siRNA沉默RALA基因影响人白血病K562细胞增殖和凋亡

目的: 研究小干扰RNA(siRNA)抑制v-ral 猴白血病病毒癌基因同系物A(RALA)基因表达对人慢性粒细胞性白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法: 利用Lipofectamine^TM 2000将化学合成的RALA siRNA转染体外培养的K562细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测RALA siRNA对K562细胞增殖的影响;台盼蓝拒染法检测RALA siRNA对K562细胞存活率的影响;real-time PCR检测RALA mRNA表达水平;Western blotting检测RALA蛋白表达水平;annexin V/PI双染流式 细胞仪检测RALA siRNA对K562细胞凋亡的影响;Hoechst 33258染色荧光显微镜观察细胞形态学变化。结果: RALA siRNA可明显抑制K562细胞内RALA mRNA和蛋白的表达(P<0.05);与阴性对照组相比,转染RALA siRNA的K562细胞增殖明显受到抑制(P<0.05);流式细胞术结果显示转染RALA siRNA的K562细胞凋亡较阴性对照组显著增加(P<0.05);Hoechst 33258染色见转染RALA siRNA的K562细胞出现典型的凋亡形态学变化。结论: 癌基因RALA在白血病发生发展过程中发挥重要作用。siRNA下调RALA mRNA和蛋白的表达,可抑制人白血病K562细胞增殖,诱导细胞凋亡,提示RALA可能是白血病治疗的新靶点。     

siRNA沉默Ikaros基因对K562细胞中γ珠蛋白表达的影响

目的:通过siRNA干扰靶基因Ikaros,观察人红白血病细胞株K562细胞中γ珠蛋白的表达变化。方法:设计合成三条针对Ikaros的siRNA寡核苷酸序列,采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000转染siRNA至K562细胞,采用RT-PCR方法筛选出最佳siRNA序列和最佳干扰时间。运用Real-time PCR和Western blotting技术分别检测siRNA沉默Ikaros后K562细胞Ikaros和γ珠蛋白mRNA及蛋白的表达水平,应用联苯胺染色法检测siRNA沉默Ikaros后K562细胞内血红蛋白(Hb)含量。结果:筛选试验表明siRNA3的转染效率最高,达58.7%,siRNA3对Ikaros基因抑制率最高(86.7%),其最佳干扰时间为72h。应用siRNA3沉默Ikaros基因可以上调γ珠蛋白mRNA和蛋白的表达水平,增加K562细胞内Hb含量。结论:siRNA3沉默Ikaros上调γ珠蛋白mRNA和蛋白表达,可能成为治疗重型β-地中海贫血的一种新策略。     

沉默DLL3基因增强白血病K562/ADM细胞对阿霉素的敏感性

目的 探讨沉默Delta-like ligand 3（DLL3）基因对白血病K562/ADM细胞对阿霉素（ADM）耐药性的影响及其分子机制。 方法 将干扰人DLL3基因表达的shRNA质粒和无义对照质粒转染K562/ADM细胞,采用RT-PCR法检测DLL3的mRNA表达水平,采用CCK-8法检测ADM对K562和K562/ADM细胞的毒性作用,采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞内ADM浓度,采用Western blotting方法检测DLL3、谷胱甘肽S转移酶-π（GST-π）和P-糖蛋白（P-gp）的蛋白表达水平。 结果 K562/ADM细胞DLL3的mRNA和蛋白表达水平均显著高于其亲代K562细胞（P<0.05）;ADM对K562和K562/ADM细胞的IC₅₀ 分别为1.08 mg/L和34.93 mg/L;沉默DLL3基因后,K562/ADM细胞的耐药倍数下降至13.12,反转倍数为2.47;尽管抑制DLL3基因表达未对K562/ADM细胞凋亡产生影响,但可下调P-gp和GST-π的蛋白表达水平（P<0.05）,增加K562/ADM细胞内ADM的蓄积量（P<0.05）,从而增强ADM诱导的K562/ADM细胞凋亡（P<0.05）。 结论 沉默DLL3基因可反转K562/ADM细胞对ADM的耐药性,这可能与下调P-gp和GST-π蛋白水平、从而减少K562/ADM细胞内阿霉素蓄积量有关。     

