肿瘤特异性T细胞受体基因转染诱导记忆性T细胞体外分化的研究

目的 探讨肝癌特异性T细胞受体基因转染对记忆性T细胞体外诱导分化的影响.方法 以肝癌特异性T细胞受体V β7.1转染PBMC,流式细胞术检测目的基因表达.肝癌细胞BEL-7402刺激诱导记忆性T细胞;以流式细胞术检测记忆性T细胞标志性表面分子表达验证记忆性T细胞表型及分化亚群:以Annexin V-PI双染检测肿瘤细胞的凋亡,ELISA检测细胞因子IFN-γ分泌探讨记忆性T细胞免疫功能.结果 TCRVβ7.1基因成功转染到T细胞并得到有效表达.与PBMC对照组相比.TCRVβ37.1转染组CD45RO表达显著上升.以CD45RA及CCR7表达分析记忆性T细胞亚群显示其表型主要为效应型记忆性T细胞.分化后的记忆性T细胞诱导肿瘤细胞凋亡率及IFN-γ分泌显著上升.结论 肿瘤特异性TCR基因转染可促进以效应型记忆性T细胞(TEM)为主的记忆性T细胞分化.TEM将通过诱导凋亡与分泌细胞因子作用发挥其免疫功能.     

蜂毒素对人膀胱癌T24细胞体外增殖的抑制作用

目的 探讨蜂毒素对人膀胱癌T24细胞体外增殖抑制作用及机制,为蜂毒素用于膀胱癌的临床应用提供依据.方法 体外培养T24细胞,分别用0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0 μg/mL蜂毒素处理,采用四甲基偶氮(MTT)法检测细胞增殖的抑制率;倒置显微镜观察细胞形态;TUNEL染色检测凋亡率和RT-PCR检测Bax和Bcl-2的mRNA的表达.结果 蜂毒素处理后,T24细胞生长明显受到抑制,呈剂量依赖性;细胞出现典型的凋亡形态学改变;凋亡率随剂量升高以及Bax的表达升高而Bcl-2表达下降.结论 蜂毒素在体外能抑制人膀胱癌T24细胞的增殖,机制可能为诱导其细胞凋亡.     

人4-1BBL转基因细胞株的构建及其生物学功能的研究

目的为探讨人4-1BBL分子的生物学功能，构建人4-1BBI。转基因细胞株。方法利用RT-PCR方法克隆人4-1BBI。全长基因，继而重组入逆转录病毒表达载体pEGZ．Term。重组逆转录病毒载体pEGZ．Term／4-1BBI。与两个辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T，用含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞，筛选获得Zeocin抗性的转基因细胞。^3H-TdR掺入实验分析4-1BBL转基因细胞对T细胞增殖的影响，ELISA法分析细胞因子的分泌。结果流式细胞仪表型分析结果表明，L929／4．1BBL转基因细胞稳定表达人4-1BBL分子。体外实验表明，L929／4-1BBL细胞能够促进T细胞活化、增殖及IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌。结论该研究成功克隆了人4-1BBL基因，构建了能稳定表达4-1BBL分子的转基因细胞株L929／4-1BBL，该株转基因细胞能提供有效的4-1BBL共刺激信号，促进T细胞活化、增殖及细胞因子的分泌。     

分泌抗活化小鼠T细胞抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用Con A活化的小鼠脾脏细胞免疫同品系动物(BALB/c鼠),取免疫鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,选择了一株有分泌抗活化小鼠T细胞抗原抗体的杂交瘤细胞,经有限稀释法连续4次克隆化。采用ELISA法分析,初步证实该杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体(McAb)与Con A 活化的小鼠脾细胞的结合反应明显高于与未经活化的其他细胞(胸腺细胞、肠系膜淋巴结细胞、脾细胞)的反应。用琼脂双扩散法证明该MeAb属于小鼠IgG类。     

人B7-H4基因转染细胞株的构建及其对T细胞的作用

目的克隆人B7-H4基因,构建人B7-H4基因转染细胞株并初步研究其对T细胞的作用。方法通过RT-PCR的方法获得人B7-H4分子的基因,将目的片段双酶切(EcoRⅠ和BamHⅠ)后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并进行鉴定;脂质体转染法将重组载体导入L929细胞,经G418加压筛选并通过流式细胞术和RT-PCR检测表达载体是否转入L929细胞中,通过检测活化T细胞上CD25,CD69的表达及T细胞增殖实验对B7-H4转基因细胞的生物学功能进行初步研究。结果从外周血活化单核细胞中扩增出目的基因,构建重组表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并将其转染至L929细胞,构建了一株稳定表达人B7-H4分子的基因转染细胞株,对其生物学功能的研究显示B7-H4分子可以下调活化T细胞上CD25,CD69的表达,并且对T细胞的活化增殖起到抑制作用(P<0.05)。结论成功构建了稳定表达B7-H4分子的基因转染细胞株,为进一步研制B7-H4分子的单克隆抗体提供了有效的免疫原。     

