激活蛋白-1对香烟烟雾提取物诱导气道 黏蛋白5AC基因表达的调控作用

目的：了解激活蛋白-1（AP-1）参与调控香烟烟雾诱导的气道黏蛋白（MUC）5AC表达的作用机制,探讨此过程中AP-1活化的可能信号途径。 方法：体外培养人气道上皮细胞BEAS-2B,给予香烟烟雾提取物（CSE）刺激,干预实验用c-Jun 的显性负性突变体TAM67转染细胞阻断AP-1的DNA结合活性;用SP600125和PD98059预处理分别阻断c-Jun氨基端激酶（JNK）和细胞外信号调节激酶（ERK）的活性。以ELISA法检测MUC5AC蛋白含量,Western印迹检测磷酸化JNK（p-JNK）、磷酸化ERK（ p-ERK）和磷酸化P38（ p-P38）含量,RT-PCR检测MUC5AC mRNA 表达水平, EMSA测定AP-1的 DNA结合活性。 结果：CSE（1 g/L）刺激后MUC5AC mRNA表达水平和蛋白含量明显高于对照组（均P＜0.01）,AP-1 的DNA结合活性也明显强于对照组（P＜0.01）,伴随p-ERK和p-JNK蛋白含量显著增加,与对照组相比,差异有统计学意义（均P＜0.01）,而P38含量无明显变化(P＞0.05);与CSE组相比,TAM67转染细胞后MUC5AC mRNA表达水平和蛋白含量均显著降低 (P＜0.01);与CSE组相比,用SP600125或PD98059处理细胞后可明显抑制AP-1的 DNA结合活性 (均P＜0.05),并下调MUC5AC蛋白含量和mRNA的表达（均P＜0.05）。 结论：AP-1参与调控CSE诱导的气道MUC5AC基因表达的过程,此过程是由JNK和ERK信号转导通路激活AP-1,再由AP-1与MUC5AC启动子上AP-1 DNA反应元件结合后在转录水平上调MUC5AC的表达而实现的。     

白细胞介素-13 刺激大鼠气道黏液高分泌的分子机制

目的研究白细胞介素-13(IL-13)在体内对支气管/肺黏液分泌的作用并探讨其作用机制。方法所有SD大鼠被随机分为IL-13组、对照组和IL-13 plus SP600125组。Western检测大鼠支气管/肺组织黏蛋白(MUC)5AC,磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)和磷酸化c-Jun氨基端激酶1/2(p-JNK1/2)的表达变化,RT-PCR检测大鼠支气管/肺组织STAT4和STAT6 mRNA表达水平。EMSA检测通路下游作用因子FOXA2和激活蛋白1的表达。结果同对照组相比,IL-13刺激10 h后大鼠支气管/肺组织MUC5AC和p-JNK1/2表达升高,而p-ERK1/2表达无显著变化;使用SP600125阻断JNK通路表达后,MUC5AC表达减弱;IL-13刺激10 h后大鼠支气管/肺组织STAT4 mRNA表达无显著变化,STAT6 mRNA表达显著升高,EMSA提示IL-13刺激后大鼠支气管/肺组织FOXA2结合活性显著降低,而激活蛋白1结合活性没有明显变化。结论 IL-13能够刺激大鼠支气管/肺组织黏液分泌,其作用机制可能是通过调控STAT6-FOXA2信号通路。     

ROS／Src／JNK信号通路在香烟诱导气道上皮细胞黏液高分泌中的作用

目的 探讨在香烟诱导气道上皮细胞黏蛋白MUC5AC表达过程中Src/JNK信号通路的作用.方法 香烟抽提物预处理的人气道上皮A549细胞,分别以活性氧(ROS)清除剂DMTU、JNK特异性抑制剂SP600125及Src激酶抑制剂PP2干预.测定各组细胞中ROS的含量,采用RT-PCR、ELISA法观察细胞黏蛋白(MUC)5AC转录水平及培养上清液中MUC5AC蛋白水平的改变,以Western blot法检测细胞表皮生长因子受体(EGFR)的蛋白表达.结果 细胞暴露于不同浓度的香烟抽提物中,ROS的量呈浓度递增;ROS清除剂DMTU显著降低香烟所致的Src磷酸化;Src特异性抑制剂PP2处理组中的JNK磷酸化水平与对照组比较有明显下降,MUC5AC的表达水平也明显降低;JNK特异性抑制剂SP600125组中MUCSAC的蛋白表达和基因转录水平较对照组均明显降低.结论 ROS-Src-JNK信号通路可能参与A549上皮细胞中MUCSAC的表达调控.     