FAK基因沉默诱导白血病细胞凋亡

目的:本研究靶向黏着斑激酶(FAK)基因,构建FAK-shRNA慢病毒载体,并研究FAK基因沉默对白血病细胞生长的影响。方法:化学合成人FAK基因的shRNA序列,应用分子生物学方法将该FAK shRNA序列插入含荧光素GFP慢病毒质粒。该FAK shRNA慢病毒载体在体外包装、浓缩,然后转染至人白血病细胞株。应用逆转录聚合酶链反应及蛋白质印迹方法检测FAK基因表达水平,予Annexin V标记检测细胞凋亡的情况。结果:经核苷酸序列分析提示FAK shRNA正确插入慢病毒质粒,该病毒载体在白血病细胞株的转染率为10%-25%。与对照组相比(无FAK shRNA的慢病毒载体),FAK shRNA慢病毒载体在细胞FAK mRNA及蛋白水平的抑制率分别为40%和70%。凋亡实验表明,对照组与FAK shRNA慢病毒载体组的Annexin V阳性率分别为(4.19±0.36)%和(8.48±0.58)%,两者差异明显(P0.05)。结论:我们成功构建FAK shRNA慢病毒载体,该载体能抑制FAK基因表达并诱导白血病细胞凋亡。     

HOXA9基因与白血病的研究进展

HOXA9基因是同源盒(HOX)基因家族成员,作为转录因子,HOXA9是胚胎形成前-后轴过程中的关键因子,在调控干细胞生物学行为及促进造血系统形成的过程中发挥重要作用。HOXA9既可与上游相关调节蛋白相互作用,又可调节下游靶基因的表达,发挥转录激活或抑制作用,进而调控血液细胞的生物学行为。HOXA9在超过50%的急性髓性白血病中过表达,而且高水平表达与不良预后密切相关。     

应用siRNA抑制K562细胞中c-Myc基因的表达

目的利用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制白血病细胞系K562细胞中c鄄Myc基因的表达,为研究c鄄Myc基因在K562细胞中的作用提供一个新的方法。方法设计c鄄Myc基因特异性小分子干扰RNA,用体外转录方法合成c鄄Myc基因的小分子干扰RNA并转染K562细胞,培养48h后,收集细胞,应用实时荧光定量RT鄄PCR和westernblot方法检测转染细胞中c鄄Myc基因mRNA水平和蛋白表达量的变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性。结果转染siRNA后,与对照组相比,实验组c鄄MycmRNA水平和蛋白表达量明显降低,抑制率分别为82.16%和74.0%,MTT法表明实验组的增殖速率明显低于对照组的增殖速率。结论在K562细胞中存在RNA干扰的机制,特异性siRNA能够有效的抑制c鄄Myc基因的表达,为研究c鄄Myc基因在肿瘤细胞中的调节途径提供了一个新的方法。     

熊果酸促进K562细胞凋亡

本研究旨在探讨熊果酸在体外对人红白血病K562细胞系的作和机制。采用MTT法和流式细胞术检测熊果酸对K562细胞的增殖抑制和杀伤效应;用慧星电泳分析熊果酸对K562细胞DNA的损伤;Hoechst33258荧光染色观察DNA片段化：细胞免疫化学染色检测Bcl-2和Bax的表达;Western blotting检测K562细胞内Caspase-3和磷酸化酪氨酸的表达和活性。结果显示熊果酸存在体外对K562细胞具有中度增殖抑制效应,并呈浓度和时间依赖性。在熊果酸作用下K562细胞呈现凋亡征象,同时细胞内Bcl-2表达下降,Bax表达升高,Caspase-3被激活,磷酸化酪氨酸表达下降,说明熊果酸存体外对K562细胞有诱导凋亡作用,而提高Bax的表达、诱导Caspase-3活化及降低BCR／ABL的酪氨酸激酶活性可能足其作用机制之一。     

