骨髓间充质干细胞对兔肝脏缺血再灌注损伤定向促修复作用

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对家兔肝脏缺血再灌注损伤的修复作用及其机制。方法①取健康4周龄新西兰大白兔1只,取其BMSCs悬液,并培养扩增至第三代,部分细胞用流式细胞仪分析BMSCs表面CD29、CD44、CD45抗原的表达,余细胞用于移植。②取健康8～12周龄新西兰大白兔32只随机分为缺血再灌注组、缺血再灌注加BMSCs悬液组、缺血再灌注预处理组、假手术组。缺血再灌注组经兔上腹部正中切口,暴露肝门,用无损伤动脉夹钳闭肝门,完全阻断肝血流30 min后除去动脉夹实施再灌注,再灌注30 min。BMSCs组缺血再灌注后颈内静脉缓缓注入1×106/ml BMSC悬液0.5 ml,余同缺血再灌注组。再灌注预处理组,阻断肝门使肝脏缺血5 min,然后开放血流5 min,反复3次,余同缺血再灌注组。假手术组只手术而不用动脉夹钳闭肝门。手术完毕,关腹,饲养1 w后处死,颈内静脉取血3～4 ml,放置10 min,3 000 r/min离心取上清液,置于-20℃冰箱待检。取肝组织。将修整好的肝组织小块固定包埋切片,制备防脱切片,TUNEL法检测肝细胞凋亡情况。结果①分离培养的BMSCs增殖旺盛,纯度较高,且均质性和稳定性好。②缺血再灌注、BMSCs、再灌注预处理组血清AST、LDH及AI较假手术组高,且肝脏组织SOD水平较缺血再灌注组低,肝脏组织病理学损害重于假手术组;BMSC、再灌注预处理组血清AST、LDH及凋亡指数(AI)较缺血再灌注组低,BMSCs组最低,且肝脏组织SOD水平较缺血再灌注组高,BMSCs组最高,肝组织病理学损害明显轻于缺血再灌注组,BMSCs组最轻,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论经颈静脉BMSCs移植,对新西兰大白兔肝脏缺血再灌注损伤有修复作用,且作用优于预处理。     

脐血间充质干细胞治疗大鼠肾缺血再灌注损伤的效果及机制探讨

目的 观察脐带间充质干细胞(UC-MSCs)治疗大鼠肾脏缺血再灌注损伤(I/R)的效果,并探讨其机制.方法 60只大鼠,随机分为假手术组、I/R组、UC-MSCs组,各20只.UC-MSCs组大鼠切除右侧肾,夹闭左侧肾蒂1h,再灌注30 min后尾静脉注射人UC-MSCs 1×106个(0.5 mL).I/R组注射等量生理盐水.假手术组仅切除右肾,分离左肾肾蒂但不夹闭.术后24、48 h分别处死10只大鼠,取肾脏标本做组织形态学检查,采用免疫组化方法检测肾组织中的细胞间黏附分子( ICAM-1),计数肾组织中多型核白细胞(PMNL)的浸润数及eGFP阳性的UCMSCs数.结果 I/R组术后24h已可见明显近曲小管排列紊乱、疏松,上皮细胞肿胀,广泛空泡变性及片状坏死,可见上皮细胞脱落至管腔内.术后48 h更严重.假手术组肾小管排列整齐,间质无充血水肿.UC-MSCs组组织损伤较轻,肾小管排列基本正常,小管上皮细胞轻度浊肿,刷状缘脱落,可见管型.炎细胞浸润亦较I/R组明显减轻.术后24 h UC-MSCs组、I/R组、假手术组肾小管评分分别为(71.90±16.26)分、(169.60±15.68)分、(1.40±1.17)分,术后48h分别为(90.20±15.01)分、(182.40±12.77)分、(1.40±1.07)分.术后24 h UC-MSCs组、I/R组、假手术组肾组织白细胞计数分别为(18.90±7.45)个/mm2、(39.20±11.99)个/mm2、(0.90±1.10)个/mm2,术后48h分别为(27.20±9.53)个/mm2、(66.70±15.5)个/mm2、( 1.30±1.77)个/mm2.术后24 h UC-MSCs组、I/R组、假手术组肾组织ICAM-1相对表达量分别为2.224 9±0.963 7、5.2569±0.739 7、0.2170±0.1063,术后48 h分别为4.405 6±0.980 2、8.1012±1.6640、0.191 9±0.087 6.以上指标相同时点比较UC-MSCs组均明显低于I/R组,高于假手术组(P均＜0.05).术后24、48 h UC-MSCs组大鼠肾组织eGFP阳性细胞率分别为9.8％±1.2％、21.2％±7.3％,其余2组均未检出CFP阳性细胞.结论 UC-MSCs能够抑制大鼠肾缺血再灌注损伤,其机制与其抑制缺血再灌注损伤大鼠肾组织中ICAM-1表达上调和PMNL浸润有关.     

