剪切修复基因XPD抑制Ox-LDL诱导人脐动脉平滑肌细胞的增殖

目的:探讨剪切修复基因——着色性干皮病D组基因(XPD)在氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)促血管平滑肌细胞增殖中的作用及机制。方法:将重组质粒pEGFP-N2/XPD利用脂质体转染人脐动脉平滑肌细胞(HUASMCs),实验分为空白对照组、空载质粒pEGFP-N2组、重组质粒pEGFP-N2/XPD组、Ox-LDL组、Ox-LDL+pEGFP-N2组和Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD组。用MTT法和Ed U法测定各组细胞的增殖率;流式细胞术检测各组细胞周期分布;利用Western blot法检测XPD、caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白水平。结果:Western blot实验结果发现,与空白对照组相比,pEGFP-N2/XPD组的XPD表达增加(P0.05),表明转染成功;MTT和Ed U检测结果显示,pEGFP-N2/XPD组的细胞增殖率较空白对照组降低(P0.05);与Ox-LDL组比较,Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD组细胞增殖明显被抑制(P0.05)。流式细胞术的检测结果显示,与空白对照组比较,pEGFP-N2/XPD组的S期细胞比例明显减少(P0.05),G0/G1期细胞比例明显增多(P0.05);与Ox-LDL组比较,Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD组的S期细胞比例减少(P0.05),G0/G1期细胞比例明显增多(P0.05)。Western blot结果显示,与对照组比较,pEGFP-N2/XPD组的cleaved caspase-3和Bax蛋白水平增加(P0.05),Bcl-2蛋白表达降低(P0.05);与Ox-LDL组比较,Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD组的cleaved caspase-3和Bax蛋白水平增加(P0.01),Bcl-2蛋白表达降低(P0.05)。结论:XPD能抑制HUASMCs的增殖并促其凋亡,还能抑制Ox-LDL的促HUASMCs增殖作用,有可能成为抗动脉粥样硬化治疗的靶点。     

人着色性干皮病基因D对HepG2细胞Mdm2和Mdm4表达的影响

 目的：探讨人剪切修复基因着色性干皮病基因D（xeroderma pigmentosum D, XPD）对肝癌细胞鼠双微体2（murine double minute 2，Mdm2）和鼠双微体4（murine double minute 4，Mdm4）表达的影响。方法：用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染进入人肝癌细胞株HepG2，实验分为3组：（1）空白对照组；（2）pEGFP-N2组；（3）pEGFP-N2/XPD组。用MTT法观察细胞的增殖活力；用流式细胞术检测细胞周期和凋亡率；用RT-PCR和Western blotting检测XPD、Mdm2、Mdm4和P53表达量的变化。结果：MTT结果显示，重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染抑制了肝癌细胞的增殖活力；流式细胞术结果显示，重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染引起了G 1期细胞增加，S期减少，凋亡率增加。RT-PCR和Western blotting检测发现，重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使得XPD表达增高，同时使得Mdm2和Mdm4表达降低，P53表达增高。结论：XPD能下调肝癌细胞中Mdm2和Mdm4的表达，上调P53表达，并能抑制肝癌细胞增殖及诱导其凋亡。     

沉默NANOG表达对人肝癌细胞HepG2中cyclin D1表达及细胞增殖的影响

 目的:探讨RNA干扰沉默NANOG表达后对肝癌细胞HepG2中细胞周期素D1(cyclin D1)表达及细胞增殖的影响。方法:将以NANOG基因为靶点的NANOG-siRNA瞬时转染肝癌细胞HepG2,real-time PCR和Western boltting检测NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白的表达,CCK-8和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期情况。结果:与mock组比较,转染NANOG-siRNA后,肝癌细胞HepG2中NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白水平均下调(P＜0.05),细胞增殖能力下降(P＜0.05),进入G 0/G 1期的细胞比例增多(P＜0.05)。结论:沉默NANOG表达可引起肝癌细胞HepG2中cyclin D1的表达下降,导致细胞增殖能力下降。     

