蛋白激酶CK2β小干扰RNA促进小鼠受精卵早期发育

目的：利用特异性小发夹RNA(siRNA)寡核苷酸片段,研究蛋白激酶CK2调节亚基CK2β对小鼠受精卵早期发育的影响,阐明调控小鼠受精卵早期发育的机制。方法：超排卵获得小鼠1-细胞期受精卵,分别显微注射TE缓冲液、scramble siRNA和CK2β siRNA,收集卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测CK2β siRNA的干涉效能;相差显微镜观察受精卵的形态变化、计数卵裂率;放射自显影测定M期促进因子（MPF）活性。结果：与TE缓冲液和scramble siRNA组比较,CK2β siRNA组CK2β的mRNA水平和蛋白表达显著降低（P<0.0）,MPF的活性明显升高（P<0.01）,在人绒毛膜促性腺激素(hCG) 注射后28.5 h达到高峰;受精卵第一次有丝分裂加速,CK2β siRNA组在hCG注射后28.5 h大多数受精卵已经分裂为2-细胞期胚胎;hCG注射后32.0 h卵裂率为89.5%,与TE缓冲液和scramble siRNA组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论： CK2βsiRNA　通过提前激活MPF活性,进而促进小鼠1-细胞期受精卵的发育。     

cAMP-PKA途径在小鼠受精卵卵裂中的作用

目的：探讨环腺苷酸-蛋白激薄A(cAMP—PKA)途径在小鼠受精卵早期卵裂中的变化规律及作用。方法：动态观察小鼠1—细胞期受精卵M期cAMP浓度及PKA、成熟作用促进因子(MPF)活性变化。并应用cAMP及蛋白激酶抑制剂(PKI)显微注射入1-细胞期受精卵内，观察卵细胞形态学变化及卵裂率、死亡率。结果：小鼠受精卵1-细胞期，伴随MPF活性变化，M期cAMP浓度下降，M中期最低，M末期升高，与PKA趋势一致。cAMP显微注射后卵细胞胞膜及透明带变形，形态不规则，无卵裂发生；PKI显微注射后核不规则分裂增加，正常卵裂率下降。两者死亡率均高于对照组。结论：cAMP注射升高PKA活性可使卵细胞发育迟缓，PKI注射抑制PKA活性引起核不规则分裂。     

14-3-3ε蛋白在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中对Cdc25B定位的影响

目的：探讨14-3-3ε蛋白在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中对Cdc25B定位的影响,为阐明14-3-3ε蛋白对小鼠卵母细胞发育的调控机制奠定基础。方法：采用超排卵方法获得3周龄昆明系雌性小白鼠生发泡（GV）期卵母细胞分为未注射组、control siRNA注射组和14-3-3εsiRNA注射组。构建pmax-FP-Red-HA-14-3-3ε表达载体。间接免疫荧光技术检测14-3-3ε蛋白和Cdc25B在小鼠卵母细胞中的定位;直接免疫荧光技术观测14-3-3ε蛋白和Cdc25B蛋白在小鼠卵母细胞中的亚细胞定位;利用显微注射方法将14-3-3εsiRNA注射入GV期卵母细胞中,相差显微镜下观测卵母细胞的形态表现,计算卵母细胞的生发泡破裂（GVBD）发生率;Western blotting法检测卵母细胞中14-3-3ε蛋白的表达和Cdc2-pTyr15蛋白的相对表达水平;放射自显影检测卵母细胞中成熟促进因子（MPF）的活性。结果：间接和直接免疫荧光实验,野生型Cdc25B能与14-3-3ε蛋白共定位于细胞质;在GVBD前期,Cdc25B由胞浆穿梭进入细胞核。当Cdc25B蛋白的第321位丝氨酸突变为丙氨酸时,14-3-3ε蛋白的表达水平降低,Cdc25B的胞浆定位被取消。未注射组、control siRNA注射组卵母细胞在显微注射24 h后均未发生GVBD,GVBD发生率组间比较差异无统计学意义（P>0.05）;14-3-3εsiRNA注射组在显微注射后22和24 h卵母细胞的GVBD发生率均高于未注射组和control siRNA注射组（P<0.01）,显微注射后24 h卵母细胞到达第2次减数分裂中期（MⅡ）的比例高于未注射组和control siRNA注射组（P<0.01）。结论：在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中,Cdc25B的Ser321位点可能是14-3-3ε蛋白调控Cdc25B细胞内定位的具体作用位点。     