动、静脉移植骨髓间充质干细胞治疗急性期缺血再灌注大鼠模型的比较

目的探讨缺血再灌注6 h后经动、静脉途径移植骨髓间充质干细胞疗效的差异。方法将27只大脑中动脉缺血2 h后再灌注SD雌性大鼠模型随机分为颈动脉BMSCs组8只、尾静脉BMSCs组7只、颈动脉PBS组6只和尾静脉PBS组6只。全骨髓贴壁法分离、培养BMSCs,流式细胞仪检测鉴定;取缺血再灌注后6 h为移植时间点;移植后第7天观察改良神经功能损伤评分(m NSS)以评价神经功能恢复和体能恢复,免疫组织化学检测梗死周围组织GFAP、Bax和Bcl-2,TUNEL法检测梗死周围组织细胞凋亡,ELISA检测血清肿瘤坏死因子(TNF)-α。结果 BMSCs表面抗原CD90表达率为95.7%、CD29表达率为97.3%、CD106表达率为52.7%、CD11b表达率为6.01%、CD34表达率为2.95%、CD45表达率为2.26%。BMSCs组和PBS组相比较:GFAP阳性细胞数、Bcl-2平均光密度值显著增多;m NSS、血清TNF-α浓度、TUNEL阳性细胞数显著减少;Bax平均光密度值无明显差异。颈动脉BMSCs组和尾静脉BMSCs相比较各项数据无统计学差异。结论在缺血再灌注早期动、静脉途径移植BMSCs疗效无差异,但尾静脉途径因创伤微小、可移植细胞量多,为早期最佳移植途径。     

骨髓间充质干细胞对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制

目的 :研究骨髓间充质干细胞 (MSC)对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制。方法 :192只SD大鼠随机分为假手术组、手术组、对照组和MSC治疗组。MSC移植前应用BrdU标记 ,再灌注 1d后经同侧颈内动脉注射MSC(1× 10 6) ,对照组则注射PBS。采用线栓法建立脑缺血再灌注模型。术后每天应用爬杆法评定大鼠神经功能缺损。缺血 2h再灌注 2、4、6和 8d取脑组织 ,用免疫组织化学方法检测脑组织中bFGF的表达 ,RT PCR技术观察bFGFmRNA的表达。结果 :MSC治疗组大鼠的神经功能缺损评分明显低于手术组和对照组 (P <0 0 5 )。MSC治疗组缺血侧缺血周边区脑组织中观察到BrdU与bFGF免疫组化双染阳性细胞 ,脑组织中bFGFmRNA的表达也高于其他 3组 (P <0 0 1)。结论 :经颈外动脉给予的MSC可促进脑缺血再灌注大鼠的运动功能恢复 ;bFGF表达升高 ,可能是MSC脑保护作用机制之一。     

骨髓间充质干细胞治疗脑梗死的研究进展

<正>脑梗死是常见的脑血管病类型,因脑血管供血障碍而引发缺血性级联反应,造成神经功能缺损。随着人口老龄化,其发病率逐年上升,成为人类死亡和残疾的主要病因之一。目前,针对脑梗死的溶栓治疗因严格的时间窗而限制了获益患者。传统药物治疗虽然使疾病死亡率有所下降,但多数患者仍残存神经功能缺损,严重影响患者生活质量。自干细胞移植理论的兴起,骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗脑梗死的研究中发现移植BMSCs可促进脑梗死后功能改善〔1〕和组织修复〔2〕,并     

Caspase-3在骨髓间充质干细胞回输脑缺血再灌注模型大鼠脑组织中的表达

目的 观察骨髓间充质干细胞回输脑缺血再灌注模型大鼠后脑组织中caspase-3的表达.方法 无菌分离骨髓间充质干细胞,用培养液DMEM/F12(含2% B27,EGF 40 ng/ml,bFGF 20 ng/ml)诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化,免疫组化检测NSE表达.线栓法建立大鼠缺血再灌注模型.RT-PCR 检测 MSCs 回输脑缺血再灌注模型大鼠脑组织中caspase-3 mRNA的表达.结果 骨髓间充质干细胞诱导神经样细胞后,免疫组化检测NSE呈阳性表达.RT-PCR检测caspase-3 mRNA 表达,治疗组 caspase-3表达明显低于模型组(P<0.05).治疗组Caspase-3低于对照组,但无统计学意义(P>0.05).结论 骨髓间充质干细胞回输脑缺血再灌注模型大鼠后脑组织caspase-3基因下调,抑制神经细胞凋亡.     

