CMVE-PEG3启动子在前列腺癌DU145细胞中的活性鉴定

[目的]比较CMVE-PEG3p、PEG-3启动子在DU145细胞中的启动活性,为前列腺癌靶向性基因治疗提供依据.[方法]用PCR法扩增CMV增强子、PEG-3启动子;在真核表达质粒pShuttle-EGFP基础上分别构建2种启动子调控的、以绿色荧光蛋白为目的基因的真核表达质粒pShuttle-CMVE-PEG3p-EGFP、pShuttle-PEG3p-EGFP.将重组质粒用脂质体分别转染前列腺癌DU145细胞和人正常前列腺上皮细胞RWPE-1,72h后用Imagepro-Plus6.0分析2种启动子在相同时间内启动绿色荧光蛋白的表达水平.[结果]重组质粒在DU145细胞中观察到了绿色荧光,在RWPE-1细胞中无绿色荧光.pShuttle-CMVE-PEG3p-EGFP质粒在DU145细胞中表达强于pShuttle-PEG3p-EGFP.2种质粒在DU145细胞中的荧光强度(IOD)分别为246.22、130.93.[结论]所克隆的CMVE-PEG3p启动子和PEG-3启动子在前列腺癌DU145细胞中均表现出肿瘤特异性,其中CMVE-PEG3p启动子具有更强的启动效应,有望开发成为前列腺癌靶向性基因治疗的工具.     

hTERT启动子的克隆及在MCF7乳腺癌细胞中的特异转录活性

背景与目的：利用肿瘤特异性启动子增强肿瘤细胞中治疗基因的转录选择性是达到基因治疗靶向性的有效途径。人端粒酶催化亚基（hTERT）在大部分肿瘤细胞中呈特异性高表达，有可能成为肿瘤特异性启动子。本文扩增了hTERT基因启动子并分别克隆于报告基因重组质粒pEGFP-1和pGL3-Basic，检测并证实hTERT启动子在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性。方法：采用套式PCR法扩增hTERT启动子，将其分别克隆到含报告基因增强绿色荧光蛋白（EGFP）的重组质粒pEGFP-1和含Luciferase的重组质粒pGL3-Basic，经脂质体分别转染人乳腺正常上皮细胞系HBL100和乳腺癌细胞MCF7，荧光显微镜观察EGFP的表达情况，并测定两种细胞中荧光素酶转录表达差异。结果：与正常细胞HBL100相比，hTERT启动子在MCF7细胞呈现强的绿色荧光表达；荧光素酶活性检测与其一致，hTERT启动子在MCF7乳腺癌细胞的荧光素酶相对活性RLU／U值（33784）约相当于HBL100细胞中（2400）的15倍。结论：hTERT启动子在乳腺癌MCF7细胞中具有很强的特异性，为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定实验基础。     

MADP-1基因对前列腺癌细胞系DU145体外生长的影响

[目的]探讨新基因MADP-1对雄激素非依赖性前列腺癌细胞系DU145增殖的影响,了解其功能.[方法]采用脂质体和绿色荧光蛋白基因标记的质粒载体pIRES-hrGFP-1α,将MADP-1基因导入前列腺癌细胞系DU145中.应用荧光显微镜、流式细胞仪分析和分选术及细胞生长曲线动态观察MADP-1基因对DU145细胞系的影响.[结果]转染细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光.转染MADP-1基因组细胞生长加速,与转染空载体组及对照组相比,有显著差异(P＜0.05).[结论]新基因MADP-1在体外具有促进前列腺癌细胞系DU145增殖的作用.     