mTOR抑制剂对小鼠受精卵卵裂以及MPF活性的影响

目的观察哺乳动物雷帕霉素靶（mTOR）抑制剂对小鼠受精卵第一次卵裂及第一次有丝分裂中MPF活性的影响。方法在小鼠受精卵中加入雷帕霉素后,显微镜观察卵细胞分裂情况,计算卵裂率;用液闪计数仪测定各组分别加入雷帕霉素和渥曼青霉素后的MPF活性;用免疫电泳方法检测加入雷帕霉素后cyclin B的表达。结果加入mTOR抑制剂后,卵裂率下降,MPF活性在小鼠受精卵第一次分裂中未见升高,卵细胞中cyclin B的表达下降。结论mTOR抑制剂可抑制小鼠受精卵第一次卵裂,同时抑制小鼠受精卵第一次分裂时MPF活性的升高。     

TOR抑制剂对小鼠受精卵卵裂以及MPF活性的影响

目的 观察哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)抑制剂对小鼠受精卵第一次卵裂及第一次有丝分裂中MPF活性的影响.方法 在小鼠受精卵中加入雷帕霉素后,显微镜观察卵细胞分裂情况,计算卵裂率;用液闪计数仪测定各组分别加入雷帕霉素和渥曼青霉素后的MPF活性;用免疫电泳方法 检测加入雷帕霉素后cyclin B的表达.结果 加入mTOR抑制剂后,卵裂率下降,MPF活性在小鼠受精卵第一次分裂中未见升高,卵细胞中cyclin B的表达下降.结论 mTOR抑制剂可抑制小鼠受精卵第一次卵裂,同时抑制小鼠受精卵第一次分裂时MPF活性的升高.     

双丁酰环腺苷酸通过蛋白激酶Wee1B调控小鼠1-细胞期受精卵的发育研究

目的 探讨蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)激活剂双丁酰环腺苷酸(dual dibutyryl cyclic AMP,dbc AMP)调控蛋白激酶Wee1B蛋白对小鼠1-细胞期受精卵发育的影响,为进一步研究母源性因子Wee1B在早期胚胎发育过程中的作用提供理论基础。方法将2 mmol/L dbc AMP作用于小鼠1-细胞期受精卵1 h,并显微注射Wee1Bm RNAs,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、Wee1B-WT/KD注射组、Wee1B-S15A/D注射组,继续在M16培养基中培养。相差显微镜下观察小鼠受精卵的形态变化和卵裂情况,放射自显影测定各期细胞有丝分裂促进因子(MPF)活性,Western blotting方法检测Wee1B蛋白的表达、CDC2-p Tyr15和Wee1B-p Ser15的磷酸化水平。结果小鼠受精卵在有dbc AMP存在时,G_1、S、G_2和M各细胞周期均检测到磷酸化的Wee1B表达,非磷酸化条带在G_2期和M期才能检测到;各组受精卵卵裂出现时间延迟,卵裂率显著降低;h CG注射后35 h内,MPF活性一直处于低水平,CDC2-p Tyr15磷酸化状态和MPF活性变化趋势相一致。结论dbc AMP激活PKA后,PKA磷酸化Wee1B蛋白的S15位点,Wee1B活性增加,阻滞受精卵分裂,本研究提示Wee1B蛋白的S15位点可能是PKA作用的生理靶点,可以更好地认识早期胚胎发育的分子事件。     

下调蛋白激酶Wee1B表达对小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的促进作用

目的：利用特异性发夹结构Wee1B shRNA,探讨蛋白激酶Wee1B对小鼠受精卵早期发育的影响。方法：超排卵方法获得小鼠1-细胞期受精卵并显微注射质粒,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、Control shRNA注射组和Wee1B shRNA注射组,收集各组卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测Wee1B shRNA的干涉效能;荧光显微镜观察受精卵的形态变化、计数卵裂率;放射自显影测定Wee1B活性。结果：与TE缓冲液和Control shRNA注射组比较,Wee1B shRNA注射组小鼠1-细胞期受精卵Wee1B mRNA水平和蛋白表达显著降低;与其他3组比较,Wee1B shRNA注射组Wee1B的激酶活性明显降低;未注射组、TE缓冲液注射组和Control shRNA注射组在hCG注射33 h后1-细胞期受精卵的卵裂率分别为71.91%±1.74%、72.90%±2.25% 和72.28%±2.06%,3组间比较差异无统计学意义(P>0.05);而Wee1B shRNA注射组的卵裂率提高18.00%,为90.00%±0.77%,与其他3组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论：Wee1B表达沉默可提高小鼠1-细胞期受精卵的卵裂率,说明Wee1B负调控小鼠受精卵有丝分裂的进程。     