人骨髓间充质干细胞及其外泌体在肝移植术后肝缺血再灌注损伤中潜在治疗作用的研究进展

［摘要］　肝缺血再灌注损伤（HIRI）是传统肝移植术中不可避免的病理生理过程,其严重程度受到来自供体和受体的多方面因素影响,最严重者可导致术后早期移植肝无功能。人骨髓间充质干细胞（BMSCs）及其外泌体已在临床试验中被证实具有促进组织修复与免疫调节的能力,这一治疗作用在HIRI的防治中具有较好的应用前景。该文旨在综述BMSCs及其外泌体在移植肝HIRI防治中潜在作用机制的研究进展及未来研究方向。     

骨髓间充质干细胞移植对损伤血管的内皮修复作用

目的探讨兔颈动脉粥样硬化狭窄血管成形术后,骨髓间充质干细胞(BMSC)移植对损伤血管内皮修复的影响及可能机制。方法制作兔颈动脉粥样硬化狭窄模型48只,随机分成BMSC移植组(n=24)和对照组(n=24)。体外培养兔BMSC,流式细胞仪鉴定BMSC表面标志,DAPI标记后备用。球囊损伤颈动脉的即刻,BMSC移植组以107/kg的细胞数经颈外动脉移植到损伤动脉局部,对照组注射等量的PBS液。术前及细胞移植后3、7、14及28天采集外周血用ELISA法测定血管内皮生长因子水平。移植后7天取材观察DAPI标记BMSC的归巢。移植后14天免疫组织化学染色检测损伤血管组织的血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)的表达;移植后28天HE染色后测定损伤血管新生内膜面积、新生内膜面积/中膜面积及再狭窄率。结果 BMSC移植组在移植后各时间点血管内皮生长因子水平均显著高于对照组(P<0.01)。移植后7天BMSC移植组损伤血管的内膜表面见DAPI标记的BMSC。移植后14天血管内膜有CD31的连续性表达,对照组没有表达。与对照组比较,移植后28天BMSC移植组血管新生内膜面积(0.092±0.009比0.189±0.007,P<...     

骨髓间充质干细胞在脑缺血再灌注大鼠脑内存活并分化为神经元样细胞的实验研究

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)经静脉移植在大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)大鼠脑内存活并分化为神经元样细胞。方法常规方法分离、培养大鼠MSCs,根据Aspey方法制成MCAO模型,经尾静脉注射3×106溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记的大鼠MSCs,28d后处死大鼠,取脑组织行免疫荧光检测。结果共聚焦显微镜下观察到MSCs移植后脑梗死灶边缘聚大量BrdU阳性细胞,少量神经元特异性烯醇化酶(NSE)和BrdU双染细胞。结论经静脉移植的MSCs可移行至MCAO脑梗死灶周围并分化为神经元样细胞。     

骨髓间充质干细胞的培养及低氧条件对其影响

目的 骨髓间充质干细胞(BMMSC)的体外培养和低氧对于BMMSC增殖作用的影响.方法 成年雄性SD大鼠断颈处死后于75％酒精中浸泡5 min.用全骨髓贴壁法培养细胞,选取生长状态良好的第3代细胞进行鉴定.以单克隆抗体CD45、CD90行流式细胞术鉴定大鼠BMMSC.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定第3代BMMSC以及低氧处理的第3代BMMSC的增殖情况.结果 用全骨髓贴壁法分离并培养SD大鼠BMMSC;流式细胞仪检测显示:第3代BMMSC表面特异性标志CD90表达率为96.0％,而非BMMSC表面标志CD45仅为2.5％.MTT结果显示低氧条件下的BMMSC比常氧条件下增殖速率高,并且光镜下观察到细胞状态均一,折光性更好.结论 用全骨髓贴壁法可以在体外分离、培养出纯度较高的SD大鼠来源BMMSC,低氧环境可以刺激BMMSC的增殖.     