PTPRJ通过Src/PI3K/Akt信号通路促进前列腺癌细胞的黏附、迁移和侵袭

目的:探究PTPRJ基因表达对前列腺癌DU145细胞黏附、迁移和侵袭的影响以及可能的调控机制。方法:实时荧光定量PCR、Western blot检测PTPRJ在前列腺肿瘤组织和细胞系中的表达;用携带PTPRJ特异shRNA的重组慢病毒(LV-shPTPRJ)感染沉默PTPRJ表达;MTT检测细胞黏附力,Transwell检测细胞迁移和侵袭;实时荧光定量PCR、Western blot检测信号通路分子mRNA和蛋白表达。结果:与正常前列腺组织和细胞相比,PTPRJ在前列腺肿瘤组织和PC-3、DU145细胞系中表达升高（P＜0.05）;与对照组相比,沉默PTPRJ后前列腺癌DU145细胞黏附、迁移和侵袭能力显著下降（P＜0.01）、信号通路蛋白pY418Src、p-PI3K和p-Akt表达水平均显著降低（P＜0.05）;SC79激活PI3K/Akt可逆转PTPRJ下调对DU145细胞黏附和侵袭的影响;沉默PTPRJ下调裸鼠瘤体组织中pY418Src、p-PI3K和p-Akt表达（P＜0.05）。结论:PTPRJ可能通过激活Src/PI3K/Akt信号通路来促进DU145细胞的黏附、迁移和侵袭,预示PTPRJ可能成为前列腺癌治疗的潜在靶点。     

NLK通过维持NF-κB/P53平衡抑制前列腺炎-癌转化

背景与目的： 前列腺炎症是促进其癌变的一个重要因素,但关键的分子机制不明。Nemo样激酶（Nemo-like kinase,NLK）在前列腺癌组织中的表达水平较良性组织显著降低,并且在前列腺癌细胞中沉默NLK表达可增强核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的转录活性。本研究旨在探讨NLK调控前列腺炎-癌转化的作用及其机制,为应用抗炎新策略预防前列腺癌提供新的分子靶点和理论依据。方法： 采用人前列腺上皮细胞RWPE-1与人急性单核细胞白血病细胞THP-1共培养的方法建立前列腺炎-癌转化细胞模型（RWPE-1/THP-1）。采用MTT实验及软琼脂集落形成实验检测NLK基因沉默或过表达对模型细胞增殖及恶性转化能力的影响。采用双荧光素酶报告基因实验检测NLK基因沉默或过表达对模型细胞NF-κB转录活性的影响。采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测NLK基因沉默或过表达对模型细胞中核受体相关因子1（nuclear receptor-related factor 1,Nurr1）和鼠双微体基因2（murine double minute 2,MDM2）的mRNA表达和蛋白水平的影响。采用Western blot检测NLK基因沉默或过表达对模型细胞P53蛋白表达水平的影响。采用免疫荧光和免疫共沉淀技术分别检测Nurr1蛋白和P53蛋白在RWPE-1细胞中的定位分布及相互作用情况。结果： 与RWPE-1/THP-1组相比,RWPE-1（NLK↑）/THP-1组的细胞增殖及转化能力显著降低,NF-κB转录活性显著减弱,Nurr1和MDM2的mRNA表达和蛋白水平显著下调,P53蛋白表达水平显著上升（P<0.05）;与之相反,RWPE-1（NLK↓）/THP-1组的细胞增殖及转化能力显著升高,NF-κB转录活性显著增强,Nurr1和MDM2的mRNA表达和蛋白水平显著上调,P53蛋白表达水平显著下降（P<0.05）。此外,Nurr1蛋白与P53蛋白在RWPE-1细胞的细胞核中存在共定位及相互作用。结论： NLK抑制前列腺炎-癌转化可能依赖于其对NF-κB/P53平衡的维护。     