PM2.5致人支气管上皮细胞MUC5AC高分泌的机制研究

目的探究PM2.5(Particles with an aerodynamic diameter of less than 2.5μm,PM2.5)对人支气管上皮细胞(16-HBE)黏蛋白5AC(MUC5AC)高分泌可能的分子机制影响,为PM2.5引起的气道粘液高分泌以及慢性气道疾病的治疗和预防提供重要的理论依据。方法细胞实验:采用不同浓PM2.5(1.6、8.0、40.0μg/mL)处理16-HBE细胞24h后,RT-PCR和WesternBlot检测MUC5AC表达变化;建立稳定表达MUC5AC的HEK-293细胞稳转株,通过String蛋白质相互作用预测、LC-MS/MS分析、pulldown和Co-IP实验验证MUC5AC相互作用蛋白;Western Blot检测不同浓度PM2.5处理细胞后p-Akt和Akt表达变化;特异性PI3K/Akt抑制剂LY294002处理细胞后,检测MUC5AC蛋白表达变化。动物实验:饲养Wistar大鼠(6-8周),颈部中线下切开皮肤,暴露气管,在环状软骨之间插入灌注针头,按7.5 mg/kg毒剂量经气管注入PM2.5,RT-PCR、Western Blot和免疫组化检测肺气管组织MUC5AC、p-Akt和Akt表达变化。结果不同浓度PM2.5处理细胞和动物后,可以上调MUC5AC和p-Akt蛋白表达,但对Akt表达无显著影响;蛋白质互作显示,GALNT14可以与MUC5AC相互作用调节气道黏液分泌;抑制PI3K/Akt信号通路能够有效降低MUC5AC蛋白的表达。结论 PM2.5可以通过激活PI3K/Akt信号通路促进人支气管上皮细胞MUC5AC与GALNT14相互作用进而导致气道黏液分泌增加。     

TIM-1对哮喘小鼠气道MUC5AC及Th2细胞因子表达的影响

目的 研究T细胞免疫球蛋白-黏蛋白-1(TIM-1)表达对哮喘小鼠气道MUC5AC及Th2细胞因子的作用,探讨气道黏液高分泌的机制。方法 30只健康雌性C57BL/6小鼠,按随机数字表法分为正常组、哮喘组和TIM-1抗体组,每组10只。检测小鼠外周血单个核细胞（PBMCs）TIM-1+细胞比例、气道MUC5AC mRNA表达、肺泡灌洗液（BALF）中IL-13、IL-4、IL-5表达及黏液细胞和细胞内黏液量的改变。结果（1）哮喘组及TIM-1抗体组小鼠外周血PBMCs中TIM-1+ 细胞比例（11.20%,5.11%）均显著高于正常组（0.64%,P<0.05);而TIM-1抗体组明显低于哮喘组（P<0.05）。（2）哮喘及TIM-1抗体小鼠气道黏液细胞MUC5AC mRNA相对表达(17.3±1.4,5.6±0.3)及IL-13[(16.80±0.63) ng/ml,(5.70±0.64)ng/ml]、IL-4[（614.72±117.39）pg/ml,（325.78±86.54）pg/ml]、IL-5[（1681.13±613.55）pg/ml,（513.42±86.87）pg/ml]表达量均显著高于正常组[1, (1.09±0.25)ng/ml,（17.56±3.01）pg/ml,（30.78±9.67）pg/ml ],TIM-1抗体组小鼠上述指标显著低于哮喘组（P<0.05）。（3）气道MUC5AC及IL-13表达与TIM-1+细胞表达均呈正相关,r1=0.946,P1=0.004; r2=0.984,P2=0.000. 结论 哮喘小鼠外周血TIM-1+细胞升高,可致气道黏液过度分泌;抑制TIM-1表达可减少哮喘气道黏液高分泌。调节TIM-1表达有可能成为减少黏液高分泌及治疗哮喘的新途径。     