小鼠受精卵早期发育过程中PlK1表达和活性变化及其与MPF关系的研究

目的：研究在小鼠受精卵早期发育过程中，哺乳动物Polo-like激酶（PlK1）的表述和活性变化及其与有丝分裂促进因子（MPF）活性变化的关系。方法 以一细胞期小鼠受精卵为材料，用Western Blotting方法检测PlKl蛋白含量；用液闪计数分析仪分别测定PlKl和MPF的cpm值来表示各自激酶活性。结果 小鼠受精卵第一次有丝分裂过程中PlKl的含量没有显著变化，而PlK1活性在M期达到最高峰，在M期退出时迅速下降。加入MPC抑制剂后MPF和PlK1活性均未在M期出现峰值。结论 PlK1的活性是随着细胞周期的进程而变化的；PlK1在小鼠受精卵早期发育过程中可能参与了MPF的自我催化活化环。     

下调蛋白激酶Wee1B表达对小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的促进作用

目的:利用特异性发夹结构Wee1BshRNA,探讨蛋白激酶Wee1B对小鼠受精卵早期发育的影响。方法:超排卵方法获得小鼠1-细胞期受精卵并显微注射质粒,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、Control shRNA注射组和Wee1BshRNA注射组,收集各组卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测Wee1B shRNA的干涉效能;荧光显微镜观察受精卵的形态变化、计数卵裂率;放射自显影测定Wee1B活性。结果:与TE缓冲液和Control shRNA注射组比较,Wee1BshRNA注射组小鼠1-细胞期受精卵Wee1BmRNA水平和蛋白表达显著降低;与其他3组比较,Wee1BshRNA注射组Wee1B的激酶活性明显降低;未注射组、TE缓冲液注射组和Control shRNA注射组在hCG注射33h后1-细胞期受精卵的卵裂率分别为71.91%±1.74%、72.90%±2.25%和72.28%±2.06%,3组间比较差异无统计学意义(P>0.05);而Wee1BshRNA注射组的卵裂率提高18.00%,为90.00%±0.77%,与其他3组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:Wee1B表达沉默可提高小鼠1-细胞期受精卵的卵裂率,说明Wee1B负调控小鼠受精卵有丝分裂的进程。     

血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶3在小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中的表达水平及其亚细胞定位

目的：检测血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶3 (SGK3)在小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中的表达水平及其亚细胞定位,初步阐明SGK3对哺乳动物受精卵早期发育的调控机制。方法：通过超排卵技术和受精卵体外培养收集小鼠1-细胞期受精卵,分别采用实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)和Western blotting法检测小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中SGK3 mRNA和蛋白表达水平,采用免疫荧光法观察SGK3在小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中的亚细胞定位情况。结果：在小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中均有SGK3 mRNA和蛋白表达;与G1期、S期和M期比较,G2期小鼠1-细胞期受精卵中SGK3 mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)。免疫荧光法检测,在G1期和S期SGK3 (红色荧光)定位于小鼠1-细胞期受精卵细胞质,在G2期部分SGK3进入细胞核,在M期SGK3广泛分布于小鼠1-细胞期受精卵中。结论：SGK3在小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中动态表达,SGK3在受精卵细胞分裂过程中存在核浆穿梭,SGK3的定位改变可能推动小鼠1-细胞期受精卵G2/M转换和有丝分裂进...     

CDC14B在小鼠1-细胞期受精卵各细胞周期的动态表达及其定位

目的：检测小鼠1-细胞期受精卵各细胞周期中细胞分裂周期蛋白14B（CDC14B）的表达水平及其定位,初步阐明CDC14B对哺乳动物受精卵早期发育调控的机制。方法：通过超排卵技术分别收集小鼠1-细胞期受精卵,采用RT-PCR和Western blotting法检测小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中CDC14B mRNA和蛋白表达水平;采用细胞免疫荧光法观察小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中CDC14B和β微管蛋白（β-tubulin）的共定位情况。结果：与G₁期比较,小鼠S、G₂和M期1-细胞期受精卵中CDC14B mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）。间接免疫荧光实验,CDC14B（红色荧光）和β-tubulin（绿色荧光）在G₁期和S期共定位于小鼠受精卵皮质;在G₂早期,CDC14B和β-tubulin共定位于皮质和细胞质;在G₂晚期,部分CDC14B入核;在M期,CDC14B和β-tubulin共定位于纺锤体。结论：CDC14B在小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中动态表达,CDC14B存在核浆纺锤体转位,CDC14B的定位变化可能调控纺锤体的功能。     