Rs10993994对前列腺癌细胞MSMB基因转录的影响

背景与目的：全基因组相关联研究发现了染色体10q11区域的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs10993994与前列腺癌的遗传易感性相关,本研究探讨rs10993994影响前列腺癌发病风险的可能机制,即研究rs10993994对前列腺癌细胞微精液蛋白β(microseminoprotein beta,MSMB)基因转录活性的影响。方法：化学合成MSMB基因的启动子序列,由于位于序列中间的SNP位点rs10993994有2种等位基因(T/C)可能,合成2条启动子MSMB promoter-T和MSMB promoter-C。将2条启动子通过酶切的方法导入荧光素酶报告基因载体(pGL3-basic vectors)中,筛选阳性克隆后,将携带启动子的质粒转染入前列腺癌细胞PC-3和LNCaP中,最后通过荧光检测仪检测重组质粒中启动子的转录活性。结果：成功合成2条启动子序列：MSMB promoter-T和MSMB promoter-C;分别将启动子序列与荧光素酶报告基因载体重组,形成重组质粒pGL3-MSMB promoter-T和pGL3-MSMB promoter-C。在前列腺癌细胞PC-3中,重组质粒MSMB promoter-C组的相对荧光度为2.27±0.39,显著高于重组质粒MSMB promoter-T组(0.57±0.13),差异有统计学意义(P＜0.05);在前列腺癌细胞LNCaP中,重组质粒MSMB promoter-C组的相对荧光度为1.70±0.32,显著高于重组质粒MSMB promoter-T组(0.37±0.09),差异有统计学意义(P＜0.05)。结论：重组质粒pGL3-MSMBpromoter-C的转录活性强于重组质粒pGL3-MSMB promoter-T的转录活性;rs10993994可以影响到MSMB基因启动子的启动转录活性,rs10993994位点上等位基因胞嘧啶(C)较胸腺嘧啶(T)更能促使MSMB基因转录。     

Survivin基因启动子调控的肿瘤特异性表达载体的构建

目的:扩增survivin基因启动子,构建survivin启动子调控的真核表达载体,验证其在肿瘤细胞的特异性表达。方法:以Hep-2细胞基因组DNA为模板,PCR扩增survivin启动子;利用核酸内切酶双酶切sur-vivin启动子基因片段和pShuttle质粒,构建载体pSurp,酶切和测序鉴定;分别双酶切pSurp载体和pEGFP-C1载体,构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,脂质体转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达,Western blot方法验证该基因的蛋白表达。结果:成功扩增survivin基因启动子并构建survivin基因启动子调控的pSurp-EGFP真核表达载体。脂质体法转染Hep-2细胞和血管内皮细胞ECV304,在荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有绿色荧光;Western blot的结果也确证了EGFP蛋白仅在Hep-2细胞表达。结论:Survivin启动子的成功克隆与其真核表达载体的构建,为肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

尼日菌素对前列腺癌DU145细胞Wnt/β-catenin信号传导的影响

目的 研究尼日菌素对前列腺癌DU145细胞的作用及其对Wnt/β-catenin信号传导的影响。方法 体外使用5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的尼日菌素处理前列腺癌DU145细胞,同时以DMSO处理作为对照组。用细胞增殖-毒性检测试剂盒（CCK-8）检测尼日菌素对DU145细胞增殖活力的影响。以Transwell迁移侵袭实验检测药物对细胞的迁移侵袭能力的影响。用Western免疫印迹技术、免疫荧光及TOP/FOP-flash荧光报告试验检测尼日菌素对DU145细胞中β-catenin蛋白的表达及其下游靶基因c-myc及cyclin D1的表达以及对TCF/LEF转录因子活性的影响。结果 尼日菌素对前列腺癌DU145细胞有明显的细胞毒性作用,可以抑制其侵袭和转移;尼日菌素可以降低DU145细胞中β-catenin蛋白的表达,从而阻断Wnt信号的传导,抑制下游转录因子的活性、降低靶基因的表达水平。结论 尼日菌素可显著抑制前列腺癌细胞的侵袭与转移,可能与其抑制Wnt/β-catenin信号传导相关。     