人着色性干皮病D组基因对白细胞介素-6促进人血管平滑肌细胞增殖作用的影响

目的: 探讨人着色性干皮病D组基因(XPD)对白细胞介素-6(IL-6)促进人血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖作用的影响。方法: 用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空质粒pEGFP-N2稳定转染VSMCs,然后给予1×10⁵ U/L IL-6孵育48 h。实验分为6组:(1)空白对照组;(2)pEGFP-N2组;(3)pEGFP-N2/XPD组;(4)IL-6组;(5)IL-6 + pEGFP-N2组;(6)IL-6 + pEGFP-N2/XPD组。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况;用MTT法观察细胞增殖活力;用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;用RT-PCR和Western blotting检测XPD、Bcl-2、Bax和野生型P53(wt-P53)表达量的变化。结果: 在荧光显微镜下,可在转染了重组质粒pEGFP-N2/XPD或空质粒pEGFP-N2的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;MTT结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染抑制了细胞增殖活力(P<0.05),并能抑制IL-6促进VSMCs增殖的作用(P<0.05);流式细胞仪结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染引起了细胞G₀/G₁期增加(P<0.05)、S期减少(P<0.05)、凋亡率增加(P<0.01),并能抑制IL-6促进VSMCs G₀/G₁期减少、S期增加、凋亡率降低的作用(P<0.01);RT-PCR和Western blotting检测发现,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使得XPD表达增高(P<0.05或P<0.01),同时Bcl-2表达降低,Bax和wt-P53表达增高(P<0.05或P<0.01),并能抑制IL-6促进VSMCs的Bcl-2表达增高、Bax和wt-P53表达降低的作用(P<0.05或P<0.01)。结论: XPD能抑制VSMCs增殖并促进其凋亡,并能抑制IL-6促进VSMCs增殖和降低其凋亡的作用,有望成为治疗动脉粥样硬化的靶点。     

HBVx基因在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的：研究乙型肝炎病毒 Ｘ 基因在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响。方法：用分子生物学的方法构建 Ｈ Ｂ Ｖｘ 基因真核表达载体ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ３１ Ｈ Ｂ Ｘ，用脂质体将真核表达载体ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ３１ Ｈ Ｂ Ｘ转染入肝癌细胞 Ｈ Ｃ Ｃ９２０４ ， Ｇ４１８ ５００ ｍｇ· Ｌ－ １ 筛选，获得稳定表达 Ｈ Ｂｘ 蛋白的细胞，阿霉素２０ μｍｏｌ· Ｌ－ １ 诱导细胞凋亡。电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测凋亡细胞。结果：２０ μｍｏｌ· Ｌ－ １ 阿霉素可诱导肝癌细胞凋亡，稳定表达 Ｈ Ｂｘ 蛋白的肝癌细胞凋亡率比未进行基因转染的肝癌细胞凋亡率低。结论： Ｈ Ｂｘ 蛋白可抑制阿霉素诱导的肝癌细胞调亡。     

不同缺氧状态对人肝癌HepG2细胞侵袭和转移能力的影响

目的: 探讨不同缺氧状态对人肝癌HepG2细胞黏附、侵袭和转移能力的影响及其可能机制。方法: 不同浓度的低氧处理对数生长期的人肝癌HepG2细胞,采用MTT法、Transwell膜侵袭系统、免疫细胞化学方法、明胶酶谱分析和反转录PCR检测变异型白细胞分化抗原CD44v6、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、低氧诱导因子(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达差异。结果: HepG2细胞经低氧处理后,细胞的基质黏附率、穿透基底膜与游走迁移的细胞数均增高,以3%氧浓度最为显著(P<0.05);3%和5%氧处理还可显著促进CD44v6的表达,增加MMP-2和MMP-9的表达,并可上调HIF-1α和VEGF。结论: 适度缺氧能增强人肝癌细胞的黏附、侵袭和转移能力,其机制可能与CD44v6、基质金属蛋白酶、HIF-1α和VEGF的表达改变有关。     

牛蒡子苷诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的实验研究

目的：通过牛蒡子苷对肿瘤细胞的体外实验，探讨牛蒡子苷是否对人肝癌细胞（HepG2）具有生长抑制及诱导凋亡作用。方法：HepG2细胞培养液中加入不同浓度的牛蒡子苷，培养72 h，观查HepG2细胞的增殖率；倒置显微镜及投射电子显微镜观察HepG2细胞的形态变化；流式细胞仪（FCM）检测HepG2细胞周期及凋亡率；TUNEL法检测HepG2细胞凋亡率；免疫细胞化学检测HepG2细胞的增殖凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)表达。结果： 牛蒡子苷抑制HepG2细胞生长；阻滞HepG2细胞周期于G0/G1期并诱导细胞凋亡(P＜0.05)；通过下调Bcl-2蛋白表达（P＜0.01），上调Bax蛋白表达（P＜0.05）诱导HepG2细胞凋亡。结论： 牛蒡子苷对体外培养的HepG2细胞生长有抑制作用,其作用机制之一是通过诱导细胞凋亡。     

