PNP-TK融合自杀基因系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的分析PNP—TK融合自杀基因系统对HepG2肝癌细胞的杀伤作用及其对肝癌细胞的杀伤机制。方法利用重组PCR定点诱变法制备PNP—TK融合基因,将其插入真核表达载体pcDNA3．0中,构建融合基因表达载体pcDNA3．0／PNP—TK,经酶切、PCR及测序鉴定重组体,G418筛选获得稳定转染了pcDNA3．0／PNP—TK的抗性细胞克隆。RT-PCR和WesternBlotting检测PNP—TK基因在HepG2细胞中的表达。台盼兰排斥法测定细胞生长曲线,MTF法检测细胞对相应前药的敏感性及分别在一种和两种前药作用下所导致的旁观者效应。结果融合基因片段PNP—TK正确插入了pcDNA3．0载体中,pcDNA3．0／PNP—TK在肝癌细胞株HepG2中实现了表达。细胞抗性克隆对相应的前药十分敏感。在两种前药的联合作用下,pcDNA3．0／PNP—TK对肝癌细胞产生了良好的旁观者效应。结论具有双自杀基因功能的表达载体pcDNA3．0／PNP-TK对肝癌细胞HepG2有着良好的杀伤作用,有望将其应用于肝癌体内治疗。     

AFP增强子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞杀伤的实验研究

目的 探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统体外靶向杀伤肝癌细胞效应.方法 构建人AFP增强子驱动的pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,脂质体转染肝癌细胞,检测TK mRNA和蛋白表达.MTT法检测GCV对肝癌细胞的杀伤作用.结果 成功构建pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,在AFP阳性HepG2细胞中检测到TK mRNA和蛋白表达,添加GCV 可特异性地杀伤HepG2细胞,而AFP阴性的SMMC7721细胞生长不受影响.结论 AFP增强子驱动的TK/GCV自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞.     

胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞体外杀伤作用

目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞的杀伤作用。方法利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒感染膀胱癌细胞株Mb49细胞,RT-PCR检测CD及TK表达,MTT法测定感染病毒Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性及旁观者效应。结果RT-PCR可检测到腺病毒感染的Mb49细胞中CD及TK表达,腺病毒感染的Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性增强,且细胞存活率随前药浓度增加而明显降低,联合应用杀伤效果更强。在混合培养细胞中转染细胞为10%时,GCV组、5-FC组、GCV 5-FC组细胞存活率分别为(79.55±0.88)%、(77.17±3.38)%、(49.21±1.78)%,有较强的旁观者效应。结论腺病毒载体能有效转导CD-TK融合双自杀基因在膀胱癌细胞中表达,CD-TK融合双基因系统对膀胱癌细胞有更强杀伤效果和更明显的旁观者效应,优于单基因系统,值得进一步研究。     

不同启动子调控的PNP基因载体的构建和表达差异性分析

目的分别构建巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)通用启动子和甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)组织特异性启动子调控的PNP基因表达载体并分析二者表达的差异性。方法将AF0．3启动子插入载体pcDNA3．0，构建肝癌细胞特异表达载体pAF0．3；将PNP基因分别插入到pcDNA3．0和pAF0．3中，构建不同启动子调控下的PNP基因表达载体pcDNA3．0／PNP和pAF0．3／PNP；通过酶切、PCR及测序鉴定各重组体。采用脂质体介导法将两种PNP基因表达载体转染不同的细胞株，RT—PCR检测PNP基因在各细胞株中的表达，分析二者表达的不同。结果各目的片段均成功插入相应的载体中，CMV启动子调控下的PNP基因在各株细胞中均实现了表达，而AF0．3启动子调控下的PNP基因则在AFP阳性肝癌细胞中实现了组织特异性表达。结论两PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效的治疗载体，且pAF0．3／PNP还实现了在AFP阳性肝癌细胞中的靶向性表达。     

