丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠埃希菌中的表达及其纯化

目的 建立稳定表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的原核表达系统,获得高产量的纯化核心蛋白.方法 以HCV株全长Cdna 序列为模板,PCR扩增获得核心蛋白基因,构建原核表达载体Pet-32a(+)-HCV-Core.转化大肠埃希菌DH5α,提取质粒,验证正确后,再次转化大肠埃希菌BL21中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot验证融合蛋白的表达.超声破碎表达菌,Ni+-亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性.结果 成功构建了原核表达载体Pet-32a(+)-HCV-Core,并表达了预期分子量大小的目的蛋白.结论 成功表达、纯化HCV核心融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础.     

肝癌相关蛋白FAM172A2的克隆表达及多克隆抗体制备

目的 构建肝癌相关蛋白FAM172A2的原核表达载体,诱导融合蛋白的表达,并对其进行纯化;制备兔抗FAM172A2蛋白多克隆抗体并进行鉴定.方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以HepG2细胞总RNA为模板,扩增FAM172A2目的基因片段1113bp,构建原核表达载体,Western blot分析证实融合蛋白表达的特异性.诱导其大量表达后纯化、复性并制备多克隆抗体,Western blot及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测特异性及其效价.结果 扩增获得FAM172A2基因片段,成功诱导FAM172A2融合蛋白表达并制备其多克隆抗体.ELISA检测证实其效价＞1∶160000,且特异性良好.结论 利用大肠埃希菌BL21( DE3)能够成功表达FAM172A2蛋白,获得高特异性、高效价兔抗FAM172A2蛋白的多克隆抗体.     

人Eppin基因的原核表达及抗原性鉴定

目的 构建人附睾蛋白酶抑制蛋白(epididymal protease inhibitor,eppin)基因原核表达质粒,表达并纯化重组蛋白,并探讨其抗原性及应用价值.方法 以健康人睾丸组织cDNA为模板进行PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a,并转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,并对纯化产物进行Western印迹鉴定.结果 重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后证实构建成功;SDS-PAGE结果显示表达产物为相对分子质量36KD的融合蛋白,Western印迹检测纯化后蛋白显示特异性条带.结论 成功构建了pET-32a-Eppin重组质粒,并获得了具有抗原特异性的可溶性Eppin蛋白,为进一步研究其生物学活性及免疫性避孕效应奠定了基础.     

JC病毒Agnoprotein在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的 构建JC病毒Agnoprotein基因的原核表达载体,表达纯化该蛋白.方法 PCR扩增患者脑脊液中JC病毒晚期调节蛋白Agnoprotein基因,测序正确后克隆入pET-32a(+)原核表达载体,诱导表达Agnoprotein蛋白并纯化.结果 pET-32a(+)-Agnoprotein表达出预期分子量大小的具有免疫活性的重组融合蛋白.结论 成功地表达纯化了Agnoprotein融合蛋白,为进一步研究其生物功能奠定了基础.     

DOC-1基因的原核表达载体构建及其重组蛋白的表达纯化

目的：克隆DOC-1基因、构建原核表达载体并纯化出其重组蛋白。方法：从人胎脑组织中提取总RNA，经逆转录一聚合酶链式反应（RT—PCR）扩增DOC-1的CDS序列，再通过基因重组技术将该基因片段依次克隆到pMO18-T和pGEX-4T-1载体中，构建融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1，经酶切、测序鉴定后，用该重组质粒转化E．coliBL21，用IPTG诱导表达，Glutathlone Sepharose 4B柱亲和层析纯化重组蛋白。结果：电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因DOC-1长度一致，测序结果与GenBank公布的DOC-1基因序列完全一致，IPTG诱导后经SDS—PAGE电泳分析表明，在相对分子质量38000左右出现新的蛋白表达条带，经亲和层析柱纯化后得到高纯度的GST-p12重组蛋白。结论：成功构建了pGEX-4T-1-DOC-1原核表达载体，表达并纯化出GST-p12重组蛋白，为进一步研究p12^DOC-1蛋白打下了实验基础。     

淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB基因的克隆及原核表达

目的:构建淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB的融合表达载体,并在原核系统中表达,获得基因重组蛋白,为进一步研究淋病奈瑟菌外膜蛋白的致病作用和免疫保护性提供基础。方法:根据PorB已知序列设计一对引物,用PCR方法从淋病奈瑟菌标准菌株NG 29403基因组DNA中扩增出PorB基因,与原核表达质粒pGEX-4T-1构建重组子pGEX-4T-PorB,并将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞。重组子经酶切、PCR鉴定和核酸序列分析正确后,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达,用SDS-PAGE及Western印迹进行鉴定。结果:限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了淋病奈瑟菌外膜蛋白1 047 bp的PorB基因,成功构建了重组质粒pGEX-4T-PorB,经SDS-PAGE及Western印迹分析显示重组质粒pGEX-4T-PorB在大肠埃希菌中得到了高效融合表达。结论:成功构建pGEX-4T-PorB原核表达载体,并在原核系统中得到了高效表达。     

乙型肝炎病毒X抗原结合蛋白1的原核表达及亚细胞定位

目的应用酵母双杂交及生物信息学技术筛选乙型肝炎病毒X抗原结合蛋白1(HBXBP1)并进行克隆,探讨其在大肠埃希菌BL21中表达及亚细胞定位。方法应用反转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HBXBP1基因片段,连接到pGEM-T载体,双酶切鉴定及测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21,通过IPTG诱导表达以获得HBXBP1融合蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot分析证实融合蛋白的特异性;构建HBXBP1基因的绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1-HBXBP1,转染HepG2细胞,24h后于荧光显微镜下观察表达蛋白的亚细胞定位。结果 RT-PCR扩增获得921bp的HBXBP1基因片段,插入原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导成功获得约56kD的重组蛋白,经Western blot分析证实其具有良好的特异性;成功构建HBXBP1基因的绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1-HBXBP1,其表达蛋白定位于细胞质。结论 pET-32a(+)-HBXBP1原核表达载体在大肠埃希菌BL21中诱导表达HBXBP1融合蛋白;HBXBP1基因可表达HBXBP1蛋白且定位于细胞质,为研究HBXBP1蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了一定的理论基础。     

新基因BC047440原核表达载体构建及其重组蛋白的表达纯化

目的 构建肝癌相关新基因BC047440原核表达载体,表达并纯化出其重组蛋白.方法 从HepG2细胞中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增BC047440cDNA,克隆进质粒pMD19-T,转化E.coliDH5α,测序正确后,酶切目的基因片段,插入质粒pET-28a(+),转化E.coliBL21,IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白.结果 电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因BC047440长度一致.RT-PCR纯化产物与载体pMD19-T连接后,经蓝白斑筛选,挑出5个白色菌落做酶切鉴定,其中2个菌落被证实为阳性克隆.测定其基因序列,结果显示与Genbank公布的BC047440基因序列完全一致.将BC047440cDNA插入质粒pET-28a(+),转化E.coliBL21,培养过夜后,挑选7个白色菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆.IPTG诱导其中一个克隆表达蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量23000左右出现新的蛋白表达条带,诱导4h后表达蛋白量最多,占菌体总蛋白的22.3%.将诱导3h的菌体超声破碎后,Ni柱亲和层析,50和125mmol/L咪唑洗脱液SDS-PAGE电泳显示出清晰的单一条带.结论 成功构建BC047440基因原核表达载体,表达并纯化出重组蛋白,为深入研究其临床应用打下基础.     

沉默调节蛋白6-谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白的克隆表达

目的 构建含有人沉默调节蛋白6(hSIRT6)基因的重组原核表达载体,获得高效表达hSIRT6蛋白的基因工程菌,以及较高产量的SIRT6蛋白.方法 取205 ng HEK293细胞总RNA逆转录后合成的cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hSIRT6的编码序列,并克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组的质粒pGEX-4T-3/SIRT6;将重组质粒pGEX-4T-3/SIRT6转化感受态细菌BL21( DE3),在含100 mg/L氨苄西林的LB平板37℃培养过夜,以pGEX-4T-3空载体作为对照,在相同条件下转化并异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶(GST)蛋白.产物经SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定.结果 PCR产物大小及双酶切鉴定证明所克隆的基因是hSIRT6,DNA测序进一步证实与GeneBank序列完全一致.获得高表达及纯化的SIRT6-GST融合蛋白,该可溶蛋白的相对分子质量为72×103,经Western blot鉴定证实为目的蛋白.结论 成功构建了基因重组体pGEX-4T-3/hSIRT6,并制备出可溶性SIRT6-GST融合蛋白.     