RNAi沉默WT1基因对人肝癌细胞HepG2的影响

目的:探讨利用RNA干扰沉默WT1基因对人肝癌细胞HepG2细胞生长,凋亡的影响,为肝癌的基因治疗提供理论依据。方法:利用脂质体将siRNA真核表达载体转入HepG2细胞中,并检测转染效率;利用免疫细胞化学染色方法检测HepG2细胞中WT1蛋白水平的表达,测定基因沉默效果;用MTT法测定HepG2细胞生长曲线;电镜下观察细胞凋亡形态,流式细胞仪检测凋亡率。结果:利用脂质体为载体将siRNA真核表达载体转染HepG2细胞,转染率达70%以上,转染后细胞中WT1蛋白表达水平下降;RNA干扰沉默WT1基因可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。结论:靶向WT1的序列特异性siRNA可显著抑制WT1基因的表达;下调HepG2细胞WT1基因表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

MAD2 RNA干扰载体的构建及其对胃癌细胞生长的影响

目的：构建MAD2（有丝分裂阻滞缺陷蛋白2）特异性RNA干扰真核表达载体,体外观察抑制MAD2基因表达对胃癌细胞生长和细胞周期的影响.方法：构建MAD2 siRNA真核表达载体,脂质体法将pSilencer3.1空载体和pSilencer3.1/MAD2-siRNA1和pSilencer3.1/MAD2-siRNA2真核表达载体分别导入人胃癌细胞系SGC7901.稳定转染后Western blot和RT-PCR检测胃癌细胞内MAD2蛋白及mRNA水平的表达情况,挑选出抑制效果最好的单个克隆.MTF法检测各实验组细胞生长情况,流式细胞术检测纺锤体抑制剂长春新碱作用后,胃癌细胞MAD2-siRNA转染组和空载体组细胞周期的分布.结果：成功构建MAD2 siRNA真核表达载体,转染胃癌细胞SGC7901可使其MAD2蛋白及mRNA表达显著下调.MAD2表达降低的胃癌细胞生长速度明显增快（P＜0.01）,经长春新碱作用后不能被阻滞于有丝分裂期.结论：小干扰RNA技术可以有效地特异性抑制胃癌细胞纺锤体检查点关键蛋白MAD2的表达.MAD2的抑制可使胃癌细胞SGC7901生长加速,增殖能力增强,同时减弱纺锤体抑制剂长春新碱阻滞细胞周期的作用.     

光敏化姜黄素对人肝癌细胞HepG2的增殖影响

目的：研究姜黄素的光敏化效应并探讨光敏化姜黄素对人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖和凋亡的影响。方法：采用人肝癌细胞株HepG2进行研究。细胞用不同浓度的姜黄素（2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L,80μmol/L,160μmol/L）孵育2 h后,用0.4 J/cm2剂量的紫光照射,光照的功率为10 mW。利用MTT法测定不同浓度的姜黄素对HepG2细胞的抑制作用,观察其紫光光敏化效应。在选择的姜黄素剂量下,分别用不同剂量的紫光照射,检测能量密度改变后光敏化姜黄素对细胞的杀伤作用。最终选定在20μmol/L浓度下,姜黄素用0.2 J/cm2紫光照射其对细胞的杀伤作用。利用Hoechst33342染色从形态学上在观察光敏化姜黄素对HepG2细胞的促凋亡效应,采用流式细胞仪定量检测光敏化姜黄素的凋亡率。结果 ：姜黄素在紫光下具有光敏化效应,IC50从单独作用的92.49μmol/L降到27.06μmol/L,且这种效应在低浓度姜黄素低剂量的能量密度下更加明显。形态学和流式细胞仪检测到光敏化姜黄素的促凋亡效应,且凋亡率是同剂量姜黄素作用的3倍。结论：紫光照射可明显增强低剂量姜黄素对HepG2的细胞毒性,并可显著诱导细胞凋亡。     