自杀基因CD、TK的共表达对人肺腺细胞的杀伤作用

目的 观察双自杀基因的共表达与单自杀基因单独表达对癌细胞的杀伤作用。方法 分别构建了以CMV为启动子,含单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）和／或大肠杆菌嘧啶脱氨酶（Ecoli.CD)单、双自杀基因的真核表达载体。在脂质体介导下将基因导入细胞,经G418筛选出稳定表达的克隆。用PCR、半定量RT－PCR检测各组基因的整合及表达。给予前本药物5－氟胞嘧啶（5－flurocytosine,5-Fc)和／或无环岛苷（Ganciclovir,GCV)后,用MTT法测定各围基因组细胞的存活率。结果 单、双自杀基因均在GLC－82细胞中稳定表达,双基因转染组对细胞增殖的杀伤及旁杀伤效应高于单基因组。结论 TK＋CD／5－Fc GCV的双基因共表达体系较CD／6－Fc或TK／GCV单 基因体系对细胞具有更强的杀伤作用。     

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因对人胃癌细胞的作用

目的：探讨大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因对胃癌细胞MKN-45的抑制及杀伤作用, 并证实旁观者效应。方法：构建真核表达载体pcDNA3.1-ePNP, 将重组载体转染MKN-45细胞获得高表达大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因（ePNP）的MKN-45细胞克隆。在MKN-45/ePNP细胞培养物中加入前体药物MePdR, 观察MePdR对该细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果：随MePdR浓度的增大, MKN-45/ePNP细胞的生存率逐步下降,在MePdR浓度达到1 mg•L^-1时MKN-45/ePNP细胞全部被杀灭, 而未经转染的MKN-45细胞的生存率则不受影响，MePdR对MKN-45/ePNP有显著的抑制及杀灭作用；当MKN-45/ePNP细胞占总细胞的10%时，全部细胞被杀死。结论:ePNP/MePdR 自杀基因系统对胃癌细胞有生长抑制及杀伤作用并具有旁观者效应。     

双自杀基因重组腺病毒对胃癌细胞及血管内皮细胞的体外特异性杀伤作用

目的研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD／TK融合基因（AdKDR—CDglyTK）对胃癌细胞及血管内皮细胞的选择性杀伤作用。方法选择表达KDR的MGC803细胞、ECV304细胞和不表达KDR的LS174T细胞，用腺病毒重组体AdEasy-KDR—CDglyTK和AdEasy—CMV—CDglyTK感染之，观察其感染效率并以RT—PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达．然后给予不同浓度的前药5一FC及GCV处理，观察该体系对不同细胞株的杀伤效应。结果两种重组体对各细胞株的感染率相似，其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。RT—PCR检测发现：除感染AdKDR—CDglyTK的LS174T细胞外．感染AdCMV—CDglyTK的所有细胞及感染AdKDR—CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞均有目的基因CDglyTK的表达。以感染复数为100的两种腺病毒分别感染各细胞株，其表现出对前药不同的敏感性：感染AdCMV—CDglyTK的所有细胞株和感染AdKDR—CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞对前药具有较高的敏感性．且其敏感性差异无显著性意义（P〉0．1）；相比之下，感染AdKDR—CDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感（P〈0．001）。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效（P〈0．001）。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养，观察到该体系明显的旁观者效应。结论KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR胃癌细胞及血管内皮细胞。     

肝癌特异性HSV-TK／CD基因表达质粒的构建及其杀伤活性

[目的]构建肝癌特异性双自杀基因表达质粒。[方法]用平端连接方法将pUH-3质粒中822bp的pALBeAFP片段(含有416bp的白蛋白启动子pALB和406bp的甲胎蛋白增强子eAFP)代替pCEA-CD／TK质粒的CEA启动子，用PCR法鉴定插人方向，构建肝癌特异性双自杀基因表达质粒pALBeAFP-CD／TK。将pALBeAFP-CD／TK转染HepG2等4种肝癌细胞，MTT法测定前药GCV、5-FC对HepG2细胞的杀伤作用。[结果]获得pALBeAFP-CD／TK克隆，RT-PCR证实HepG2细胞转染pALBeAFP-CD／TK后可表达自杀基因．pALBeAFP-CD／TK转染可使前药GCV、5-FC特异性地杀伤HepG2细胞。[结论]肝癌特异性HSV-TK／CD基因表达质粒构建成功。     

