致死时间8 d,P＜0.01,有显著性差异;缺陷菌在小鼠体内被清除速度也显著快于野毒株. 结论:HtrA基因缺陷使肺炎链球菌多种毒力因子表达减弱,自然转化能力下降,毒力降低.     

clpP基因缺陷对肺炎链球菌毒力表达降低的研究

目的 探索clpP基因缺陷对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)毒力的影响.方法 用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)方法 失活clpP基因,用PCR、Western blot鉴定缺陷菌株,通过RT-PCR分析白溶素(major autoly-sin A,lytA)、表面黏附A(pneumococcal surface adhesion A,psaA)、溶血素(pneumolysin,ply)和胆碱结合蛋白A(cholinebinding protein A,cbpA)的表达,并通过动物实验观察clpP基因缺陷株毒力改变情况.结果 RT-PCR显示clpP缺陷株的4个毒力因子mRNA表达水平均低于野生菌,两者比较有统计学差异(P<0.05);小鼠毒力实验表明野生菌株半数致死时间为22 h,而缺陷株半数致死时间为8 d,两者比较有统计学差异(P<0.01);缺陷菌在小鼠体内被清除速度也显著快于野生菌株(P<0.05).结论 clpP基因缺陷使S.pn多种毒力因子表达减弱,毒力降低.     

肿瘤坏死因子单克隆抗体对小鼠肺炎链球菌感染的影响

给小鼠吸入肺炎链球菌同时在尾静脉注射肿瘤坏死因子单克隆抗体，动态检测感染后２４小时内血浆，气管肺泡灌洗液肿瘤坏死因子含量和肺病理的变化，发现肿瘤坏死因子单克隆抗体显著抑制血浆，气管肺泡灌洗液肿瘤坏死因子的升高，抑制白细胞降集，附壁，减轻白细胞对肺细胞的浸润，阻止肺实变的发生。肺炎链球菌及其产物可诱发肿瘤坏死因子释放，肿瘤坏死因子可能是肺炎链球菌感染组织损伤的主要介质。     

licD2基因缺陷导致肺炎链球菌毒力下降

目的:licD2是掌控肺炎链球菌生长所需物质胆碱代谢最重要的基因. 本研究探索licD2基因的缺陷是否影响细菌毒力. 方法:采用插入复制失活的方法缺陷licD2基因,通过相对定量RT-PCR分析其毒力因子表达情况,并利用动物体内试验观察licD2基因缺陷菌株毒力改变. 结果:RT-PCR显示licD2缺陷菌株毒力因子表达低于野生菌,两组比较P＜0.05;转化试验发现缺陷菌株转化力下降甚至消失;小鼠毒力试验结果野生菌株半数致死时间＜1 d,而缺陷菌株半数致死时间为>14 d, P<0.001,差异有显著性;缺陷菌在小鼠体内被清除速度也显著快于野生菌. 结论:结果提示licD2基因的缺陷使自然转化力下降,多种毒力因子表达减弱,细菌毒力降低.     

小儿呼吸道感染肺炎链球菌的耐药性分析

肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae,SP)是小儿呼吸道感染的主要致病菌，而且该菌对青霉素、头孢类抗生素的耐药率持续增高^[1～4]，为了解肺炎链球菌的耐药情况，指导临床合理用药，我们对本院小儿科患儿痰标本分离出的肺炎链球菌进行了耐药性分析．     

广东省肇庆市肺炎链球菌分子分型及毒力基因检测

目的 了解肺炎链球菌常见血清型及其5种毒力基因的携带情况,为新型疫苗开发研究和提高临床诊断提供基础科学依据。方法 选取2016年4月—2018年12月肇庆市第一人民医院住院及门诊患者分离200株肺炎链球菌,采用多重PCR分子分型方法进行血清型分型,再用单因子血清对6A/6B型进行细分。利用PCR方法对肺炎链球菌5种毒力基因（ply、pspA、nanA、psaA、lytA）进行检测,使用SPSS 19.0进行统计学分析。结果 200株肺炎链球菌来自男性患者144例,女性患者56例。0~2岁的患者最多（占67.5%）,其次是≥50岁患者为16.5%。标本类型以痰为主,占92.0%。多重PCR法分型率为95.0%,血清型以19F（37.5%）、6B(12.0%)、23F(10.0%)、19A(9.0%)、3(6.5%)、14(6%)、15B/15C(5.5%)为主。5种毒力基因检测阳性率分别为ply 93.5%、pspA 85.0%、nanA 88.5%、psaA 90.5%、lytA 93.0%。8株血培养、1株脑脊液培养及19A、3和35A/35C/42三种血清型的5种毒力基因阳性率均为100.0%。血清型14型和5型的 5种毒力基因阳性率都较低。结论 肇庆市200株肺炎链球菌的血清型以19F、6B、23F、19A、3、14、15B/15C为主,2岁以下的儿童和老年人感染率高。5种毒力基因保守性高,大部分菌株均存在。血清型不同,5种毒力基因的存在也略有不同,可为新型疫苗开发及疾病预防提供有利的依据。     