磷酸二酯酶3A在小鼠受精卵早期发育中的表达

目的:研究磷酸二酯酶3A(PDE3A)在小鼠受精卵第1次有丝分裂中的表达.方法:采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)方法检测小鼠受精卵在第1次有丝分裂的G1、S、G2及M期,在mRNA水平PDE3A的表达.结果:在mRNA水平,PDE3A在G2、M期的表达较G1、S期明显增高.结论:小鼠受精卵中有PDE3A基因的表达;在小鼠受精卵第1次有丝分裂过程中,PDE3A在mRNA水平的表达具有阶段特异性,因而,PDE3A很可能参与对受精卵早期发育的调控.     

小鼠未受精卵和早1-细胞期受精卵中MPF蛋白水平的检测

目的::检测小鼠未受精卵和早1-细胞期受精卵中M期促进因子(MPF)蛋白水平,探讨MPF在早1-细胞期受精卵中的变化.方法:利用超排卵及反复冻融裂解细胞的方法,对卵母细胞和受精卵细胞中MPF的催化亚基Cdc2、调节亚基周期素B进行Western印迹分析.结果:在500个MⅡ卵母细胞和受精卵细胞样品中,可以清楚看到各有一条粉紫色的特异免疫印迹带显示Cdc2,根据凝胶成像及分析系统的Gelworks应用软件分析,得到的强度的相对值分别是100%和约80%.用700个卵细胞进行观察时可以看到MⅡ卵母细胞显示有2条免疫印迹带显示细胞周期素B,其中一条为60～63 kDa,是周期素B;另一条则位于周期素B的下方,约40～45 kDa,且色调偏淡.而受精卵细胞样品在相应的部位则未能见到特异的免疫印迹带.结论:小鼠早1-细胞期受精卵(G1期)中的Cdc2蛋白水平仍保持在相对的较高水平;而细胞周期素B的量显著减少,难以检测.     

14—3—3蛋白

14-3-3是一个在真核生物中广泛表达的酸性蛋白家族，主要以同源／异源二聚体形式存在，通过磷酸化丝／苏氨酸作用与靶蛋白或靶蛋白的两个结构域结合。七种不同亚型的高度保守的14-3-3蛋白与人类细胞中多种不同的信号通路有着密切的关系。14-3-3通过调节靶蛋白间的相互作用在MAPK级联放大效应等信号转导途径中发挥调控作用。     

Hsp70-2及14-3-3zeta在膀胱尿路上皮癌中的表达及临床意义

目的检测Heat shock protein 70-2(Hsp70-2)及14-3-3zeta在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BUC)组织中的表达,探讨两者在肿瘤发展中的作用及临床意义。方法收集人膀胱尿路上皮癌标本48例,膀胱尿路上皮癌旁组织标本20例,利用免疫组织化学S-P法、Western blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Hsp70-2、14-3-3zeta在蛋白水平和mRNA水平的表达,分析两者与膀胱尿路上皮癌的病理分级、临床分期等因素间的关系。结果 3种检测方法均显示Hsp70-2、14-3-3zeta在癌旁组织中低表达,在膀胱尿路上皮癌组织中高表达,其表达量随病理分级程度及浸润深度增高而增高,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Hsp70-2与14-3-3zeta蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达均增高,两者呈正相关(r=0.516,P<0.05)。结论 Hsp70-2与14-3-3zeta在膀胱尿路上皮癌组织中高表达,与病理分级,临床分期呈正相关,且两者之间也呈正相关,提示两者在肿瘤发生、发展过程中起重要作用。     

小鼠受精卵早期发育过程中PDE活性变化、及其与MPF关系的研究

目的 研究在小鼠受精卵早期发育过程中,磷酸二酯酶(PDE)的活性变化及与有丝分裂促进因子(MPF)活性变化相比较,初步探讨哺乳动物受精卵早期发育的细胞周期调控机制.方法 以小鼠受精卵为材料,通过离子交换方法,检测PDE和MPF的活性.结果 受精卵早期发育过程中PDE和MPF活性随细胞周期变化而波动,G2期PDE活性升高而MPF在M期活性升高.结论 PDE参与了小鼠受精卵的早期发育并且作用时间早于MPF.