pET14b-His-TAT-ERK2和无活性突变体pET14b-His-TAT-ERK2(AF)原核表达载体的构建和表达

目的：构建基于转录激活因子（TAT）技术的细胞外信号调节激酶（ERK）2及其无活性突变体ERK2（AF）原核载体并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。方法：采用聚合酶链式反应（PCR）技术从pcDNA3-Flag-ERK2和pcDNA3-Flag-ERK2（AF）质粒中扩增出ERK2和ERK2（AF）基因,插入pET14b-His-TAT载体中,构建重组质粒pET14b-His-TAT-ERK2和pET14b-His-TAT-ERK2（AF）,并诱导原核表达、纯化融合蛋白。采用Western blot方法检测表达蛋白的His标签。结果：酶切和测序结果表明,扩增的ERK2和ERK2（AF）基因正确,大小为1082bp;10%SDS-PAGE凝胶电泳可见原核表达纯化得到高纯度目的蛋白,大小为41 kD;Western blot检测显示,原核蛋白带有His标签。结论：成功构建了ERK2和ERK2（AF）的原核表达载体,该载体能在大肠杆菌中表达,纯化得到了His-TAT-ERK2和His-TAT-ERK2（AF）蛋白,为研究ERK2蛋白的功能提供了重要工具。     

膝关节后交叉韧带断裂治疗临床分析

目的 对35例膝关节后交叉韧带断裂治疗进行临床分析,重点探讨了有关交叉韧带断裂的治疗问题。方法 经明确诊断后,分析采用胫骨附着处撕脱骨折复位固定手术治疗26例、早期髌韧带中1／3移植重建3例、单纯长腿石膏固定6例。结果 本组病例全部进行随访,随访时间13个月－5年,胫骨附着处撕脱骨折复位固定及髋韧带中1／3移植重建29例为优良、单纯长腿石膏固定6例为差。结论 后交叉韧带断裂后应该及时给予手术修复;膝后外侧手术入路,操作简单,暴露充分;少于3个月的陈旧性病例仍适应手术治疗。     

不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效分析

目的：探讨不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效。方法：2008年3月-2013年2月收治指尖离断患者80例,38例吻合指侧方静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1或1：2或2：2,平均1：2;22例吻合指腹静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1;20例未吻合静脉,术中仅吻合1条动脉,行侧切口或甲床放血。观察各组治疗效果。结果：吻合指侧方静脉组手指全部成活,无一例发生回流障碍;吻合指腹静脉组19例发生静脉危象,其中4例手指坏死;未吻合静脉组20例均发生回流障碍,其中6例手指坏死。58例获随访,随访时间6~28个月。吻合指侧方静脉组32例,指尖外形佳、指腹饱满;吻合指腹静脉组14例,指体轻度萎缩,指甲生长不平整;未吻合静脉组12例,指体萎缩明显。吻合指侧方静脉组指甲生长近平整,长度长于其他两组[（14.4±3.2）mm比（12.5±2.3）mm和（12.2±2.2）mm],远侧指间关节活动度大于其他两组[（63±5）°比（48±3）°和（45±7）°],两点分辨觉小于其他两组[（4.6±0.4）mm比（7.1±1.2）mm和（7.3±0.6）mm],感觉级别高于其他两组[S（3.45±0.39）级比S（2.57±0.42）级和S（2.55±0.49）级],差异均具有显著性（P〈0.05）。吻合指腹静脉组和未吻合静脉组在指甲长度、运动和感觉方面差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：吻合指侧方静脉能有效解决指尖再植静脉回流问题,可避免回流障碍,成活率高,促进指甲生长,可恢复 DIPJ 活动度及感觉。     

胫骨干骨折的手术治疗对策

目的：明确不同固定器械在胫骨干不同骨折类型固定中的特点，以指导临床应用。方法：68例胫骨干骨折，行加压钢板螺钉、交锁髓内钉、单侧外固定架固定后，作临床疗效分析。结果：加压钢板固定组42例，感染5例，骨不连1例，平均愈合时间3．8个月；交锁髓内钉固定组13例，无感染及骨不连，平均愈合时间5．4个月；单侧外固定架组13例，骨不连1例，踝关节背伸受限3例，平均愈合时间4．5个月。结论：胫骨骨折交锁髓内钉固定并发症少，功能恢复好，适用范围广，但要注意及时进行动力加压。加压钢板及外固定架固定应选择各自的最佳适应证，以达到理想的疗效。