分泌抗人早期T细胞单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步鉴定

以胎儿胸腺细胞免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，用Ｂ淋巴细胞杂交瘤技术产生了两种单克隆抗体，分别命名为ＳＭＵ１３、ＳＭＵ１４。初步鉴定的结果表明，１）ＳＭＵ１３，ＳＭＵ１４是抗早期Ｔ淋巴细胞的单克隆抗体，但与浆细胞也发生反应；（２）两株单抗的特性，反应谱与ＣＤ３８抗原相似；（３）ＳＭＵ１３，ＳＭＵ１４在白血病免疫学分型中可以明确判断白血病细胞的来源，具有结合补体的能力，在急性Ｔ淋巴细胞白血病的治疗中可发挥     

体外高效扩增人外周血调节性T细胞技术的建立

目的：建立一种调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）体外高效扩增技术。方法：流式细胞仪分选健康人外周血CD4+CD25+CD127low T细胞,CD3/CD28磁珠刺激联合高浓度白介素?2（interleukin 2,IL?2）培养14 d。通过细胞计数评估Tregs体外扩增能力,采用流式细胞仪鉴定扩增Tregs的表型,采用混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLR）实验检测Tregs的抑制功能。结果：CD4+CD25+CD127low T细胞培养14 d后增殖（755.5 ± 213.5）倍。流式细胞鉴定扩增后的细胞：CD4分子表达为（98.3 ± 1.04）%,CD19分子表达为（0.039 ± 0.021）%,CD8分子表达为（0.443 ± 0.239）%,CD25分子表达为（97.6 ± 1.35）%。FOXP3分子表达为（87.7 ± 5.5）%,Helios分子表达为（73.3 ± 2.9）%。MLR实验显示：Tregs以不同比例与外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）共培养,当Tregs∶PBMC为1∶1时,PBMC增殖抑制率最高,为（84.39 ± 1.98）%。结论：成功建立一种体外高效扩增Tregs技术。扩增后细胞保留原有的细胞表型,并具备免疫抑制功能,为临床运用Tregs治疗自身免疫性疾病、抑制移植排斥反应提供了广阔的应用前景。     

熊果酸对活化T细胞功能的影响

目的 研究熊果酸在体外对活化的人T细胞功能的影响,探讨其作为免疫调节药物开发的可能性和提供相关实验数据.方法 无菌采集和分离正常人外周血淋巴细胞,以不同浓度的熊果酸和PHA/PMA刺激T细胞,用MTT法检测细胞的增殖反应,ELISA法检测细胞因子IFN-γ、IL-2、GM-CSF、IL-4的峰值浓度.结果 熊果酸对淋巴细胞的活化和增殖无显著影响(P＞0.05);熊果酸抑制IFN-γ、IL-2、GM-CSF的分泌,并呈剂量依赖性(P＜0.05),而对IL-4的分泌影响较小,无统计学意义(P＞0.05).结论 熊果酸抑制活化的T细胞分泌Th1型细胞因子,抑制T细胞的功能,熊果酸有可能作为治疗某些自身免疫性疾病天然药物成分.     

GL50分子在单核细胞来源树突状细胞上的表达及其逆向信号对树突状细胞体外分化成熟的促进作用

目的 分析GL50在不同分化时期单核细胞来源树突状细胞（Mo-DCs）上的表达,探讨GL50信号对Mo-DCs的生物学作用。方法 用Ficoll密度离心及贴壁法获得外周血单核细胞,经GM-CSF＋IL-4常规方法诱导,并分别加入丝裂霉素处理的mock-L929和ICOS-L929细胞,6 d时,加入或不加入TNF-α培养3 d后收集细胞;另外,在上述ICOS-L929细胞处理组的单核细胞中加入不同浓度的GL50单克隆抗体11C4或小鼠同型IgG,加入或不加入TNF-α,继续培养3 d后,收集细胞,免疫荧光标记和流式细胞术分析Mo-DCs表型（GL50、CD80、CD83、CD86）、摄取FITC-Dextran抗原的能力;混合淋巴细胞反应检测Mo-DCs对T细胞的作用;ELISA方法检测对分泌细胞因子IL-2I、L-10的影响。结果 GL50分子在不成熟Mo-DCs上高表达,而随着Mo-DCs的成熟呈下调性表达;GL50单克隆抗体11C4能够有效地促进Mo-DCs的成熟,上调Mo-DCs表面分子（CD86、CD80、CD83、HLA-DR）的表达,降低Mo-DCs摄取FITC-Dextran的能力,同时能有效地促进细胞因子IL-10的分泌,而对IL-2的分泌没有显著影响。结论 GL50分子介导的逆向信号参与了Mo-DCs分化成熟的调节,GL50/ICOS是参与DC/T细胞相互作用的主要分子。     

