正常人T淋巴细胞cDNA文库中一未知DNA片段的克隆与分析

本研究设计并合成了一对引物。从正常人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库，采用聚合酶链工反应，经α－互补颜色筛选和ＰＣＲ方法筛选，获得一小的ＤＮＡ征段。Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法对之进行完整序列ＤＮＡ序列分析，为一２０７ｂｐ片段，经国际联网终端检索，以进行检索的１９９４年６月１９日为截止日期与国内外所分布的核苷酸序列进行同源性比较，未发现与之完全一致的序列。     

粉尘螨Ⅰ类变应原（DerfⅠ）的cDNA克隆及序列分析

目的 获得我国广州地区粉尘螨I类变应原（DerfI)cDNA片段,为构建DNA疫苗或表达重组蛋白打下基础。方法 挑取经选择鉴定的活粉尘螨,提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增DerfI片断,进行克隆、测序和分析。结果 获得长度为632个碱基对的核苷酸片断,序列分析结果和Genebank上去除内含子后的基因序列（emb|X65196.1|]同源性为99%,其中有6个碱基不同,推导的编码氨基酸序列同源性为100%。结论 我们首次获得广州地区的DerfI的cDNA克隆,该克隆cDNA序列与Genebank上已公布的DerfI序列高度同源。     

抗人C1q杂交瘤细胞中一未知DNA片段的克隆与分析

使用一对ＩｇＶＨ通用引物，应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从分泌抗人Ｃ１ｑＭｃＡｂ的Ｂ６杂交瘤细胞株总ＲＮＡ扩增出－３８７ｂｐ的ＤＮＡ片段。通过计算机网络系统对其进行序列的类似性检索，未发现与之一致或显著相似的序列。     

人类肝脏cDNA文库的构建及hHGF基因的筛选、克隆与表达

目的构建人类肝脏的cDNA文库，从中筛选hHGF基因并进行克隆与表达。方法从人类胎儿肝脏中快速分离提取出mRNA；将已提取出的mRNA构建成cDNA文库；从中筛选出hHGF（hepatocyte growth factor）基因后，进行克隆并测序确定；构建表达质粒pBV221-hHGF后转化大肠杆菌BL21（DE3α），以异丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）诱导，收集菌体后提取蛋白样品并对其进行SDS-PAGE电泳及蛋白免疫印迹检测。结果成功地构建了人类肝脏的cDNA文库；经筛选得到约2200bp的hHGF基因；对其进行测序确认；成功地构建该基因的表达型质粒，并对表达蛋白进行蛋白免疫印迹检测，检测出其表达产生的蛋白质相对分子量在100000左右。结论人类肝脏cDNA文库成功地构建后可用于筛选获取完整的cDNA基因，从中筛选、克隆hHGF基因，并测序确认，进行表达蛋白质检测，结果正确，以上工作为进一步深入地进行与人类肝脏cDNA文库及hHGF相关的实验研究奠定了一定的基础。     

中国人MBL cDNA的克隆与序列分析

从中国汉族人胎肝组织提取ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ方法获得了编码含号顺序的全长甘露聚糖结合凝集素肽链的ｃＤＮＡ片段,将其与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接,转化大肠杆菌ＴＧ１,     

中国庚型肝炎病毒河南株非结构基因（NS）3区cDNA的克隆 …

目的 为了研究中国庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）非结构（ＮＳ３）区基因结构特征。方法 利用逆转录－半巢式－聚合酶链反应从河南１份ＨＧＶ ＲＮＡ阳性血清获得覆盖ＨＢＶ ＮＳ３全长ｃＤＮＡ的４个片段，并克隆到ｐｃＤＮＡⅡ载体中，采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法测定全部ｃＤＮＡ序列。结果 发现克隆到的包括ＨＢＶ ＮＳ３区在内的ｃＤＮＡ序列和度为２１３７个核苷酸，编码７１１个氨基酸。与国内外已测定的５株全序列的相     

斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段的克隆和序列分析

目的　克隆斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段 ,并对其进行测序和序列分析。方法　利用简并引物 ,进行RT PCR ,扩增斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段。TA克隆装入pUCm T载体 ,进行鉴定、测序 ;利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列 ,并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析。结果　RT PCR扩增出了一约5 0 0bp的cDNA片段 ,对阳性克隆测序后获得其核酸序列 ,长 4 95bp。将推导的氨基酸序列作同源性分析显示 ,该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着较高的同源性 ,组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守。结论　克隆获得了斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段 ,该片段包含了与半胱氨酸蛋白酶活性和空间结构相关的重要基因位点。     

TA克隆及双链DNA：测序：介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法

将人酸性纤维母细胞生长因子’（ａＦＧＦ’）ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物以ＴＡ连接方式克隆入ｐＣＲ￣（ＴＭ）ＩＩ质粒，然后采用Ｔ７和Ｓｐ６启动子特异性引物对克隆的片段以双脱氧未端终止法进行双链ＤＮＡ测序。结果表明这项技术是一种快捷而可靠的克隆及分析ＰＣＲ产物的方法     

鸡B淋巴细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建与鉴定

目的:构建鸡B淋巴细胞cDNAT7噬菌体表达文库并对文库质量进行鉴定。方法:利用oligo(dT)-纤维素亲和层析从SPF雏鸡法氏囊细胞制备mRNA,合成的双链cDNA定向克隆到T7EcoR I/HindIII载体臂,包装并构建cDNA表达文库。对文库进行滴度测定和重组子测定。扩增文库并进行PCR鉴定插入序列的长度及分布。结果:文库初始滴度为5×107pfu/mL,扩增后滴度达到1.88×1010pfu/mL。插入片段平均长度1440bp,主要分布在750～2000bp之间。结论:构建的鸡B淋巴细胞cDNAT7噬菌体表达文库具有很高的质量,为进一步研究鸡B细胞发育以及传染性法氏囊病毒(IBDV)的分子致病机制奠定了实验基础。     

7型腺病毒疫苗株DNA左侧17.5 mu片段克隆及4.8 mu片段核苷酸序列分析

目的获得７型腺病毒疫苗株ＤＮＡ左侧０～１７５ｍｕ片段克隆,分析０～４８ｍｕ片段（末端倒置重复序列、包装信号位点和Ｅｌａ区）核苷酸序列。方法从Ａｄ７疫苗株感染的Ａ５４９细胞提取Ａｄ７ＤＮＡ,将其０３～１７５ｍｕ片段克隆到质粒ｐＡｄ７Ｔ,并用自动和银染方法测序。结果获得了Ａｄ７疫苗株左侧１７５ｍｕ片段克隆,测定了左侧１７３７ｂｐ核苷酸序列,其中Ｅｌａ区所编码的６３００、２４０００、２８０００等３个蛋白的ＤＮＡ序列,与Ｇｏｍｅｎ株的同源性分别为９８９％、９７３％和９７５％,推导编码氨基酸的同源性分别为９６６％、９６５％和９６９％。这３个蛋白与Ｇｒｉｄｅｒ株的同源性分别为１００％、９９７％、和９９７％;推导编码氨基酸的同源性分别为１００％、９９１％和９９２％。结论Ａｄ７疫苗株左侧１７３８ｂｐ核苷酸与Ａｄ７Ｇｏｍｅｎ株和Ｇｒｉｄｅｒ株相应片段,具有高度的同源性。     

一种与人T细胞分化有关的疏水蛋白HP的cDNA克隆及序列分析

克隆了表达在人Ｔ细胞中晚期的ｃＤＮＡ。此ｄＤＮＡ编码一个疏水蛋白（ＨＰ）。ＨＰ有四个由亲水片段分离的跨膜区，其构型与细胞膜上构成孔和管道的膜蛋白相似，推测它可能扮演着运输水溶性分子和离子跨过脂质双层的作用。ＨＰ的ｍＲＮＡ存在于能表达Ｔ细胞受体和ＣＤ２分子的一组Ｔ细胞系中。提示：ＨＰ可能在Ｔ细胞受体或ＣＤ２分子活化过程中参与了跨膜信号传递。     