肺炎链球菌毒力因子PspA的原核表达、纯化及鉴定

目的:通过构建原核表达载体,获得肺炎链球菌毒力因子PspA重组蛋白.方法:分离培养肺炎链球菌TIGR4,获取其染色体DNA,采用基因体外重组法将PspA序列克隆到原核表达载体PET-32(a)上,用酶切及测序鉴定.将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,进行蛋白纯化,获得的重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果:克隆的DNA序列与GenBank中的数据相符,获得的重组蛋白PspA纯度达到90%.结论:成功表达和纯化了PspA,为肺炎链球菌多肽联合疫苗研制和该蛋白的结构生物学分析奠定了基础.     

肺炎链球菌comX基因可影响细菌毒力基因表达

目的:探讨肺炎链球菌的转化相关基因comX与其毒力表达的关系.方法:采用插入失活的方法制备肺炎链球菌的相关基因缺陷菌株,通过小鼠毒力实验观察它们毒力的变化,并应用RT-PCR测定肺炎链球菌的主要毒力因子透明质酸酶(phd),分泌型IgA结合蛋白(sIgA),肺炎链球菌自溶酶(lytA),肺炎链球菌神经氨酸酶A (nanA)和肺炎链球菌溶血素(ply)在细菌感受态发生过程中的表达,并比较其在野生和缺陷菌株中的表达的异同.结果:野生菌株的毒力基因受感受态刺激因子(CSP)诱导表达增加;虽comX基因缺陷菌株与野生菌株感染小鼠的能力无显著差异,但其ply基因的表达与comE基因缺陷菌株一样显著低于野生菌株的表达.结论:comX可通过细菌转化的通路影响细菌毒力基因的表达.     

门诊性病患者沙眼衣原体感染危险因素研究

通过对性病门诊Ct阳性患者66人和Ct阴性患者110人及其固定性伴（夫、妻或恋人）进行STD相关因素问卷调查，以探讨Ct感染的危险因素。结果表明在24个研究因素中经单因素分析筛选出9个与Ct感染有关联的因素；多因素非条件性Logistic回归分析，筛选出4个主要危险因素性伴数、固定性伴侣数、固定性伴之STD史、文化程度。结果提示Ct感染的主要危险因素有①性伴数多；②其固定性伴性生活活跃，且有性乱交倾向；③文化程度低。     

一起人感染猪链球菌病疫情的流行病学和病原学研究

目的查明我市一起人感染猪链球菌病的病原学、感染途径和流行特征,为制定预防控制措施提供依据。方法对2006年2月27日我市发生的一起人感染猪链球菌病疫情进行流行病学调查和病原学检测。结果患者生猪屠宰时手指有外伤史,临床上潜伏期短,病程进展迅速,有淤斑、出血点,呈中毒性休克综合征;患者血液中分离的细菌经微生物检测、生化检测、血清学检测和PCR检测结果为猪链球菌Ⅱ型。结论加强对养殖人员和屠宰人员的健康教育,提高个人防护意识;加强对医务人员培训,提高发现、诊断和治疗此病的能力。     

广州市2例人感染猪链球菌病的流行病学调查

目的查明广州市2例人感染猪链球菌病的感染来源、流行特征,为预防控制疫情提供依据。方法采用流行病学调查方法进行回顾性调查和现场调查,采集脑脊液标本进行细菌培养、分离,用PCR进行鉴定。结果患者均有明显的生猪接触史且首例患者手部有伤口,起病急,全身中毒症状明显,病程进展迅速,均为脑膜炎型。患者脑脊液分离培养出猪链球菌经生化和PCR检测结果为猪链球菌Ⅱ型,病人经及时治疗均痊愈出院。结论2例病例均为人感染猪链球菌病（Ⅱ型）实验室确诊病例,为散发疫情,相互间无流行病学关联,传播途径可能为接触被猪链球菌污染的生猪肉。     