阿霉素对K562细胞凋亡及FAK mRNA的影响

目的探讨阿霉素体外作用于K562细胞后,观察其对细胞增殖的影响,促进细胞凋亡情况,以及调节细胞周期和粘着斑激酶（FAK）mRNA基因,进一步探讨通过调控FAK表达,研究抗白血病的作用机制。方法应用细胞增殖实验（CCK8法）观察不同浓度阿霉素作用不同时间对K562细胞增殖的影响,应用流式细胞仪观察不同浓度阿霉素对K562细胞细胞凋亡,细胞周期的影响,应用RT-PCR和Western blot技术检测不同浓度阿霉素作用对K562细胞36h后FAK mRNA以及蛋白表达水平的变化。结果随着阿霉素浓度增加及作用时间延长,K562细胞的增殖抑制率逐渐升高,同一时间不同浓度之间比较,或者同一浓度不同时间组之间比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）;阿霉素能引起K562细胞凋亡,且随着药物浓度增加,凋亡率也逐渐增加,差异均有统计学意义（P〈0.05）;阿霉素能引起K562细胞周期阻滞,多停留在S期;阿霉素能引起K562细胞FAK mRNA表达显著降低。阿霉素能引起K562细胞FAK蛋白表达水平的降低。结论阿霉素抑制分裂期细胞的增殖,诱导细胞凋亡增加,对细胞FAK基因和蛋白水平均显著下调,为进一步研究FAK基因表达的调控与肿瘤细胞凋亡的分子机制提供了实验基础。     

siRNA沉默p110β基因对子宫内膜癌lshikawa细胞凋亡与侵袭的影响

目的利用siRNA沉默子宫内膜癌lshikawa细胞中p110β的表达,探讨其对子宫内膜癌细胞凋亡与侵袭的影响。方法构建p110βsiRNA的表达载体,并转染Ishikawa细胞。RT-PCR方法检测转染前后Ishikawa细胞中p110β的表达情况;流式细胞技术分析转染前后Ishikawa细胞的凋亡变化,Transwell实验检测转染前后Ishikawa细胞侵袭能力的变化。结果 siRNA重组质粒pGCsi-p110β对Ishikawa细胞中p110βmRNA的表达抑制率为88.90%,明显高于对照组(P0.05)。转染pGCsi-p110β的Ishikawa细胞凋亡率为18.3%,显著高于对照组的11.0%,而Ishikawa细胞穿膜数目显著低于对照组(P0.05)。结论沉默p110β的表达诱导子宫内膜癌lshikawa细胞凋亡并抑制侵袭。     

SU11248诱导K562白血病细胞凋亡的分子机制研究

目的:研究SU11248(舒尼替尼)诱导慢性骨髓性白血病K562细胞凋亡的分子机制。方法:采用CCK-8比色检测SU11248对K562细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测K562细胞周期变化;间接免疫荧光检测凋亡相关蛋白的表达及定位;免疫印迹检测凋亡相关蛋白的表达变化。结果:CCK-8比色显示SU11248可明显抑制K562细胞增殖(P<0.05),呈现剂量和时间依赖性。FCM显示该药可阻滞K562细胞于G0/G1期。间接免疫荧光染色可见SU11248组细胞色素C(Cyto C)在胞质中呈弥散或粗块状分布,而p53、p73及NF-κB p65均主要定位于胞质,较对照组表达差异不明显。免疫印迹显示,随时间延长,SU11248组较对照组Bcl-2表达呈下降趋势,Bax和Cyto C表达呈增加趋势,同时有Caspase-9和Caspase-3的激活,而p53、p73及NF-κB p65表达变化不明显。结论:SU11248可通过阻滞细胞周期进程及激活内源性线粒体凋亡通路诱导K562细胞调亡。     

siRNA沉默SCD1基因对MCF-7细胞增殖、凋亡及脂质代谢的影响

目的:通过小干扰RNA (siRNA)干扰技术研究SCD1基因沉默对MCF-7细胞增殖、凋亡和脂质代谢的影响.方法:以脂质体lipofectamine2000包裹siRNA的方法沉默SCD1基因,RT-PCR检测SCD1 mRNA相对表达量;Western blot法检测SCD1蛋白表达量;MTT法检测转染MCF-7细...     