抗LPS mAb Fab片段cDNA的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的 构建抗LPS单克隆抗体Fab段的真核表达载体,并在CHO细胞中表达。方法 以逆转录PCR方法扩增抗LPU mAb重链Fd和轻链cDNA,分别克隆入载体pGEM-Teasy。经测序分析后,再分别亚克隆入载体pcDNA3,构建成重组载体pcDNA3-Fd和pcDNA3-LC,并以PCR方法扩增pcDNA3-LC中包括CMV启动子、轻链序列和BGH Poly(A)在内的轻链表达序列。经适当的限制性内切酶酶切后,插入到质粒pcDNA3－Fd中Fd表达序列的前部,构建成表达载体pcDNA3-Fab,以脂质体包裹转染CHO细胞。经G418筛选,用ELISA、免疫荧光和Western blot鉴定阳性克隆。结果 用ELISA和免疫荧光法,筛选出4株高表达Fab的细胞株。Western blot显示,表达产物的Mr为50000。同时,ELISA结果显示,该Fab具有良好的结合LP5的活性。结论 成功地在CHO细胞中表达抗LPS mAb的Fab段,为进一步鉴定其抗LPS的作用,使之成为诊断和治疗革兰氏阴性细菌感染的工具奠定了基础。     

TLMV5＇非编码区基因的克隆与序列分析

目的　调查TTV阴性的非甲～庚型肝炎患者中TTV～like mini virus(TLMV)感染情况,对TLMV5＇非编码区(5＇NCR)部分基因进行分子克隆与序列分析。方法　采用巢式PCR技术检测53例T T V阴性的非甲～庚肝炎患者血清TLMV DNA,对PCR产物进行克隆、测序和分析。结果　53例病例中TLMV DNA阳性37例(69.8％),对其中8株TLMV基因克隆测序,并与Takahashi报道的TLMV序列(GenBank Accession No ab 026930、ab026931)比较,其核苷酸序列同源性在64％～83％之间。结论　在T TV阴性的非甲～庚肝炎患者中存在TLMV感染。TLMV5＇NCR基因变异性较大。TLMV的致病性及其与非甲～庚肝炎的关系尚有待进一步研究。     

广州管圆线虫幼虫cDNA文库的构建及其表达模式与成虫表达模式的EST分析

从感染广州管圆线虫3周的大鼠脑部挑取幼虫,提取其总RNA ,运用“SMARTcDNA文库构建试剂盒”构建其cDNA文库。分别将成虫和幼虫cDNA文库中的噬菌体克隆转化成噬菌粒,用5′端测序引物进行测序。利用BLAST程序对获取的EST从核苷酸和氨基酸水平进行同源性搜索。结果显示:所建文库的初始滴度为2 19×10 .6 pfu mL ,经1次扩增后的滴度为1. 0×10 1 0 pfu mL ,插入子的平均长度为1. 2kb ,重组率为97 .3%。从成虫的cDNA文库中得到6 4个EST ,其中有意义的EST有5 4个,占82 . 8% ;无意义的EST有10个,占17. 2 %。6 4个成虫EST序列中,rRNA基因4 9个,占总EST数的76 6 %。从幼虫的cDNA文库中共得到10 6个EST ,其中有意义的EST有91个,占85 . 8% ;无意义的EST有15个,占14 . 2 %。10 6个幼虫EST序列中rRNA基因78个,占总EST数的73. 6 %。本研究首次成功构建了广州管圆线虫幼虫的cDNA文库,EST分析显示广州管圆线虫幼虫和成虫基因表达谱中rRNA基因均占大多数。     