深圳市2起人感染猪链球菌病疫情的流行病学调查

目的 查明我市2起人感染猪链球菌病的感染途径和流行特征,为制定预防控制措施提供依据.方法 开展流行病学调查,采集脑脊液标本,用血平板进行细菌培养、分离,用PCR鉴定.结果 患者手部有外伤且有生猪肉接触史,临床上潜伏期短,病程进展迅速,均为脑膜炎型.患者脑脊液中分离的细菌经生化和PCR检测结果 为猪链球菌Ⅱ型.病人经过及时抢救均脱离了危险.结论 2起疫情为散发疫情,相互间无流行病学联系.传播途径为接触被猪链球菌污染的生猪肉经破损皮肤而传染.应加强卫生知识宣传和教育,提高肉食品加工人员的自我保护能力,同时要提高医务人员的诊治水平.     

春秋季肺炎支原体抗体流行状况研究

用定群研究方法,对广州地区846名健康儿童、青少年进行了春、秋季肺炎支原体(Mp)抗体流行状况的观察。结果表明,秋季Mp抗体阳性率为25.53％,是春季(4.61％)的5.54倍,说明Mp感染主要在秋季。无论男性或女性,或不同年龄组人群,秋季抗体水平都明显高于春季(P<0.01)。以上情况,对制定支原体肺炎防治对策和措施有着重要参考意义。     

不同人群泌尿生殖道沙眼衣原体感染的分子流行病学研究

目的研究引起泌尿生殖道感染的沙眼衣原体流行基因型分布和不同人群间感染的差异。方法应用巢式PCR扩增沙眼衣原体omp1基因VS1-VS2序列,利用寡核苷酸芯片技术进行基因分型。结果166株沙眼衣原体感染标本中,通过基因分型共检出182株菌。包括9个基因型,总体优势流行型为E型(27.5%)、F型(22.0%)、D型(14.3%)、J型(15.0%)和H型(8.8%)。113例性病门诊病人中,以F(26.9%)、E(24.3%)、J(16.8%)、D(13.4%)和H(8.4%)型为主,混合型感染率为5.3%(6/113)。而53例卖淫女性标本中,发现混合感染8例(15.1%,8/53),以E(33.3%)、D(15.9%)、F(15.9%)和K(12.7%)型为主,混合感染率为15.1%(8/53)。F型在门诊病人中的流行率显著高于卖淫女性(!2=4.8,P<0.05),而混合型感染率和K型流行率卖淫女性显著高于门诊病人(!2=4.5,P<0.05;!2=7.4,P<0.01)。结论性病门诊患者和卖淫女性沙眼衣原体感染流行血清型存在差异。加强沙眼衣原体感染的分子流行病学研究对于有效控制性病传播有重要意义。     

大环内酯类药物对肺炎链球菌的防耐药突变浓度的研究

目的 测定大环内酯类药物对肺炎链球菌的防耐药突变浓度(mutant prevention concentration,MPC),扩增突变选择窗(mutant selection window,MSW)内筛选的耐药突变体的耐药基因,以了解肺炎链球菌对大环内酯类药物耐药的发生机制.方法 肉汤法富集1010CFU/ml ATCCA9619,采用平板二倍稀释法测定罗红霉素和阿奇霉素对ATCC49619的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)、MIC99、初测MPC(Provisional MPC,MPCpr)以及MPC.PCR法扩增不同药物筛选出的耐药突变株的耐药基因ermB和mefA并测序.结果 罗红霉素和阿奇霉素对ATCC49619的MPC分别为0.80μg/ml和0.51 μg/ml,细菌耐药选择指数(MPC/MIC99)为5.0和3.9.筛选出的耐药突变株中扩增出ermB耐药基因.结论 通过凋整药物剂量,可以限制对大环内酯类耐药的肺炎链球菌突变体的富集.肺炎链球菌对大环内酯类药物耐药机制可能与携带ermB基因有关.     