JNK酶活性下调对人前列腺癌、肝细胞癌和乳腺癌细胞生长的抑制作用

目的：通过c-Jun氨基末端激酶（JNK）抑制剂SP600125和脂质纳米粒子包裹的JNK-siRNA 2种方法在体内和体外分别对JNK基因的表达进行干扰,探讨下调JNK酶活性在肿瘤治疗中的作用。方法：体外实验,将实验分为siRNA组和抑制剂SP600125组。在siRNA组中,使用JNK-siRNA及其对照NC-siRNA分别转染人前列腺癌细胞（PC细胞）、人肝细胞癌细胞（SMMC-7721细胞）和人乳腺癌细胞（MCF-7细胞）;在抑制剂SP600125组中将SP600125导入肝细胞癌细胞中,采用Western blotting法检测转染JNK-siRNA和SP600125后人前列腺癌、肝细胞癌和乳腺癌细胞中JNK或磷酸化JNK（p-JNK）蛋白表达水平;采用WST-1增殖实验检测各组肿瘤细胞的细胞活力。体内实验,通过皮下注射SMMC-7721细胞建立小鼠皮下肝细胞癌移植瘤动物模型,将8只小鼠饲养至肿瘤生长至3 mm×3 mm,再将模型小鼠随机分为抑制剂SP600125组和阴性对照组,JNK-siRNA组和NC-siRNA对照组,共4组,各组小鼠分别瘤内注射5 nmol SP600125、阴性对照溶液、脂质纳米粒子包裹的JNK-siRNA和NC-siRNA阴性对照,观察各组小鼠肿瘤体积;采用免疫组织化学染色检测肿瘤组织中JNK或p-JNK蛋白表达。结果：体外实验,与NC-siRNA对照组比较,JNK-siRNA组人前列腺癌、肝细胞癌和乳腺癌细胞中JNK蛋白表达水平降低（P<0.01）,抑制剂SP600125组肝细胞癌细胞中p-JNK蛋白表达水平较其阴性对照组明显降低（P<0.01）。体内实验,以肝细胞癌细胞为例,抑制剂SP600125组小鼠肿瘤体积较阴性对照组明显减小,而JNK-siRNA组与其阴性对照组比较肿瘤体积变化不明显。免疫组织化学染色,抑制剂SP600125组小鼠移植瘤组织中p-JNK蛋白表达量和JNK-siRNA组小鼠移植瘤组织中JNK蛋白表达量较各自阴性对照组降低（P<0.01）。结论：在体外和体内实验中下调JNK酶活性在体内和体外均能降低JNK基因的表达水平,进而抑制肿瘤细胞的生长。     

内毒素致大鼠气道黏液高分泌的研究

[摘要] 目的 探讨内毒素致大鼠气道黏液高分泌的发生机制。 方法 将12只雄性SD大鼠随机分为对照组和脂多糖组。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-10浓度。分别用HE染色、阿辛蓝-过碘酸雪夫（AB-PAS）和免疫组化染色进行气道上皮杯状细胞计数,检测气道黏液物质和MUC5AC表达。结果 LPS气道内注射后BALF中TNF-α、IL-1β和IL-10水平较对照组升高,气道上皮杯状细胞积分、气道黏液物质及MUC5AC表达明显升高（均P<0.01）。相关性分析示LPS组BALF中TNF-α、IL-1β水平与气道MUC5AC呈正相关（r分别为 0.921、0.883,均P<0.01）,IL-10与MUC5AC呈负相关（r为-0.852,P<0.05）。 结论 侵入气道的细菌致病因子可上调MUC5AC表达,引起气道黏液高分泌,其发生机制可能与失控性炎症反应有关;大鼠气道内注射LPS能成功建立气道黏液高分泌模型。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ在大鼠气道黏液高分泌中的表达及意义

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在内毒素诱导大鼠气道黏液高分泌中的作用.方法 将12只雄性SD大鼠随机分为对照组和内毒素组.采用HE染色和阿辛蓝-过碘酸雪夫(AB-PAS)染色进行气道上皮杯状细胞计数及检测气道黏液物质表达.用免疫组化染色及实时定量-PCR检测气道及肺组织黏蛋白5AC(MUC5AC)、PPARγ蛋白及mRNA表达.结果 内毒素组气道上皮杯状细胞积分、气道黏液物质、气道及肺组织MUC5AC、PPARγ蛋白及mRNA表达均较对照组升高(P<0.05).相关性分析显示,内毒素组气道及肺组织PPARγ蛋白表达水平与气道及肺组织MUC5AC mRNA表达水平呈负相关(r=-0.829,P<0.05).结论 PPARγ参与了内毒素诱导气道黏液高分泌的发生.     