人前列腺癌肿瘤干细胞12-LOX表达的初步研究

目的：研究花生四烯酸12-脂氧化酶（12-LOX）在人前列腺癌肿瘤干细胞中的表达情况,并探讨其意义。方法：采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术和蛋白质印迹法,检测12-LOX在人前列腺癌细胞系DU145细胞和从其中分离出来的Du145侧群细胞中的表达情况;采用免疫荧光4通道激光扫描共聚焦显微镜技术,检测12-LOX在7例前列腺癌组织肿瘤干细胞和10例正常前列腺组织干细胞中的表达情况。结果：在细胞水平,应用RT—PCR技术和蛋白质印迹法分别证实,12-LOX mRNA和12-L0x蛋白在具有肿瘤干细胞特性DU145侧群细胞中的表达水平明显高于对应的母系DU145细胞;在组织水平,应用免疫荧光4通道激光扫描共焦显微镜检测证实,12-LOX蛋白在所有7例前列腺癌组织的肿瘤干细胞中均为阳性表达,而在所有10例正常前列腺组织的前列腺干细胞中均无表达。结论：12-LOX在人前列腺癌的肿瘤干细胞中有特异性的高表达,从而有望成为前列腺癌肿瘤干细胞一个新的、特异性的标志,并进一步有望成为前列腺癌肿瘤干细胞一个新的治疗靶位。     

Survivin基因启动子调控的肿瘤特异性表达载体的构建

目的：扩增survivin基因启动子,构建survivin启动子调控的真核表达载体,验证其在肿瘤细胞的特异性表达。方法：以Hep-2细胞基因组DNA为模板,PCR扩增survivin启动子;利用核酸内切酶双酶切sur-vivin启动子基因片段和pShuttle质粒,构建载体pSurp,酶切和测序鉴定;分别双酶切pSurp载体和pEGFP-C1载体,构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,脂质体转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达,Western blot方法验证该基因的蛋白表达。结果：成功扩增survivin基因启动子并构建survivin基因启动子调控的pSurp-EGFP真核表达载体。脂质体法转染Hep-2细胞和血管内皮细胞ECV304,在荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有绿色荧光;Western blot的结果也确证了EGFP蛋白仅在Hep-2细胞表达。结论：Survivin启动子的成功克隆与其真核表达载体的构建,为肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

EHD2负向调控前列腺癌细胞的增殖与转化能力

  目的  研究EHD2在前列腺癌中的表达以及EHD2表达水平对前列腺癌细胞系增殖与转化能力的影响。  方法  免疫组织化学方法检测EHD2在14例前列腺癌组织及7例前列腺增生组织中的表达。用EHD2干扰表达质粒、过表达质粒和对照载体分别转染293T细胞, 制备慢病毒, 感染DU145细胞, 建立稳定细胞系。用Western blot技术检测EHD2表达情况。采用细胞计数法、二维克隆形成实验、Soft Agar实验分别检测EHD2沉默或过表达对前列腺癌细胞增殖能力、克隆形成能力和转化特性的影响。  结果  免疫组织化学显示EHD2在前列腺癌组织中表达量明显低于前列腺增生组织。EHD2干扰表达后DU145细胞的增殖能力、二维克隆形成能力、三维克隆形成能力均明显增强(P < 0.01);EHD2过表达后DU145细胞的增殖能力和三维克隆形成能力均减弱(P < 0.01和P < 0.05)。  结论  EHD2的表达水平对DU145前列腺癌细胞的增殖与转化特性具有明显的调节作用, EHD2可能是前列腺癌的新抑癌基因。      