Effect and Mechanism of Epidermal Growth Factor on Proliferation of GL15 Gliomas Cell Line

The effects of epidermal growth factor (EGF) on proliferation of G15 glioma cells and the possible mechanisms were investigated. GFAP and EGFR expression was detected by immunohisto-chemical method. After the cells were treated with EGF at different concentrations, cell count method was used to determine the proliferation of glioma cells, cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry (FCM), and laser scan confocal microscope (LSCM) was used to measure the cyto-plasmic free calcium. The results showed that GFAP was diffusedly expressed in GL15 cells and EGFR was over-expressed. EGF at doses of≤1 ng/mL could significantly stimulate cell proliferation, cells in phase G0/G1 decreased, and those in phase S increased. EGF at doses of 10 and 100ng/ml could inhibit the cell proliferation significantly, and the apoptosis ratio in high dose of EGF group was higher than in control group. EGF could significantly induce a quick rise of intracellular free calcium, but the peak value of intracellular free calcium activated by high dose of EGF was higher than by low dose of EGF. It was suggested that EGF had a dual effect on gliomas: low dose of EGF could stimulate the cell proliferation of gliomas, but high dose of EGF could induce the cell apoptosis and inhibit the proliferation of gliomas, which might be contributed to the difference of intracellular free calcium.     

人PD-L1基因转染细胞株的构建及其对活化的Jurkat细胞增殖和凋亡的影响

目的:构建稳定表达人PD-L1分子的基因转染细胞株,观察其对活化的Jurkat细胞增殖和凋亡的影响。方法:将编码人PD-L1分子的全长c DNA重组入反转录病毒表达载体p EGZ-Term-R,将重组载体p EGZ-Term-R/PD-L1和辅助病毒载体用脂质体法共转染293T细胞,包装具有感染能力的完整病毒;收集含有完整重组反转录病毒的293T细胞培养上清,感染L929细胞,筛选并获得G418抗性的基因转染细胞。采用流式细胞术检测表达PDL1的基因转染细胞,命名为L929/PD-L1。采用PHA活化T细胞系来源的细胞株Jurkat,并将其与丝裂霉素预处理的L929/PD-L1细胞共培养,用细胞计数法观察L929/PD-L1细胞株对活化的Jurkat细胞增殖能力的影响,并检测其凋亡情况。结果:成功获得了稳定表达人PD-L1基因的转染细胞株L929/PD-L1。PHA可诱导Jurkat细胞活化并表达PD-1分子;L929/PD-L1与PHA刺激后的Jurkat细胞共培养,可抑制Jurkat细胞增殖,促进其凋亡。结论:成功构建了稳定表达人PD-L1的细胞株,PD-L1分子抑制活化的Jurkat细胞增殖,促进其凋亡。     

HIF-1α慢病毒干扰载体构建及GL261小鼠胶质瘤稳定沉默细胞系的建立

目的 研究短发夹状RNA（shRNA）干扰慢病毒表达载体对小鼠胶质瘤GL261细胞系中乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因的沉默效应。方法 构建针对小鼠胶质瘤GL261细胞HIF-1α mRNA的不同干扰靶点的4个shRNA表达载体,筛选出HIF-1α基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA,构建pLenti6.3-shRNA3慢病毒载体感染靶细胞GL261,获得稳定沉默HIF-1α细胞株,利用实时定量PCR和Western blot方法检测稳定细胞株HIF-1α的沉默效应。结果 成功构建了具有HIF-1α沉默效应的慢病毒干扰载体,通过倍比稀释测定干涉病毒滴度为1.15×108TU/mL。实时定量PCR和Western blot实验均证实慢病毒转染后,GL261细胞株中HIF-1α表达水平明显降低。结论 针对HIF-1α基因不同位点的不同shRNA具有干扰效率的差异。特异性的shRNA可稳定地介导HIF-1α基因沉默。     