Brg1通过STAT6促进哮喘气道黏液高分泌

目的研究染色质重构复合物核心催化亚基（Brg1）对哮喘小鼠气道黏液高分泌的影响及其作用机制。方法将6~8周龄 雌性野生型C57bl/6小鼠和Brg1-/-小鼠（Ⅱ型肺泡上皮细胞AEC2s上特异性条件敲低Brg1的C57bl/6小鼠）随机分为4组：正常 对照组、哮喘组、Brg1敲低对照组（Brg1-/-）和Brg1敲低后构建哮喘模型组（Brg1-/-+哮喘）,每组10只。哮喘组和Brg1-/-+哮喘组用 鸡卵清蛋白（OVA）制备过敏性哮喘模型,对照组用生理盐水代替。收取标本,用ELISA检测小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中 黏蛋白MUC5AC和IL-13的表达。糖原染色检测小鼠气道杯状细胞的增生和黏液分泌,q-PCR和免疫组化检测各组小鼠气道 黏蛋白MUC5AC的表达和定量。Western blot检测各组小鼠肺组织中STAT6、p-STAT6的表达。结果Brg1-/-+哮喘组较哮喘组 气道杯状细胞增生和黏液分泌均显著减少,BALF中IL-13、MUC5AC表达明显降低,肺组织MUC5AC mRNA表达显著降低, 同时肺组织STAT6和磷酸化STAT6显著下调。结论Brg1-/-敲低的小鼠建立哮喘模型时气道黏液分泌较野生型小鼠减轻,其可 能通过影响STAT6从而抑制黏蛋白MUC5AC的表达,抑制支气管哮喘气道黏液高分泌,表明Brg1具有促进哮喘气道黏液高分 泌的作用。     

阳和平喘颗粒对哮喘大鼠气道黏液高分泌的影响

目的 观察阳和平喘颗粒对哮喘大鼠气道黏液高分泌的干预作用,探究其作用机制.方法 将50只清洁级SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳和平喘颗粒低剂量组、阳和平喘颗粒高剂量组和地塞米松组,每组10只.采用卵清蛋白成功诱发大鼠哮喘后,并予相应药物干预8周.阿尔辛蓝过碘酸雪夫氏染色,光镜下观察气道杯状细胞;采用免疫组织化学法检测大鼠气道黏蛋白5AC（mucin 5AC,MUC5AC）的表达水平;采用Western blot、RT-PCR分别检测大鼠肺组织转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1）蛋白及其mRNA表达水平.结果 阳和平喘颗粒高、低剂量组及地塞米松组大鼠气管可见少量黏液分泌,未见明显杯状细胞增生;与模型组比较,阳和平喘颗粒高、低剂量组及地塞米松组大鼠气道组织杯状细胞面积和MUC5AC蛋白表达水平,以及肺组织TGF-β1蛋白及TGF-β1mRNA表达水平均显著降低（P＜0.01）;阳和平喘颗粒高剂量的效应显著优于低剂量,呈现明显的剂量依赖性（P＜0.01）.结论 阳和平喘颗粒可降低哮喘大鼠气道黏液高分泌,机制可能与其下调肺组织TGF-β1蛋白及其基因表达水平,抑制MUC5AC生成有关.     

肿瘤坏死因子转换酶在炎性气道黏液高分泌中的作用

目的：探讨肿瘤坏死因子转换酶(TNF-α converting enzyme,TACE)对炎症条件下气道上皮细胞形成黏液高 分泌过程的影响。方法：通过不同剂量人中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophil elastase,HNE)刺激人肺腺癌的气道 上皮细胞A549,构建炎症条件下气道黏液高分泌模型,以TACE抑制剂-1(TNF-α converting enzyme inhibitor-1,TAPI-1) 进行干预,观察TACE、黏蛋白(mucin,MUC)5AC的表达。将A549细胞分为5组：对照组,HNE(15,25,50 nmol/L) 组,TAPI-1组。RT-PCR检测各组TACE和MUC5AC mRNA的表达;Western印迹检测TACE蛋白的表达;酶联免疫吸附 测定法(ELISA)观察MUC5AC蛋白的表达。结果：各剂量HNE处理后,TACE和MUC5AC的mRNA和蛋白表达均较对照 组明显升高(P<0.01),且呈现剂量依赖性。而给予TAPI-1预处理后,与HNE刺激组比,各指标明显下调(P<0.01)。结 论：TACE参与了黏液高分泌的细胞转导途径,并可促成炎性气道黏液高分泌的形成。     