CEA启动子启动双自杀基因与单自杀基因对Lovo细胞杀伤作用的比较

【目的】探讨CEA启动子(CEA promoter，Cp)启动的双自杀基因胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)与胸苷激酶(thymidine kinase，TK)组织特异性对Lovo结肠癌细胞杀伤作用是否优于单一自杀基因。【方法】以带有Cp、CD与TK的重组腺病毒转染的Lovo细胞作为实验组，未转染者为对照组，5-氟胞嘧啶(5-fluomcytosine，5-Fc)组系列质量浓度：10、8、6、4、2、0μg／mL；更昔洛韦(ganciclovir，GCV)组系列质量浓度：5、4、3、2、1、0μg／mL；两药联合应用的系列质量浓度：(10 5)、(8 4)、(6 3)、(4 2)、(2 1)、0μg／mL。光镜观察细胞形态，噻唑蓝法测定细胞生长抑制率(growth inhibition rate，GIR)及半数抑制浓度(IC50）。病毒转染的Lovo细胞与未转染的Lovo细胞按不同比例混合培养，给予5-Fc 5μg／mL或，和GCV10μg／mL，噻唑蓝法测定细胞GIR。【结果】对照组5-Fc与GCV对细胞的生长抑制作用极低，5-Fc组IC50为2400μg／mL，GCV组为3500μg/mL。实验组随5-Fc与GCV剂量增加，对细胞的杀伤作用明显增加，5-Fc组IC50为5．75μg／mL，GCV组为3．50μg／mL两者同时应用相当于5-Fc 1．90μg/mL GGV0．95μg／mL，细胞对5-Fc的敏感性提高417．4倍，对GCV的敏感性提高1000倍。病毒杀伤Lovo细胞具有明显的“旁观者”效应，联合应药组的“旁观者”效应明显高于单独应用组。【结论】双自杀基因细胞毒效应以及“旁观者”效应均高于单一自杀基因。     

肝癌特异性HSV-TK/CD基因表达质粒的构建及其杀伤活性

[目的]构建肝癌特异性双自杀基因表达质粒.[方法]用平端连接方法将pUH-3质粒中822 bp的pALBeAFP片段(含有416 bp的白蛋白启动子pALB和406 bp的甲胎蛋白增强子eAFP)代替pCEA-CD/TK质粒的CEA启动子,用PCR法鉴定插入方向,构建肝癌特异性双自杀基因表达质粒pALBeAFP-CD/TK.将pALBeAFP-CD/TK转染HepG2等4种肝癌细胞,MTT法测定前药GCV、5-FC对HepG2细胞的杀伤作用.[结果]获得pALVeAFP-CD/TK克隆,RT-PCR证实HepG2细胞转染pABeAFP-CD/TK后可表达自杀基因,pALBeAFP-CD/TK转染可使前药GCV、5-FC特异性地杀伤HeFG2细胞.[结论]肝癌特异性HSV-TK/CD基因表达质粒构建成功.     

Experimental Studies on PNP Suicide Gene Therapy of Hepatoma

To investigate the killing effect of PNP/MeP-dR suicide gene system on hepatoma cells, pcDNA3. O/PNP, an eukaryotic expression vector harboring E. coli PNP gene, was transfected into human hepatoma HepG2 cells by liposome-mediated method. A HepG2 cell line with stable PNP gene expression, HepG2/PNP, was established with presence of G418 selection. The cell growth curves were determined with trypan blue staining. The sensitivity of HepG2/PNP to MePdR and bystander effects were assayed by MTT and FCM methods. The enzymatic activity of the product of PNP gene was determined by HPLC method. The cytotoxic effects of MeP-dR on HepG2/PNP cells were obvious (IC50 =4.5 μmol/L) and all HepG2/PNP cells were killed 4 days after the treatment with 100μmol/L MeP-dR. In mixed cultures containing increasing percentages of HepG2/PNP cells, total population killing was demonstrated when HepG2/PNP cells accounted for as few as 5 % of all HepG2 cells 8 days after the treatment with 100μmol MeP-dR. Highpressure liquid chromatography (HPLC) demonstrated that the PNP enzyme could convert MePdR into 6-MP. PNP/MeP-dR suicide gene system had an advantage over traditional suicide gene systems for hepatoma gene therapy. Our e results suggest that high-level bystander effects of this system result in significant anti-tumor responses to hepatoma gene therapy, especially in vivo.     