lncRNA FLJ26245 通过 miR-200a-3p/PTPRG 轴调控前列腺癌 PC-3 细 胞的增殖与迁移

目的：探讨lncRNA FLJ26245在前列腺癌组织和细胞中的表达及其对PC-3细胞增殖与迁移能力的影响及其分子机 制。方法：选用2017年3月至2019年5月在洛阳中心医院手术切除的52例前列腺癌及相应的癌旁组织标本,以及前列腺细胞系 LNCaP、C4-2B、PC-3、DU-145和正常前列腺上皮细胞RWPE-1,用qPCR法检测前列腺癌组织和细胞中FLJ26245的表达水平。分 别将FLJ26245 mimic和阴性对照质粒（lncR-NC）转染到PC-3细胞中,用MTT法、细胞划痕愈合实验分别检测细胞的增殖和迁移 能力。生物信息学技术预测和双荧光素酶基因报告实验验证FLJ26245与miR-200a-3p、酪氨酸磷酸酶受体G（PTPRG）三者之间 的靶向关系。用qPCR 和 WB 法分别检测 FLJ26245 下游基因及增殖与迁移相关蛋白的表达。结果：FLJ26245 在前列腺癌组 织和细胞中的表达水平分别显著低于癌旁组织（P<0.01）和 RWPE-1细胞（P<0.01或P<0.05）,以PC-3细胞中的表达水平为最低（P<0.01）。FLJ26245过表达可明显抑制PC-3细胞的增殖和迁移能力（P<0.05或P<0.01）。FLJ26245可与miR-200a-3p靶向结 合,miR-200a-3p可与PTPRG靶向结合（均P<0.01）。FLJ26245过表达的PC-3细胞中miR-200a-3p表达水平显著降低（P<0.01）、PTPRG mRNA和蛋白表达水平均明显升高（均P<0.01）,细胞中增殖和迁移相关蛋白cyclin A、CDK2和Twist、N-cadherin均显著 降低（均P<0.01）。结论：FLJ26245在前列腺癌组织及细胞中均低表达,其可能通过miR-200a-3p/PTPRG轴调控前列腺癌PC-3 细胞的增殖与迁移能力。     

前列腺特异性抗原启动子增强子调控重组质粒的构建及鉴定

目的:利用前列腺特异性抗原(pros-tate-specific antigen,PSA)组织特异性表达的特点,克隆出其上游增强子(prostate-specific antigen enhancer,PSAE)和启动子(prostate-specificantigen promoter,PSAP)片断,并对其表达效率和组织特异性表达进行初步研究。方法:从前列腺癌组织提取基因组DNA,并采用PCR方法分别扩增PSA增强子和启动子序列;利用报告基因pEGFP-1,分别构建含不同调控序列的表达载体;脂质体介导基因转染不同细胞并观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况。结果:成功构建质粒pPSAE-EGFP、pPSAP-EGFP和pPSAE-PS-AP-EGFP;转染结果显示,pPSAE-PSAP-EGFP在前列腺癌细胞PC-3中的荧光强度明显高于pPSAP-EGFP,pPSAE-EGFP同样观察到荧光表达,说明PSA增强子能显著提高PSA启动子的转录能力,并具有单独调控基因表达的能力。结论:PSA增强子和启动子的共同调控可以提高基因表达的有效性和细胞特异性,为前列腺癌的临床基因治疗提供实验依据。     

hTERT启动子的克隆及hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的转录活性

目的 克隆hTERT启动子核心序列,研究hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的联合转录活性。 方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增hTERT启动子核心片段;将其分别插入荧光素酶基因报告质粒pGL3-Basic和pGL3-Enhancer中,构建hTERT启动子调控的表达载体pGL3-hTERTp和由hTERT启动子/SV40增强子联合调控的表达载体pGL3-hTERTp-SV40en,将上述重组质粒分别瞬时转染食管癌细胞Eca-109、EC1和人胚肺成纤维细胞MRC-5,用荧光素酶检测试剂盒检测转染细胞中荧光素酶基因的表达水平并以此计算hTERT启动子和hTERT启动子/SV40增强子在各种细胞中的转录活性。结果 克隆出长213 bp的hTETR启动子核心片段,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子的碱基序列完全一致;成功构建真核表达载体pGL3-hTERTp和pGL3-hTERTp-SV40en;hTETR启动子在食管癌细胞Eca-109和EC1中均有转录活性,在MRC-5细胞中无明显转录活性;hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞Eca-109和EC1中的转录活性显著高于hTETR启动子的单独转录活性。结论 hTERT启动子在食管癌细胞中具有靶向性转录活性,SV40增强子能显著增强hTERT启动子在食管癌细胞中的转录活性,有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的转录调控元件。     

