DMSO增强原核表达TAT-EGFP（Apoptin）穿膜效应的研究

目的：构建pET15b-TAT-EGFP和pET15b-TAT-Apoptin,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的定位及TAT-Apoptin的诱导Caski凋亡活性。方法：人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET15b后再连接EGFP和Apoptin基因,组成pET15b-TAT-EGFP（Apoptin）重组子。转化大肠杆菌,1mMIPTG诱导TAT-EGFP（Apoptin）融合蛋白表达,His亲和层析柱纯化。培养的Caski细胞经过10%DMSO处理1h后,加入融合蛋白孵育1h,观察TAT-EGFP进入细胞的情况。同时用TUNEL检测TAT-Apoptin诱导Caski凋亡的情况。结果：成功地构建了高表达pET15b-TAT-EGFP（Apoptin）重组子,纯化了分子质量约为30KD的融合蛋白TAT-EGFP和17KD的TAT-Apoptin融合蛋白,并在体外培养的Caski细胞经10%DMSO处理后证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力明显增强。结论：通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了DMSO能够增强TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。     

SP-TAT-Apoptin融合基因真核表达载体的构建和鉴定

目的：通过基因克隆构建表达SP—TAT—Apoptin融合基因的真核表达载体．方法：通过DNA重组技术,以pCD—NA3．1／Apoptin质粒为模板,进行PCR反应;将具有分泌功能的信号肽和能够携带核酸、蛋白和肽自由地通过细胞膜和核膜的蛋白转导域TAT序列连接于Apoptin基因5’端;PCR反应的产物连接于plenti6-V5-D—TOPO真核表达载体．用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组结果;将重组的真核表达载体瞬时转染HUVEC细胞,用免疫荧光标记对转染后的细胞进行处理,观察重组蛋白的表达情况．结果：PCR产物大小符合要求,重组质粒plenti6-V5-D—TOPO／SP-TAT-Ap—optin双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确．且经激光共聚焦显微镜观察到重组蛋白的表达,表明重组表达载体已构建成功．结论：成功克隆出SP-TAT-Apoptin融合基因,并成功构建其真核细胞表达载体,为下一步研究SP-TAT-Apoptin融合基因对肿瘤的生长抑制作用的体内外研究奠定了基础．     

TAT-Apoptin对肿瘤细胞的促凋亡作用

目的构建TAT-Apoptin的原核表达载体,表达并纯化凋亡素蛋白,检测其对多种肿瘤细胞的抑制作用。方法利用PCR合成TAT-Apoptin序列,并将序列连接到pET-28b(+)原核表达载体的多克隆位点上,构建pET-28b-Apoptin载体,然后将重组载体转入E.coli BL21宿主菌,IPTG诱导表达,利用Ni-NTA亲和柱进行纯化获得目的蛋白。将TAT-Apoptin加入到肿瘤细胞中,用CCK8法检测TAT-Apoptin对肿瘤细胞的抑制作用。结果成功构建pET-28b-Apoptin质粒,IPTG诱导宿主菌表达TAT-Apoptin,经SDS-PAGE分析,在15×10~3Mr处发现目的蛋白条带,与预期一致。镜检、CCK8法检测发现纯化的TAT-Apoptin对肿瘤细胞A549、MDA-MB-231、SKB-R3均具有一定的促凋亡作用。结论 TAT-Apoptin原核表达载体构建完成,表达的TAT-Apoptin对肿瘤细胞生长有促凋亡作用。     

人生物素基因的原核表达及纯化

目的构建生物素原核表达载体,获取同源性、可溶性、高纯度的重组生物素融合蛋白,为生物素的深入研究及肿瘤的早期诊断奠定基础。方法从胃癌细胞中提取RNA,经RT-PCR扩增,克隆出生物素基因;用BamHⅠ和HindⅢ对生物素DNA和载体pET32进行双酶切,构建pET32．生物素重组质粒;将重组质粒转化BL21感受态细胞,通过氨苄青霉素抗性、PCR和重组质粒双酶切筛选重组子转化菌落,经DNA测序及BLAST比对,确认生物素基因序列正确性以及插入pET32质粒的位点和方向;用IPTG诱导表达,Western-Blotting鉴定。用Ni2＋金属螯合层析柱纯化重组融合蛋白。结果通过RT-PCR。经1％的琼脂糖凝胶电泳检测,扩增的生物素DNA片段与预期大小一致。经双酶切及DNA测序鉴定,生物素DNA定向插入了pET32质粒。用重组质粒转化大肠杆菌BL21、诱导表达和纯化目的蛋白。经Western．Blotting鉴定。所诱导的蛋白为重组生物素融合蛋白。结论成功构建了生物素基因原核表达载体,表达和纯化了生物素融合蛋白。     