靶向泛素连接酶SIAH2的shRNA对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响

 目的：探讨shRNA介导的泛素连接酶SIAH2(seven in absentia homolog 2)基因表达抑制对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响。方法：用已构建的pGenesil-SIAH2重组质粒转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察转染效率。采用RT-PCR和Western blotting 技术检测重组质粒对SIAH2 mRNA和蛋白表达的影响,MTS比色法测定重组质粒转染对细胞体外增殖能力的影响,流式细胞术检测重组质粒转染后细胞周期和凋亡的变化。结果：与对照组相比,pGenesil-SIAH2能显著抑制SIAH2 mRNA和蛋白的表达水平;pGenesil-SIAH2转染组细胞增殖速度明显减慢;pGenesil-SIAH2组细胞明显阻滞于G1期,细胞凋亡率明显升高。结论: pGenesil-SIAH2能有效抑制HepG2增殖,使细胞周期阻滞在G1期,并诱导其早期凋亡。上述研究为以SIAH2为靶点的肝癌基因治疗提供实验依据。     

芹菜素对人肺癌A549细胞凋亡及相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响

目的研究芹菜素对人肺癌 A549细胞增殖抑制和凋亡诱导作用与 Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。方法10~80μmol/L 不同浓度芹菜素作用 A549细胞,采用 MTT 法检测芹菜素对 A549细胞增殖抑制作用;Hoechst 33258细胞核染色法观察芹菜素诱导细胞凋亡形态学的变化;流式细胞仪 AnnexinV- FITC/PI 双染色法检测细胞凋亡率;Western blot 法检测凋亡相关蛋白 Bax 和 Bcl-2表达的变化。结果 MTT 法显示,芹菜素对 A549细胞有显著的增殖抑制作用（P <0.01）,且具浓度和时间依赖性;荧光显微镜下观察到芹菜素处理组细胞出现典型的凋亡形态学改变：细胞核固缩、染色质凝集和核碎片化等;流式细胞仪分析结果显示,芹菜素呈浓度依赖性诱导 A549细胞凋亡;Western blot结果显示,促凋亡蛋白 Bax 随着芹菜素浓度升高表达增加,抗凋亡蛋白 Bcl-2随着芹菜素浓度升高表达减少。结论芹菜素具有抑制人肺癌 A549细胞增殖,诱导其凋亡的作用,其机制可能与上调 Bax 蛋白表达和下调 Bcl-2蛋白表达有关。     

下调p21活化蛋白激酶2表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响*

 目的： 应用RNA干扰技术下调人乳腺癌MCF-7细胞中p21活化蛋白激酶2（PAK2）的表达,观察其对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。方法: 构建针对PAK2基因的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体并包装病毒颗粒,感染MCF-7细胞,筛选获得稳定细胞株。Western blotting检测细胞中PAK2蛋白表达水平的改变;CellTiter 96 AQueous法和软琼脂集落形成实验检测MCF-7细胞体外增殖能力的改变;流式细胞术检测十字孢碱诱导的MCF-7细胞凋亡的变化。结果: MCF-7细胞的PAK2基因被沉默后,PAK2蛋白表达量明显下降（P<0.01）,与阴性对照组相比,sh-PAK2组细胞生长明显减缓（P<0.01）,克隆形成的数目和大小明显下降（P<0.01）,十字孢碱诱导的细胞凋亡率显著增加（P<0.01）。结论：通过RNA干扰技术下调PAK2的表达,可抑制MCF-7细胞的生长和增殖,并增强其对化疗药物诱导的细胞凋亡的敏感性。PAK2可能是潜在的乳腺癌治疗的新靶点。     

NS-398对肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的:探讨选择性环氧合酶II(COX-2)抑制剂NS-398对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响。方法: 应用MTT法研究不同浓度NS-398对HepG2细胞增殖的影响,DNA梯状电泳(DNA ladder)检测凋亡的发生,流式细胞仪检测细胞周期的改变及凋亡百分率的变化,竞争性RT-PCR检测环氧合酶II COX-2 mRNA及抑凋亡基因bcl-2 mRNA表达的改变。结果: NS-398呈剂量依赖性抑制HepG2细胞增殖,并诱导其凋亡,细胞周期分析表明随着浓度增大S期细胞明显减少,有G₀/G₁期细胞累积现象,并伴有Bcl-2 mRNA表达的下调,而对COX-2 mRNA表达改变无明显影响,且COX-2表达改变与NS-398引起的HepG2细胞的增殖和凋亡均无相关性(相关系数分别为:r=0.056,P>0.05和r=0.119,P>0.05)。结论: NS-398能明显抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡,与细胞G₀/G₁期阻滞以及bcl-2基因表达下调有关,而非依赖于抑制COX-2基因的表达。     

糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B对人肝癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响及其分子机制

 目的：研究糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B（glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B,GPNMB）对肝癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响及其分子机制。方法：以人HepG2细胞为研究对象,构建GPNMB的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）以及过表达载体,转染入细胞后分别采用MTT法、流式细胞术和Transwell小室法观察其对HepG2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。结果：增殖实验结果表明GPNMB可促进HepG2细胞的增殖;流式细胞术检测发现GPNMB对HepG2细胞凋亡几乎无影响;细胞侵袭结果表明GPNMB可促进HepG2细胞的侵袭;当整合素β1亚基基因被siRNA沉默后,GPNMB对HepG2细胞增殖和侵袭的促进作用均受到明显抑制。结论: GPNMB可能通过与整合素β1亚基相互作用促进肝癌细胞的增殖和侵袭能力,提示GPNMB可以作为治疗肝癌的潜在靶点。     

环氧合酶抑制剂NS-398增强放射诱导的肝癌细胞凋亡

目的：探讨环氧合酶-2（COX-2）选择性抑制剂NS-398对放射诱导的人肝癌细胞HepG2凋亡的影响及可能作用机制。 方法:应用MTT 法检测NS-398对细胞的抑制率;透射电子显微镜观察细胞凋亡的形态学变化,流式细胞术(FCM)定量检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因bcl-2、bax及caspase-3 mRNA表达;Western blotting检测Bc1-2、Bax蛋白表达;比色法分析caspase-3酶活性变化。 结果:NS-398对HepG2细胞的生长抑制作用呈时间与剂量依赖性;电镜下处理组细胞呈现典型的凋亡形态学变化,NS-398显著增加放射诱导的细胞凋亡,上调bax mRNA、Bax蛋白及caspase-3mRNA 表达,并增强caspase-3酶活性,而Bcl-2 表达无明显变化（P>0.05）。 结论:NS-398能增加放射诱导的HepG2细胞凋亡,其机制可能与上调Bax、 caspase-3表达,上升Bax／Bcl-2比例,激活线粒体凋亡通路,活化caspase-3,最终诱导细胞凋亡相关。     

siRNA沉默COX-2基因对人胰腺癌Capan-2细胞增殖、细胞周期、凋亡和成瘤能力的影响

目的: 研究siRNA沉默环氧合酶-2(COX-2)基因对人胰腺癌Capan-2细胞增殖、细胞周期、凋亡和成瘤能力的影响。方法: 以Lipofectamine 2000(Lipo)为载体转染siRNA-COX-2至Capan-2细胞。应用RT-PCR、realtime PCR检测COX-2-mRNA表达,Western blotting 检测COX-2蛋白的表达。应用细胞直接计数法检测细胞的增殖,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡与周期。应用裸鼠模型评估COX-2-siRNA转染的Capan-2细胞成瘤能力的影响。结果: 在siRNA-COX-2浓度为50 nmol/L、Lipo为5 μL∶ 2 mL转染容积条件下,在Capan-2细胞的转染效率可达96.47%。siRNA-COX-2沉默Capan-2细胞中 COX-2 基因表达的最佳序列为siRNA006,转染24 h以后沉默效率达73%,COX-2蛋白表达水平在转染后48 h和72 h分别被下调了67% 和 61%。转染48 h后,Capan-2细胞生长明显减慢(P<0.05),48 h和72 h抑制细胞增殖率分别为35.48% 和56.32%。细胞凋亡率较对照组高(P<0.05),48 h和72 h细胞凋亡率为2.03%和3.27%。转染24 h、48 h和72 h G₀/G₁期的比例分别是58.03%、63.31%和65.66%,S期的比例分别是30.27%、24.87%和22.2%。siRNA-COX-2转染Capan-2细胞在裸鼠的皮下形成的肿瘤体积和重量明显减少(P<0.05)。结论: siRNA006-COX-2可有效沉默 COX-2 基因的表达,可明显抑制Capan-2细胞的生长并降低其成瘤能力。