雄激素受体调控的lncRNA ARLNC1对前列腺癌细胞增殖、克隆、迁移和细胞周期的影响

目的:探讨雄激素受体(androgen receptor, AR)调控的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)ARLNC1对前列腺癌细胞增殖、克隆、迁移和细胞周期的影响。方法:选取正常前列腺上皮细胞株WPMY-1和前列腺癌细胞株PC3、VCaP、22RV1、DU145和LNCaP为研究对象,qRT-PCR分析lncRNA ARLNC1的表达水平;双氢睾酮(DHT)以时间和浓度依赖的方式刺激LNCaP细胞,分析lncRNA ARLNC1的转录水平;采用数据库预测和双荧光素酶报告基因系统分析雄激素受体与lncRNA ARLNC1的关系;将LNCaP细胞分为sh-NC和sh-lncRNA ARLNC1组,采用CCK-8分析细胞增殖,检测细胞克隆和迁移能力;流式细胞仪分析细胞周期变化,Western blot分析细胞周期蛋白CyclinD1、CDK6、p27的表达水平。结果:与正常前列腺上皮细胞相比,lncRNA ARLNC1在雄激素依赖性前列腺癌细胞株(LNCaP、VCaP、22RV1)中的表达水平明显增加,而在雄激素非依赖性前列腺癌细胞株(PC3、DU14...     

CXCR4和Survivin启动子的克隆及其在乳腺癌细胞系的转录特异性分析

目的:评估CXCR4和Survivin启动子在乳腺癌细胞系中的特异转录活性.方法:采用PCR方法扩增CXCR4和Survivin启动子序列,将其分别克隆到舍有报告基因增强绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒载体pEGFP-1和含有荧光素酶(LUC)的质粒载体pGL3-Basic,经脂质体分别转染乳腺癌细胞系(MCF-7MDA-MB-231和T-47D)和乳腺上皮细胞(HBL-100).荧光显微镜下观察EGFP的表达情况,并测定2个启动子在乳腺癌细胞中的荧光素酶活性.结果:CXCR4和Sur-vivin启动子在3种乳腺癌细胞中均表现特异的转录活性.CXCR4启动子在MDA-MB-231中的活性高于Survivin启动子(P=0.004);而在MCF-7细胞中活性低于Survivin启动子(P=0.006),两者在T-47D细胞中的启动子活性相当,P=0.615.结论:CXCR4和Survivin启动子在乳腺癌细胞中具有强的特异转录活性,且在不同乳腺癌细胞类型表现的转录特异性有一定差异.     

胱硫醚β合成酶在前列腺癌中的异常表达及其对前列腺癌细胞增殖的调控作用

目的:探讨胱硫醚β合成酶(CBS)在前列腺癌中的差异表达情况,及其对前列腺癌细胞增殖的调控作用。方法:利用GEPIA网站分析来源于TCGA和GTEx数据库的492例前列腺癌组织和152例正常组织中CBS mRNA表达情况。利用ULCAN网站分析来源于TCGA数据库的497例前列腺癌组织和52例正常组织中CBS mRNA的表达情况。用RPIM-1640培养基培养前列腺癌细胞系DU145、PC3、LNCaP和C4-2,免疫印迹实验检测CBS蛋白表达情况。shRNA转染DU145细胞,分为对照shRNA组、CBS shRNA#1组或#2组,克隆形成实验检测细胞克隆形成数量,BrdU标记实验检测细胞增殖能力,免疫印迹实验检测AKT、mTOR、S6K蛋白表达情况,以及AKT S473位点、mTOR S2448位点、S6K T421/S424位点的磷酸化水平。将稳定表达对照shRNA、CBS shRNA#1或#2的DU145细胞注射入小鼠皮下,建立小鼠前列腺癌移植瘤模型,观察肿瘤生长情况。结果:数据库分析结果显示,与正常前列腺组织比较,前列腺癌组织中CBS mRNA的表达水平显著上升。CBS蛋白在...     