罗氟司特抑制吸烟诱导的慢性阻塞性肺疾病大鼠气道黏液高分泌的分子机制研究

目的探讨磷酸二酯酶4抑制剂罗氟司特对慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠肺组织MUC5AC表达的影响及其分子机制．方法Wistar大鼠随机分为对照组、烟雾组、罗氟司特组、烟雾＋罗氟司特组．对照组和罗氟司特组大鼠置于无烟环境中饲养,烟雾组和烟雾＋罗氟司特组大鼠暴露于有烟环境,免疫组化法检测各组大鼠肺组织MUC5AC、p-ERK1/2及p-JNK1/2的表达,WesternBlot检测MUC5AC、ERK1/2、P-ERK1/2、JNK1/2p-JNK1/2蛋白的表达情况．结果与对照组相比,烟雾组大鼠肺组织MUC5AC的阳性率显著升高．且相关通路分子ERKl／2及JNKl／2的磷酸化水平明显升高．而烟雾＋罗氟司特组MUC5AC的表达水平较烟雾组显著降低,其ERK1/2及JNK1/2的磷酸化水平低于烟雾组．结论磷酸二酯酶4抑制剂罗氟司特可能通过抑制ERK、JNK等通路活化而减少吸烟鼠肺组织MUC5AC的表达,改善COPD．     

透明质烷和CD44参与调节气道黏液高分泌的分子机制

目的了解透明质烷（HA）和CD44在气道黏液高分泌中的作用,探索信号因子活化表皮生长因子（EGF）／表皮生长因子受体（EGFR）信号通路的分子机制。方法体外培养BEAS-2B气道上皮细胞,给予中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）刺激,以活性氧（ROS）清除剂（DMTU）、透明质酸酶（Hase）、CD44抗体和组织激肽释放酶抑制剂（PI）作为干预因素。RT—PCR检测黏蛋白（MUC）5ACmRNA表达。ELISA法检测MUC5AC及EGF蛋白含量;Westernblotting分析磷酸化EGFR（p-EGFR）蛋白水平。结果NE刺激后MUC5AC、EGF、P—EGFR蛋白及MUC5ACmRNA表达均较对照组显著增高（P〈0．01）,给予DMTU干预后上述指标水平均明显降低（P〈0．01）;在加入DMTU后用Hase处理细胞,上述指标水平均较DMTU组明显升高（P〈0．05）,EGF蛋白含量增高更为明显（P〈0．01）;CD44抗体或PI处理后上述指标水平均明显低于NE组（P〈0．05）,EGF蛋白含量降低更为显著（P〈0．01）。结论NE可刺激细胞产生ROS,后者可裂解HA致其解聚,并使之与CD44结合而活化组织激肽释放酶（TK）,由活化的TK对前体EGF加工处理成EGF,由此启动EGFR信号级联反应,上调MUC5AC基因的表达。     

中性粒细胞弹力蛋白酶引起黏蛋白5AC高表达的信号转导机制

目的研究中性粒细胞弹力蛋白酶（NE）通过表皮生长因子受体（EGFR）引起黏蛋白（MUC）5AC高表达的上游信号通路。方法培养人气道BEAS@B上皮细胞,给予NE刺激,以肿瘤坏死因子转换酶抑制剂-1（TAPI-1）及活性氧（ROS）清除剂DMTU为干预因素。RT-PCR检测干预前后细胞中MUCSACmRNA含量;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测培养上清中MUCSAC、可溶性转化生长因子（TGF）-α蛋白含量;Westem印迹分析磷酸化表皮生长因子受体（P-EGFR）蛋白水平。结果NE刺激后引起MUCSAC基因转录和蛋白表达水平明显高于未给予NE刺激的对照组（P〈0．01）,同时伴随可溶性TGF-α及p-EGFR蛋白水平的增高,与对照组相比,差异有统计学意义（均P〈0．01）;加入浓度为20umol/L的肿瘤坏死因子转换酶抑制剂TAPI-1后可明显下调上述指标的表达水平（均P〈0．01）,DMTU也同样降低了MUC5AC的基因转录、产物水平以及可溶性TGF-α蛋白相对含量,与单纯NE刺激组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）,但对单纯外源性TGF-α刺激组引起的MUCSAC基因转录和蛋白合成增加无明显作用（均P〉0．05）。结论NE能刺激细胞产生ROS,再活化肿瘤坏死因子转换酶（TACE）引起黏蛋白产生的增多,组成EGFR通路上游的主要信号分子,故ROS／TACE／TGF-α前体／EGFR转导途经是NE引起气道黏液高分泌的重要机制。