转染血红素氧化酶-1基因大鼠肝细胞系BRL体外抗凋亡作用

目的:探讨血红素氧化酶-1(heme oxygenase,HO-1)基因转染对大鼠肝细胞系BRL的抗凋亡作用.方法:体外培养的BRL细胞转染HO-1基因后(对照组采用转染空载体pcDNA3的BRL细胞),应用RT-PCR检测肝细胞系BRL中HO-1基因的表达.用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激细胞,采用流式细胞仪(FACS)进行细胞计数,TUNEL染色等方法检测细胞的凋亡情况.结果:转染的肝细胞系BRL中均有HO-1 mRNA表达.转染HO-1的BRL细胞经TNF-α诱导凋亡后,细胞凋亡率(55.42%±3.12%)明显低于同等刺激下转染pcDNA3的BRL细胞(81.29%±3.08%)(P＜0.05).结论:BRL肝细胞系中HO-1表现出较强的抗凋亡能力,为以细胞凋亡为主要病理表现的肝脏缺血再灌注损伤的临床治疗提供了新思路.     

人肺癌细胞γ-干扰素基因的转染及特性分析

目的:建立转基因A549细胞株,从特性上进行分析,探讨其作为抗肿瘤瘤苗的可能性.方法:将pLXSN质粒与人IFN-γ基因体外重组,转染入人肺腺癌细胞株A549中,经筛选获得稳定表达γ-干扰素的A549-IFN-γ细胞株,对其生长特性、细胞表面MHC分子表达变化、IFN-γ的分泌量及致瘤性等方面进行了探讨.结果:转基因细胞株与原细胞株相比较,生长状态没有明显的变化,转基因细胞株可稳定表达并向细胞外分泌γ-干扰素;而且其细胞表面MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表达明显增加,提示其免疫原性增强;裸鼠实验表明其致瘤性下降.结论:该转基因细胞株有可能成为治疗肺癌的转基因瘤苗.     

IDO基因转染小鼠树突状细胞体外诱导Treg细胞增殖的研究

目的调节性T细胞(Treg)在肿瘤局部免疫耐受中发挥了重要作用,但其产生机制尚不清楚。本实验通过将吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)基因转染小鼠树突状细胞(DC),体外研究对Treg细胞的诱导增殖作用,为肺癌免疫耐受产生机制研究提供新的依据。方法采用慢病毒转染技术,将含人全长IDO基因转染到小鼠DC细胞,G418筛选获得IDO-DC细胞,同时设置空白对照组(DC细胞)及空质粒转染组(EGFP-DC细胞),将3种细胞分别与小鼠T淋巴细胞混合培养,利用流式细胞技术分析3种细胞对Treg细胞的诱导增殖作用。结果 IDO基因成功转染到小鼠DC细胞,与小鼠T淋巴细胞共培养后,Treg细胞增殖明显,和EGFP-DC细胞(7.5%vs 3.6%,P<0.05)及DC细胞(7.5%vs 3.1%,P<0.05)相比差异显著。结论 IDO基因转染小鼠DC细胞在体外能明显增强Treg细胞的增殖,为肺癌局部免疫耐受机制研究提供了新的实验依据。     

1.1倍全长HBV基因组克隆转染细胞系的建立

目的构建pneo-CH9/3091真核表达质粒,并建立其稳定表达的HepG2细胞系。方法质粒pCH9/3091包含HBV1.1倍体和CMV启动子,将PCR扩增出的带有新霉素(neo)抗性的基因片段插入pCH9/3091构建成重组质粒pneo-CH9/3091。重组质粒经酶切,测序验证正确后,通过脂质体介导转入人肝癌细胞HepG2。G418筛选后,利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测所得单克隆细胞培养上清液的HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg),PCR检测细胞上清液的病毒颗粒,Western blot检测细胞内HBV核心蛋白(HBcAg)的表达,以及Southern blot检测细胞内核心颗粒HBV DNA的复制情况。结果有3株细胞系培养上清HBsAg和HBeAg检测呈现阳性,且HBV C区片段可通过PCR扩增出来,West-ern bot结果提示只有细胞株HepG2-H7可以表达HBV核心蛋白。Southern blot结果说明此细胞株基因组中有HBV基因组的稳定整合,并且能在细胞内检测出HBV DNA复制中间体。结论成功构建1株HBV稳定整合细胞株HepG2-H7,能持续产生HBV病毒颗粒。     

Effects of Gene Tranfection with CH50 Polypeptide on the Invasion Ability of Bladder Cancer Cell Line BIU-87

Fibronectin(FN) ,a glycoprotein,possesses mul-tiple cell bioactivities such as influencing the cellularmorphology, controlling cellular migration,inducingcellular differentiation and affecting i mmune cell func-tions etc ,whichis closelyrelated withthe carcinogene-sis ,invasion and metastasis[1].CH50 polypeptide is composed of Cell I andHep II bifunctional-domain of human FN, main-tains the function of the original structure and doesnot formnovel function because of deletion of frag-ments a…