人BTC蛋白表达及生物学活性鉴定

目的 获得大量具有生物活性的人成熟β细胞素(BTC)蛋白.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,PCR扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列,并按读框克隆入原核细胞表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-hBTC.重组质粒转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导及亲和层析法纯化获得融合蛋白,运用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.以不同浓度BTC连续5 d作用于NIH3T3细胞,MTT比色法检测细胞增殖能力.结果 融合蛋白以水溶性形式分泌于大肠杆菌BL-21胞浆中,其作用于NIH3T3细胞可明显促进细胞增殖.结论 人成熟BTC蛋白在pET32a(+)表达系统中得到高效表达,所纯化蛋白具有促进NIH3T3细胞体外增殖的作用.     

丙型肝炎病毒F蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的:构建丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)F蛋白的原核表达载体,表达pET32a(+)-HCVF融合蛋白.方法:根据丙型肝炎病毒F基因的全序列设计引物,以HCV1a型cDNA质粒H/FL为模板,通过PCR方法扩增得到F基因的编码区序列,将其定向克隆于含有6×His tag的原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌JM109,经菌落PCR筛选,双酶切和测序鉴定阳性克隆后,转化大肠杆菌BL21,采用IVTG诱导表达融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化.结果:F基因以正确的方式插入到pET32a(+)载体中,重组质粒转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达,出现了与预期分子量相符的蛋白条带,该蛋白通过Western blot检测具有6×His tag蛋白的免疫学活性.结论:成功构建了丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达载体pET32a(+)-HCVF并表达和纯化出重组融合蛋白,为进一步研究F蛋白的生物学功能奠定了基础.     

鼻咽癌人源抗独特型基因工程抗体的原核表达及鉴定

目的构建鼻咽癌人源抗独特型单链抗体原核表达载体，对其产物做初步鉴定，为鼻咽癌疫苗制备奠定基础。方法采用分子克隆技术，PCR扩增G22ScFv基因，并将其克隆到原核表达载体pET25b（＋）上，将重组子转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达后，表达的蛋白经His—tag纯化试剂盒纯化后复性。SDS—PAGE及Western blot分析融合蛋白。结果构建的原核表达载体pET25b（＋）－G22经测序检测，序列正确。在大肠杆菌中G22ScFv以包涵体形式获高效表达，SDS－PAGE及Western blot鉴定表达的目的蛋白Mr为25kD，同时证实载体构建及表达均正确。目的蛋白经试剂盒纯化后电泳分析纯度达95％以上。结论利用基因重组技术，在原核细胞中表达出重组G22ScFv并得到纯化，为研究鼻咽癌疫苗打下了基础。     

一种基于HIV-1 TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建

目的 探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因，建立高效的细胞内转导系统。方法 通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列，在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列，将经酶切、DNA测序鉴定正确的pETl4b-His-TAT-EGFP质粒转化E.coli BL21（DE3）。经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定正确，再经蛋白透析、过滤处理。将His-TAT-EGFP融合蛋白加入ECV304细胞中，用荧光显微镜观察。结果 重组质粒pET14b-His-TAT融合表达载体和pET14b-His-TAT-EGFP重组载体经酶切、DNA测序鉴定证实构建成功。表达纯化出了高纯度His-TAT-EGFP融合蛋白并具有较高细胞内转导活性。结论 成功改建pET14b-His-TAT-Flag重组载体，正确构建pET14b-His-TAT-EGFP载体，His-TAT-EGFP融合蛋白高效表达。并具有明确的细胞内转导活性。     

人BTC蛋白表达及生物学活性鉴定

目的获得大量具有生物活性的人成熟β细胞素(BTC)蛋白。方法以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,PCR扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列,并按读框克隆入原核细胞表达载体pET32a( )中,构建重组质粒pET32a( )-hBTC。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导及亲和层析法纯化获得融合蛋白,运用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。以不同浓度BTC连续5 d作用于NIH3T3细胞,MTT比色法检测细胞增殖能力。结果融合蛋白以水溶性形式分泌于大肠杆菌BL-21胞浆中,其作用于NIH3T3细胞可明显促进细胞增殖。结论人成熟BTC蛋白在pET32a( )表达系统中得到高效表达,所纯化蛋白具有促进NIH3T3细胞体外增殖的作用。     

一种基于OmpA的分泌型原核表达载体的构建及应用

目的 构建大肠杆菌周质分泌型表达载体并验证其表达效果.方法 以pUC18-lpp为基础载体,构建含有核糖体结合元件(RBS)、信号肽(OmpA)、多克隆位点(MCS)的分泌型表达载体pUC-OmpA;通过分子克隆获得含有密码子优化的人生长激素(hGH)编码序列的pUC-OmpA-hGH,转化大肠杆菌JM109菌株并验证周质分泌性质.结果 经IPTG诱导后,SDS-PAGE、Western印迹分析结果显示周质空间有hGH重组表达产物,分子量约为22 kD,大小与预期一致,周质hGH约占菌体总hGH的43％.结论 成功构建了基于OmpA信号肽的周质分泌型表达系统,为实现生物活性蛋白的原核表达奠定了基础.     

PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其转导入人脐静脉内皮细胞

目的 表达并纯化融合蛋白PEP—1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法 用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b—pep—1—EGFP，在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白PEP—1—EGFP并进行Ni^2＋-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的实验。结果 经测序证实成功构建了表达型载体pET15b—pep—1—EGFP,PEP—1—EGFP融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达，纯化后的蛋白浓度为6．18mg／ml，蛋白产量为14．15mg／100ml菌液，SDS—PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为融合蛋白PEP—1—EGFP，细胞膜穿透实验证实PEP—1—EGFP融合蛋白能进入人脐静脉内皮细胞。结论 PEP—1—EGFP融合蛋白的表达和纯化及其穿膜能力的研究为PEP-1携带有生物活性的大分子物质进行蛋白治疗奠定了基础。     

Expression and purification of recombinant human hemangiopoietin in Escherichia coli

Objective： To express the soluble recombinant hemangiopoietin protein in E. coli BL21 （DE3）. Methods： Using human fetal live cDNA as a template, a partial cDNA fragment of HAPO coding N-terminal region was subcloned into plasmids pTrc99, pQE60 and pET32c to construct different recombinant prokaryotic expression systems. After selecting, the soluble rhHAPO fusion protein was expressed stably in E. coli BL21 （DE3） by vector pET32c-HAPO and further isolated by nickelnitrilotriacetic acid （NTA） affinity chromatography. After cleavage with enterokinase, the rhHAPO protein was applied to Fast Flow SP sepharose column. Results： The rhHAPO protein had a purity of more than 95% and a good bioactivity based on the cell adhesion assay in ECV304 cells. Conclusion： We have established a protein engineering system to produce rhHAPO which may provide the possibility for clinical application     

pET15b-YARA-EGFP原核表达质粒的构建及融合蛋白YARA-EGFP的表达与纯化

目的:构建原核表达载体pET15b-YARA-EGFP,并进行YARA-EGFP融合蛋白的表达和纯化。方法:用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b-YARA-EGFP,在E.coliBL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-EGFP,并进行Ni2+-NTA树脂柱亲和层析以纯化蛋白。结果:经测序证实成功构建了表达型载体pET15b-YARA-EGFP,YARA-EG-FP融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中得到表达,纯化后的蛋白浓度为1.098mg/mL。SDS-PAGE和Western blot分析表明纯化蛋白为目的蛋白YARA-EGFP。结论:已成功制备出YARA-EGFP融合蛋白。     

人腺苷激酶在大肠杆菌中的表达与纯化

目的 诱导人腺苷激酶组组蛋自在大肠杆菌中表达,并对表达的重组蛋白进行纯化.方法 将由人腺苷激酶基因开放阅读框与原核表达载体pET30a(+)连接构建的重组蛋白表达载体pET30a(+)/ADK转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞.1 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达.离心收集菌体后结合使用溶菌酶、冻融和超声破碎的方法裂解菌体.用含2 mol/L和4 mol/L尿素的结合缓冲液洗涤包涵体去除部分杂蛋白.随后用含8 mol/L尿素的结合缓冲液变性溶解剩余包涵体沉淀.用Ni-NTA柱通过亲和层析纯化重组蛋白,用含8 mol/L尿素的洗脱缓冲液洗脱.收集样品透析复性.结果 成功构建人腺苷激酶原核表达载体且目的 蛋白以包涵体形式表达.经包涵体洗涤、变性溶解,亲和层析及分步透析复性获得纯度达85%以上的重组蛋白.结论 人腺苷激酶表达载体的成功构建以及重组蛋白的纯化.为进一步进行其结构和功能的研究奠定了基础.     

颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析

目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定.方法:以体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T 载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a( ) 中,构建重组表达质粒pET28a( )-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3) plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性.结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a( )中,构建了表达质粒pET28a( )-GNLY.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性.结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础.     