应用RNA干扰技术抑制K562细胞BCR-ABL基因表达及诱导细胞凋亡

目的运用RNAi技术,设计针对BCR-ABL基因融合位点的。iRNAs,研究其干扰后细胞变化。方法针对BCR-ABL基因的融合位点设计siRNAs,用脂质体法转染K562细胞,进行MTY法、RT-PCR及流式细胞仪检测,观察其干扰效果。结果转染组与对照组相比细胞增殖减少,BCR-ABL mRNA表达量降低,并有明显的细胞凋亡。结论运用RNAi技术,可以有效地抑制BCR-ABL的表达,诱导细胞凋亡,为白血病的分子机制研究和基因治疗奠定基础。     

海生素对K562细胞生长及凋亡基因表达的影响

目的 探讨海生素对白血病K562细胞生长及凋亡基因表达的影响. 方法实验分为对照组、10mg/L海生素组和20rag/L海生素组.采用流式细胞术(FcM)、四唑蓝(MTT)和免疫细胞化学法测定海生素对K562细胞周期、细胞生长及细胞凋亡基因bcl-2和bax表达的影响. 结果海生素浓度为10mg/L和20mg/L时,可阻止K562细胞周期于G1/S期;海生素浓度为20mg/L时对K562细胞有抑制作用,在此浓度下随时间的延长细胞存活率有下降趋势;海生素浓度为20mg/L和40mg,L时,可下调凋亡抑制基因bcl-2的表达,上调凋亡促进基因hax的表达.结论 海生素可明显抑制K562细胞的增殖,使其阻滞于细胞周期的G1/S期;海生素还通过减少bcl-2的表达及增加bax的表达从而促进K562细胞的凋亡.     

生长抑素对人红白血病K562细胞的抑制作用

目的　研究生长抑素对人红白血病K5 6 2细胞的抑制作用。　方法　采用 8肽生长抑素———奥曲肽(octreotide ,SMSZOL 1995 ,SMS)在体外作用于K5 6 2细胞 ,经光镜、电镜观察、3H TdR掺入法和TdT缺口末端标记(TUNEL)技术检测K5 6 2细胞增殖、凋亡的变化。　结果　光镜下观察到 ,加SMS组培养 72h与空白对照组比较 ,细胞碎片增多 ;电镜下可见 ,SMS处理组中部分细胞核染色质靠核膜边集 ,呈块状或新月形 ,部分细胞胞浆中见核碎裂团块与空泡 ,线粒体基质深染、空泡样变和髓样变 ;3H TdR掺入法显示 ,SMS呈浓度依赖性地抑制K5 6 2细胞增殖 ,抑制范围为 2 0 %～ 5 0 % ,以 10 - 6 mol L最有效。在 10 - 1 0 ～ 10 - 6 mol L范围内 ,与对照组比较有显著性差异 (P <0 0 1) ;TUNEL检测见核深染的阳性细胞 ,10 - 6 mol L组与对照组比较 ,凋亡细胞明显增多 (P <0 0 1)。　结论　生长抑素可抑制K5 6 2细胞增殖 ,诱导凋亡。     

应用含标记基因K562细胞制备的小鼠白血病模型

背景:文献报道应用NOD/SCID及SCID小鼠可以建立移植性人白血病小鼠模型,但由于小鼠存在免疫缺陷,使得在自体干细胞移植及移植后相关过继免疫治疗方面的研究受到限制和影响。目的:探索用SPF级Balb/c小鼠和转染GFP及NeoR基因的K562细胞株制备白血病模型的方法。方法:实验分为5组,A、B组和C、D组分别经X射线照射2Gy和3Gy,24h后取对数生长期的K562(GFP+/Neo+)细胞,A、C组尾静脉注射2×106个/只;B、D组尾静脉注射5×106个/只;E组为正常对照组。观察小鼠生存时间,进行骨髓细胞及外周血白细胞分类,采用流式细胞仪测定GFP阳性细胞及PCR方法测定Neo基因。结果与结论:实验各组在接种5~7d时发病,分别于30,23,24,17d内全部死亡;生存天均显著短于正常对照组(P0.01)。体质量均较正常对照组显著下降(P0.05)。小鼠的白血病发病率为100%,无自发缓解。随接种细胞数量的增加和照射剂量的增加,小鼠的存活时间缩短,且外周血及骨髓中白血病细胞所占比例增加。流式细胞仪测定及PCR方法也证实了GFP+细胞和NeoR基因在肝、脾中的存在。结果证实Balb/c小鼠经照射后从尾静脉注射K562细胞株可以制备获得白血病小鼠模型。     