中国湖南株丁型肝炎病毒cDNA（443－870）片段的克隆和序列分析

取１例湖南丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）ＲＮＡ阳性血清，经强变性剂法抽提ＨＤＶＲＮＡ，逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增，扩增的ＨＤＶＣＤＮＡ片段重组到ｐＵＣ１８质粒中，获得了中国湖南株ＨＤＶＣＤＮＡ（４３３－８７０）片段克隆，ＤＮＡ测序结果显示，该片段（４３８ｈｐ长，包括一端ＰＣＲ引物２５ｈｐ）与已知的美国、意大利、法国、诺鲁和中国台湾５株ＨＤＶｃＤＮＡ相同片段比较，同源性分别为９１．３％，９４．５％，９１．３％，８４．５％和８９．３％，其中与ＨＤＶＲＮＡ复制密切相关的第一个高度保守区与美国株、意大利株和法国株完全同源。     

丙型肝炎病毒E2／NS1区基因cDNA的克隆及序列分析

从北京地区１份丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者血清中提取ＲＮＡ，经逆转录和套式聚合酶链反应扩增ＨＣＶＥ２／ＮＳ１区基因约９３０ｂｐ，将其插入至ｐＧＥＭ－Ｔ质粒载体中，利用双脱氧链末端终止法测出该基因５’端４３１ｂｐ的核苷酸序列，将此序列与其它９个ＨＣＶ分离株的相应序列进行比较分析，结果表明，此序列与ＨＣＶⅡ型序列同源性较高，核苷酸水平同源性在８０％以上。由其编码的ＨＣＶ外膜蛋白Ｎ端存在两个高变部位（ＨＶＲ），在ＨＶＲ内、外具有几个保守氨基酸残基和氨基酸区域，它们与外膜蛋白空间构型的维持有关。     

TLMV5′非编码区基因的克隆与序列分析

目的　调查TTV阴性的非甲～庚型肝炎患者中TTV -likeminivirus(TLMV)感染情况 ,对TLMV5′非编码区 (5′NCR)部分基因进行分子克隆与序列分析。方法　采用巢式PCR技术检测5 3例TTV阴性的非甲～庚肝炎患者血清TLMVDNA ,对PCR产物进行克隆、测序和分析。结果　 5 3例病例中TLMVDNA阳性 37例 (6 9 8% ) ,对其中 8株TLMV基因克隆测序 ,并与Takahashi报道的TLMV序列 (GenBankAccessionNo ab 0 2 6 930、ab0 2 6 931)比较 ,其核苷酸序列同源性在 6 4%～ 83%之间。结论　在TTV阴性的非甲～庚肝炎患者中存在TLMV感染。TLMV5′NCR基因变异性较大。TLMV的致病性及其与非甲～庚肝炎的关系尚有待进一步研究     

我国不同疫区杜氏利什曼原虫ITS片段的克隆及序列分析

为测定我国荒漠、山丘、平原疫区杜氏利什曼原虫分离株ITS序列并分析其序列差异,首先提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,然后将扩增出ITS片段克隆入PMD18-Tvector上,再用双脱氧链末端终止法测序。结果用PCR成功扩增出约1000bp的ITS片段,测序结果表明:本文报道的荒漠、山丘、平原疫区的3株杜氏利什曼原虫(L.dXJ771,L.dSC10,L.dSD2)的ITS序列大小分别为:1086、1027、1028bp。序列分析表明:我国杜氏利什曼原虫荒漠分离株(L.dXJ771)的ITS序列与平原分离株(L.dSD2)及山丘分离株(L.dSC10)的ITS序列有明显差异,平原分离株(L.dSD2)与山丘分离株(L.dSC10)的ITS序列也存在较明显差异,荒漠分离株(L.dXJ771)与山丘分离株(L.dSC10)的ITS序列差异略小于与平原分离株(L.dSD2)的ITS序列差异。