人细小病毒B19 XA株VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的:通过DNA 重组技术,构建B19 病毒XA株VP1全长基因表达载体, 诱导重组VP1融合蛋白表达. 方法:自B19病毒感染患者血清中提取病毒DNA为模板,用PCR法扩增编码VP1蛋白的全长基因片段,以pET28(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET28(a)-VP1,转化E. coli. BL21(DE3),获得重组工程菌株.经IPTG诱导培养获得高效表达的VP1融合蛋白,SDS-PAGE、免疫印迹鉴定表达产物;并以该重组融合蛋白为抗原,免疫家兔,ELISA法检测所获抗体效价. 结果:①获得了含重组表达质粒pET28(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白.②经ELISA法检测抗VP1多克隆抗体效价为1: 12 800. 结论:重组工程菌可表达VP1融合蛋白,且该蛋白具有良好的免疫原性,对诊断试剂制备及疫苗研制具有重要意义.     

重组人β防御素4的原核表达、纯化及抗铜绿假单胞菌活性初探

目的制备原核表达的重组人β防御素4(human beta defensin 4,HBD4),初步探讨其对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性.方法将编码HBD4的DNA片段连接到大肠杆菌表达载体pET42a中,构建好的表达质粒pET42a-HBD4转化到表达菌株BL21(DE3)中,0.5 mmol/L IPTG诱导表达4 h,亲和纯化融合蛋白后经Western blot鉴定,再以肠激酶酶切融合蛋白,镍柱亲和层析分离HBD4;采用打孔法初测其抗铜绿假单胞菌活性,并用微量稀释法测定HBD4与3种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),比较其抗铜绿假单胞菌活性并异.结果 GST-HBD4在大肠杆菌中以可溶形式成功表达,纯化的重组HBD4体外对铜绿假单胞菌有抗菌活性,其效能略低于亚胺培南,而高于哌拉和环丙沙星.结论采用基因工程技术成功表达了重组HBD4,其对铜绿假单胞菌有较强的杀菌活性,具有烧伤创面感染治疗的应用前景.     

细粒棘球蚴重组延伸因子-1基因的表达、纯化及免疫学鉴定

目的对构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)延伸因子-1(Elongation factor1,EF-1)基因的重组质粒,并原核表达、纯化及对其免疫特性进行鉴定。方法从重组质粒EF-1/pGEM-T中酶切出EF-1目的片段,亚克隆入表达载体pET28a,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)plysS进行融合表达,经His-band树脂纯化试剂盒小量纯化,SDS-PAGE和Westernblot方法鉴定表达产物。结果成功构建Eg.EF-1/pET28a/E.coliBL21基因工程菌株,诱导表达重组蛋白和纯化分离得到31KDaEg.EF-1均能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别。结论初步证实该重组蛋白具有较好的抗原性。     

重组 CARDs TX 融合蛋白的表达纯化与复性

目的:构建 pET28α-CARDs TX 重组质粒,诱导 CARDs TX 融合蛋白表达,并对其进行纯化与复性研究。方法:将 CARDs TX 基因（MPN 372）克隆入 pET28α 载体,经 8 次点突变获得 pET28α-CARDs TX 重组质粒。转化大肠杆菌 BL21,IPTG 诱导表达。利用亲和层析技术纯化蛋白并通过 SDS-PAGE 和 Wetern Blot 检测 CARDs TX 的表达和纯化效果。利用尿素梯度复性法和扩大体积透析法对蛋白进行复性研究。结果:酶切和测序结果证明 pET28α-CARDs TX 重组质粒的 DNA 序列完全正确,在 BL21 中 CARDs TX 融合蛋白可高效表达,并可获得高纯度目的蛋白。利用扩大体积透析法对目的蛋白复性有较好的效果。 结论:成功构建出 pET28α-CARDs TX 重组质粒,且 CARDs TX 可在大肠杆菌中高效表达,并可获得高纯度的目的蛋白,为深入研究 CARDs TX 的生物学特性奠定了基础。     

肺炎链球菌自溶素基因的克隆、表达及蛋白纯化

 目的 克隆肺炎链球菌自溶素（LytA）基因并在大肠埃希菌中表达及蛋白纯化。方法 用PCR方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将其插入原核表达载体pET32a（+）,构建pET32a(+) - LytA重组质粒,经IPTG诱导使该基因在大肠埃希菌BL21 (DE3)中表达,亲和层析法纯化目的蛋白,将获得的蛋白用Western blot鉴定门结果扩增出的DNA序列与GenBank中的LytA基因序列一致,成功构建了pET32a(+) - LytA重组质粒并在大肠埃希菌中高效表达,所表达的蛋白经Western blot证实为肺炎链球菌自溶素融合蛋白。结论 成功克隆了肺炎链球菌自溶素基因,并将其在大肠埃希菌中表达、纯化,为新型肺炎链球菌疫苗的研制奠定了基础。