RNA干扰沉默Bax基因对线粒体途径软骨细胞凋亡的影响

 【摘要】 目的 利用体外培养的鼠软骨细胞,研究RNA干扰沉默Bax基因表达对经线粒体途径细胞凋亡的影响。方法 体外分离培养SD大鼠软骨细胞;Bax siRNA干扰沉默Bax基因表达。RT-PCR和Western blot检测mRNA及蛋白表达水平;MTT法检测细胞活力;Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡率;Western blot检测Bcl-2、Cytochrome C蛋白的表达。结果 Bax siRNA干扰24h后,Bax的mRNA和蛋白的表达水平均明显降低。细胞凋亡受到明显抑制,细胞存活率增高。并且,在Bax基因沉默的细胞中,Cytochrome C蛋白表达水平降低,同时Bcl-2蛋白表达水平升高。结论 RNA干扰沉默Bax基因可抑制鼠软骨细胞凋亡并且促进其存活,其机制可能与线粒体途径相关。     

干扰 Netrin-1 对白血病 K562 细胞体内外增殖迁移的影响 #br#

【摘要】 目的 探究干扰 Netrin-1 对白血病 K562 细胞体内外增殖迁移的影响。 方法 将 shRNA Netrin-1载体和空质粒载体转染至 K562 细胞, 细胞随机分为 3 组: Control 组、 shRNA-NC 组和 shRNA2-Netrin-1 组。克隆形成实验检测克隆形成率; Western 印迹检测 Netrin-1、 Ki67、 Survivin 蛋白表达; Transwell 检测侵袭细胞数; 划痕实验检测划痕愈合率; 建立白血病 K562 细胞裸鼠移植瘤模型, 检测 30 d 肿瘤体积和肿瘤重量变化; 免疫组化检测 Ki67、 VEGF 阳性细胞数。 结果 体外实验中, 与 Control 组比较, shRNA2-Netrin-1 组K562 细胞克隆形成率、 Ki67 和 Survivin 蛋白表达、 侵袭细胞数及划痕愈合率均降低 ( P< 0. 05); 体内实验中, 与 Control 组比较, shRNA2-Netrin-1 组裸鼠肿瘤体积、 肿瘤重量、 Ki67 阳性细胞数和 VEGF 阳性细胞数均降低 (P< 0. 05)。 结论 敲低 Netrin-1 表达可抑制白血病 K562 细胞体内外增殖及迁移。     

siRNA沉默ADAM10基因对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的影响

目的探讨小干扰RNA(siRNA)沉默解整合素金属蛋白酶(ADAM10)基因对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的影响。方法将ADAM10特异性siRNA转染人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞MH7A细胞,实验分为3组,ADAM10-siRNA组转染ADAM10特异性siRNA,NC-siRNA组转染ADAM10非特异性siRNA,对照组为未经转染处理的MH7A细胞。转染48 h后采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组细胞中ADAM10表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,qRT-PCR检测凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达水平,ELISA测定细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)含量。结果 ADAM10-siRNA组细胞中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平较NC-siRNA组和对照组低(P 0.05)。沉默ADAM10基因后,ADAM10-siRNA组细胞凋亡率显著高于NC-siRNA组和对照组(P 0.05)。ADAM10-siRNA组细胞中Bax基因表达水平明显高于NC-siRNA组和对照组(P 0.05),Bcl-2基因表达水平明显低于NC-siRNA组和对照组(P 0.05)。ADAM10-siRNA组细胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-8显著低于NC-siRNA组和对照组(P0.05)。而NC-siRNA组和对照组以上各指标相比较,差异不明显(P 0.05)。结论沉默ADAM10基因可明显促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的凋亡,并进一步减少TNF-α、IL-6和IL-8等炎症因子的分泌,提示通过沉默ADAM10基因使减轻/控制类风湿关节炎炎症成为可能。