Experimental studies on PNP suicide gene therapy of hepatoma

Summary To investigate the killing effect ofPNP/MeP-dR suicide gene system on hepatoma cells, pcDNA3. 0/PNP, an eukaryotic expression vector harboringE. coli PNP gene, was transfected into human hepatoma HepG2 cells by liposome-mediated method. A HepG2 cell line with stablePNP gene expression, HepG2/PNP, was established with presence of G418 selection. The cell growth curves were determined with trypan blue staining. The sensitivity of HepG2/PNP to MeP-dR and bystander effects were assayed by MTT and FCM methods. The enzymatic activity of the product ofPNP gene was determined by HPLC method. The cytotoxic effects of MeP-dR on HepG2/PNP cells were obvious (IC₅₀=4.5 μmol/L) and all HepG2/PNP cells were killed 4 days after the treatment with 100 μmol/L MeP-dR. In mixed cultures containing increasing percentages of HepG2/PNP cells, total population killing was demonstrated when HepG2/PNP cells accounted for as few as 5% of all HepG2 cells 8 days after the treatment with 100μmol MeP-dR. High-pressure liquid chromatography (HPLC) demonstrated that thePNP enzyme could convert MeP-dR into 6-MP.PNP/MeP-dR suicide gene system had an advantage over traditional suicide gene systems for hepatoma gene therapy. Our e results suggest that high-level bystander effects of this system result in significant anti-tumor responses to hepatoma gene therapy, especiallyin vivo. CAI Xiaokun, male, born in 1972, M.D., Ph.D. This project was supported by a grant from the National Natural Science Foundation of China (No. 30330680).     

大肠癌细胞的双自杀基因治疗

目的探讨腺病毒介导的双自杀基因对大肠癌细胞的杀伤作用及其放射增敏作用。方法用重组的腺病毒载体感染大肠癌细胞株SW480,用RT-PCR方法检测CD(cytosine deaminase)-TK(thymidine kinase)融合基因的表达,单独或联合给予前体药物GCV和5-FC后,用MTT法测定双自杀基因对大肠癌细胞的体外杀伤效应,用克隆形成实验分析感染有自杀基因的大肠癌细胞的放射增敏作用。结果感染有自杀基因的大肠癌细胞,在给予前体药物后,细胞的存活率明显下降,联合给予GCV和5-FC细胞的存活率较单独给GCV或5-FC存活率明显降低(χ2=30.371,P<0.01);联合使用5-FC和GCV时,CD-TK自杀基因的旁观者效应最明显(P<0.01);使用GCV和(或)5-FC能增加感染有自杀基因的大肠癌细胞对照射的敏感性,在联合使用前体药物时更为明显(P<0.01)。结论CD-TK双自杀基因体系对大肠癌细胞具有显著的杀伤作用和放射增敏作用,证明双自杀基因系统具有临床应用价值。     

融合自杀基因对骨肉瘤细胞作用的实验研究

目的观察单纯疱疹病毒-胸苷激酶/胞嘧啶脱氨酶融合自杀基因（HSV TK/CD）对骨肉瘤细胞增殖的影响。方法将含TK/CD的重组腺病毒载体感染人骨肉瘤细胞系MG 63细胞,测定感染效率后,分别给予不同浓度的前体药物和不同感染复数的自杀基因重组腺病毒,计算瘤细胞增殖抑制率,MTT法测定细胞存活率,并用流式细胞术和Hochest 33342 染色法分析杀伤机制。结果含自杀基因的重组腺病毒成功感染MG 63细胞;不同感染复数和不同前体药物浓度下,融合自杀基因系统对瘤细胞的杀伤作用明显强于单基因和双基因相加的作用 (P＜0.05);其杀伤机制为致细胞坏死和细胞凋亡。结论融合自杀基因HSV TK/CD对骨肉瘤细胞系MG 63细胞的生长有明显的抑制作用。     

腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对乳腺癌治疗作用.方法 用重组VEGFP-CD/TK-GFP基因的腺病毒体外感染表达VEGF的乳腺癌MCF-7细胞和对照组不表达VEGF的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染效率,以RT-PCR检测受感染细胞CD/TK的表达,然后给子前药环氧鸟苷(GCV)和/或5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响;用流式细胞术观察细胞周期变化.建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,采用瘤内注射腺病毒载体联合腹腔内注射前药GCV和/或5-FC治疗后,观察肿瘤生长情况.结果 腺病毒对两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增.RT-PCR检测发现转染Ad-VEGFP-CD/TK的MCF-7细胞有目的 基凶的表达,而乳腺上皮细胞无表达.MTT法检测显示表达VEGF的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达VEGF的乳腺上皮细胞对前药不敏感,CD/TK融合基因对MCF-7的疗效优丁任一单自杀基因(P＜0.01).在感染复数为100时,用流式细胞仪分析细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞减少.在MCF-7裸鼠移植瘤模型中.该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的牛长.其疗效优于任一单自杀基因(P<0.01).结论 腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因联合GCV和5-FC能有效治疗乳腺癌,其效果优于单自杀基因系统.     

靶向性双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞的杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的前药/血管内皮生长因子受体(KDR)启动子-双自杀基因系统对血管内皮细胞的杀伤作用。方法 应用PCR扩增出KDR启动子、CD基因、TK基因序列,构建pKDR-CDglyTK质粒;以Adeasy-1系统为载体,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带KDR启动子调控下的CD与TK的融合基因腺病毒重组质粒pAdKDR-CDglyTK,重组质粒在293细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,以不同的感染复数(MOI)体外感染脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),利用重组病毒携带的绿色荧光蛋白(GFP)基因,荧光显微镜下观察重组腺病毒的感染效率,并给予不同浓度的GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),比较GCV(ganciclovir)和/或5-FC联合对转基因HUVEC细胞的杀伤作用。结果 成功构建了AdKDR-CDglyTK重组病毒,并高效地转染了HUVEC,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高。被转染的HUVEC对GCV和5-FC高度敏感。另外,MOI一定时,细胞存活率随GCV和5-FC浓度增加递减;GCV和5-FC浓度一定时,细胞存活率随MOI升高而降低。不同前药组细胞存活率结果显示:联合应用GCV+5-FC较单用GCV或5-FC对感染细胞的杀伤作用更强(P<0.05)。结论 KDR启动子-双自杀基因系统对脐静脉内皮细胞具有强烈的杀伤作用,其杀伤效率与GCV和5-FC的浓度及重组腺病毒的MOI相关,联?     

双自杀基因重组腺病毒对胃癌细胞及血管内皮细胞的体外特异性杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK融合基因(AdKDR-CDglyTK)对胃癌细胞及血管内皮细胞的选择性杀伤作用。方法 选择表达KDR的MGC803细胞、ECV304细胞和不表达KDR的LS174T细胞,用腺病毒重组体AdEasy-KDR-CDglyTK和AdEasy-CMV-CDglyTK感染之,观察其感染效率并以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应。结果 两种重组体对各细胞株的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。RT-PCR检测发现:除感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞外,感染AdCMV-CDglyTK的所有细胞及感染AdKDR-CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞均有目的基因CDglyTK的表达。以感染复数为100的两种腺病毒分别感染各细胞株,其表现出对前药不同的敏感性:感染AdCMV-CDglyTK的所有细胞株和感染AdKDR-CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞对前药具有较高的敏感性,且其敏感性差异无显著性意义(P>0.1);相比之下,感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.001)。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(P<0.001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应。结论 KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR胃癌细胞及血管内皮细胞。