不同截短型癌基因AEG-1启动子活性分析

目的:分析不同截短型癌基因AEG-1启动子活性,证实与E6/E7表达相关的转录调控因子对AEG-1启动子活性的影响。方法:以宫颈癌HeLa细胞基因组DNA为模版,扩增AEG-1启动子全长序列（-2710/-491）,并应用本实验室改造的启动子活性研究专用绿色荧光蛋白报告载体构建pGL3-basic-EGFP/AEG-1质粒,通过转染HeLa细胞及血管内皮细胞ECV304检测启动子活性。同时,根据AEG-1启动子序列上与E6/E7作用相关的转录调控因子结合位点位置,设计不同截短型AEG-1启动子序列引物,应用pGL3-basic-EGFP载体构建不同截短型AEG-1启动子载体,并分别转染细胞检测启动子活性。结果:AEG-1启动子全长序列pGL3-basic-EGFP/AEG-1载体转染HeLa细胞可见明显绿色荧光蛋白表达,而在血管内皮细胞ECV304中表达为痕量。包含不同转录调控因子C-Myc、SP1、NF-κB、E2F结合位点的不同截短型AEG-1启动子载体在肿瘤细胞中有活性但存在差异。结论:AEG-1启动子为肿瘤特异性启动子,含有与E6/E7表达相关的转录调控因子NF-κB、E2F结合位点的启动子序列为影响AEG-1基因启动子活性的关键区域。     

PC-1基因在肿瘤组织中的表达及其启动子区的克隆和活性分析

背景与目的：PC－1是在骨转移和雄激素非依赖的前列腺癌细胞株C4－2中高表达的新基因。本文拟研究PC－1基因在多种人肿瘤组织和正常组织中的表达水平,并对该基因的启动子区进行克隆及活性分析。方法：以PC－1基因特异性DNA序列为探针与10对肿瘤和正常组织的总RNA进行杂交;以C4－2细胞基因组DNA为模板,PCR扩增PC－1基因翻译起始位点上游DNA序列。PCR产物定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic上,将重组质粒瞬时转染C4－2细胞,荧光素酶定量分析检测启动子活性。结果：多肿瘤组织中PC－1基因的表达水平明显高于相应的正常组织中的表达;翻译起始位点上游340bp的片段没有启动子活性,而ATG前1099bp、1337bp,1579bp,1831bp和4939bp长度的片段都表现出启动子的功能活性。结论：PC－1基因在人前列腺癌以及多种肿瘤组织中被特异激活,表明该基因的功能可能和肿瘤的发生有关;研究的初步结果表明4939bp长度的启动子活性最强,以1831bp和4939bp之间可能含有转录增强子元件。     

miRNA-135在调控前列腺癌细胞增殖中的应用及机制

目的 观察miRNA-135在调控激素非依赖性前列腺癌细胞增殖能力中的作用及其机制.方法 利用微小核糖核酸(miRNA)基因芯片检测激素非依赖性前列腺癌和激素依赖性前列腺癌组织中miRNA-135的表达差异.经过体外转染miRNA-135后对DU145和PC3细胞进行MTT检测,了解细胞的增殖情况.利用miRNA-135靶基因预测软件miRwalk和miRanda预测,初筛miRNA-135调控的基因和相关通路.结果 miRNA基因芯片结果显示,激素依赖性前列腺癌组织中miRNA-135的表达量高于激素非依赖性前列腺癌组织(P﹤0.05);miR-NA-135可以抑制DU145和PC3细胞的生长,尤其在第48 h和第72 h以后(P﹤0.05);转染miRNA-135后,前列腺癌细胞株DU145和PC3中STAT6的表达水平较转染NC的细胞株明显下调.结论 miRNA-135能够抑制激素非依赖性前列腺细胞DU145和PC3的增殖能力,有望成为前列腺癌治疗的新靶标.