妊娠期B族溶血性链球菌感染的影响因素研究

背景B族溶血性链球菌（GBS）感染可引起妊娠期宫内感染及产后子宫内膜炎,并增加早产或死胎风险,因此需要提高GBS检出率,同时识别其感染的影响因素。目的探讨妊娠期GBS感染的影响因素。方法选取2017年1月至2021年8月于北京大学国际医院妇产科进行GBS筛查的孕晚期孕妇11 248例作为研究对象,按不同的采样和检测方法将研究对象分为单拭子-培养法组（n=4 479）、双拭子-培养法组（n=1 239）和双拭子-PCR法组（n=5 530）,比较三组GBS检出率。另选取2019年2月至2021年8月于北京大学国际医院进行双拭子-PCR法筛查GBS阳性的孕妇305例,选取同期、同方法检测GBS阴性的孕妇2 650例,查询病历并记录相关资料,分析产时高危因素对GBS感染的影响。选取双拭子-PCR法筛查中GBS阳性同时在妊娠期进行了阴道微生态状态检测的孕妇294例,采用随机数字表法从双拭子-PCR法筛查GBS阴性同时在妊娠期进行了阴道微生态状态检测的孕妇中抽取孕妇367例,分析阴道微生态状态对GBS感染的影响。结果单拭子-培养法组GBS阳性率为5.94%（266/4 479）,双拭子-培养法组GBS阳性率为8.07%（100/1 239）,双拭子-PCR法组GBS阳性率为10.31%（570/5 530）,其中双拭子-培养法组和双拭子-PCR法组GBS阳性率高于单拭子-培养法组,双拭子-PCR法组GBS阳性率高于双拭子-培养法组（P<0.017）。多元Logistic回归分析结果显示,阴道清洁度Ⅲ~Ⅳ度是孕妇发生GBS感染的危险因素〔OR=3.005,95%CI（1.220,7.403）,P=0.017〕。结论进行双拭子采样并采用PCR检测方法可以提高GBS阳性率检出率,妊娠期阴道炎是GBS感染的高危因素,需在诊疗过程中更多关注。     

武汉地区肺炎链球菌的红霉素耐药性分析及血清分型研究

目的 研究武汉地区肺炎链球菌的红霉素耐药率、耐药表型及肺炎链球菌血清分型分布情况.方法 以琼脂稀释法测定红霉素、青霉素及其他大环内酯类等抗菌药物对304株肺炎链球菌的最低抑菌浓度(MIC),采用荚膜肿胀试验进行血清分型,以双纸片法测定红霉素耐药菌株的耐药表型.结果 304株肺炎链球菌红霉素耐药率高达84.21%(256/304).红霉素耐药菌株中,cMLSB型耐药占98.44%(252/256),M型耐药仅占1.56%(4/256).血清分型涉及20个血清型、群,主要集中在19、23、6、15和14血清群,其中PNSSP集中分布在6、19、23和未分型血清群.结论 武汉地区红霉素不敏感肺炎链球菌的发生率较高,其耐药表型以cMLSB型为主,双纸片法对此耐药表型的检测有很好的预见性.血清分型,尤其多重耐药菌株以6、19和23血清群为主,推荐采用疫苗免疫预防肺炎链球菌感染.     

红霉素体外诱导肺炎链球菌耐药的研究

目的 通过体外诱导获得肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)耐药菌株,对比分析S.pn诱导耐药前后红霉素结合域的变异.方法 采用最低抑菌浓度(MIC)递增方法对S.pn标准菌株tigr4、tigr2 临床分离敏感株进行红霉素体外诱导耐药,PCR与RT-PCR对诱导前后rplD、rplV基因以及23S rRNA扩增并测序,CPHmodels-2.0蛋白质空间构象预测系统对诱导前后rplD、rplV基因编码的核糖体蛋白L4和L22进行空间构象预测分析.结果 诱导后tigr4 MIC由0.031 2 mg/L增加到256 mg/L,而临床分离敏感株MIC均由0.031 2 ms/L增加到32 ms/L.诱导前后测序结果对比显示标准菌株tigr4核糖体蛋白L4发生V32A变异,L22发生D35G变异,而临床分离敏感株核糖体蛋白L4发生Q67R、K68E变异.空间构象分析L22的D35G及L4的Q67R、K68E变异导致其相应的表面空间构象发生明显改变.结论 S.pn可通过红霉素体外诱导而导致耐药,其耐药机制与红霉素结合域发生新的变异有关.