不同诱导条件对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导类肝细胞的影响

目的:探讨实验性大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、诱导的最优条件,为MSCs治疗临床重症肝病患者提供参考依据.方法:采用密度梯度离心法和贴壁法分离大鼠MSCs.经培养传代获得纯化的MSCs.采用析因实验,设不同诱导时间、不同浓度的FBS、不同浓度的细胞因子为3个因素,每个因素设不同水平,对纯化的MSCs进行分组诱导培养.留取15、2l、27 d细胞培养液进行白蛋白(A1b)、甲胎蛋白(AFP)检测;于27 d时收集细胞爬片,采用过碘酸希夫(PAs)实验进行糖原染色和免疫细胞化学染色检测MSCs中CK-18和CK-19.结果:诱导15、21、27 d,各MSCs诱导组AFP水平均高于MSCs非诱导组(P＜0.01),21 d诱导组AFP水平最高:15 d各MSCs诱导组与MSCs非诱导组白蛋白水平无统计学意义,21、27d各MSCs诱导组白蛋白水平均高于MSCs非诱导组(P＜0.01),27 d诱导组白蛋白水平最高.27d各MSCs诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18、CK-19均阳性,而MSCs非诱导组糖原染色、CK-18、CK-19均阴性.多因素方差分析表明,Mscs体外最佳诱导条件为含200mL/LFBS的DMEM 肝细胞生长因子(HGF)20Ug/L 成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)20UG/L.结论:HGF和FGF-4可在体外诱导实验性大鼠Mscs分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞:不同浓度的FBS、HGF和FGF-4影响MSCs的体外分化;MSCs可作为治疗临床重症肝病的一种细胞来源.     

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on the proliferation of bone marrow CD34~+ cells in vitro

Objective To investigate the effect on the marrow CD34+ cells by bone marrow mesenchymal stem cells(BMMSC),VarioMACS was used to sort bone marrow CD34+ cells,and then the purity of CD34+ cell was tested by FCM. Marrow mononuclear cells from abortion fetal bone marrow were isolated,and BMMSC were     

心肌微环境对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用

目的通过与心肌细胞(CMs)共同培养和采用含有CMs裂解液的培养基两种方法体外模拟心肌微环境,探讨心肌微环境对骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的诱导作用。方法自新生乳鼠的心脏分离CMs,自成年大鼠的骨髓分离MSCs,将MSCs与CMs按1∶4的比例共同培养1周,观察细胞形态的改变,并通过免疫荧光方法检测共培养后MSCs表达心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)及CD31的情况;将分离的CMs反复冻融制成CMs裂解液,将MSCs在含有4倍CMs裂解液的培养基中培养1周,观察细胞形态的改变,并通过免疫化学方法检测MSCs表达心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)及CD31的情况;以仅用普通培养基所培养的MSCs作为对照。结果与CMs共培养的MSCs和CMs裂解液培养的MSCs逐渐伸展变长,形成肌细胞形态,培养1周后经抗cTnT和抗CD31免疫染色均呈阳性;对照组MSCs没有明显形态变化,抗cTnT和抗CD31免疫染色成阴性。结论与CMs共培养和采用含有CMs裂解液的培养基两种方法均可在体外模拟心肌微环境,诱导MSCs向心肌样细胞和内皮样细胞方向分化。     

骨髓间充质干细胞修复心肌损伤的研究进展

心肌梗死（MI）具有较高的死亡率,大面积MI后幸存的患者,常因心肌结构重构而逐渐发展为心力衰竭,预后往往欠佳。近来研究发现,骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs）作为多潜能干细胞,对受损的心肌具有积极的修复作用,为改善MI患者的预后提供了一个新途径。本文主要就BMSCs修复受损心肌的相关机制作一综述。     

促红细胞生成素对骨髓间充质干细胞移植修复小鼠急性肾损伤的作用机制

目的:构建缺血再灌注(I/R)诱导的急性肾损伤(AKI)小鼠模型,经尾静脉注射行骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)移植,观察外源性促红细胞生成素(EPO)对BM-MSCs移植修复AKI效应的调控,并探讨基质细胞衍生因子1(SDF-1)/CXCR4轴在调控中的作用. 方法:C57BI/6小鼠100只,随机分为正常对照组、模型组(AKI组)、BM-MSCs移植组、EPO干预组、EPO干预+BM-MSCs移植组,移植BM-MSCs采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记.建模后Id、3d、7d、14d处死部分小鼠,检测血清尿素氮(BUN)及肌酐(SCr)水平,观察肾组织病理变化,行急性肾小管损伤程度评分(ATN评分),免疫组织化学观察移植后其BM-MSCs在小鼠肾组织的分布,Western印迹法检测损伤肾组织中SDF-1水平. 结果:与BM-MSCs移植组及EPO干预组比较,EPO干预+BM-MSCs移植组小鼠BUN、SCr及ATN评分降低幅度更大,至移植后第14d小鼠的BUN、SCr水平甚至接近正常对照组.免疫组化显示BM-MSCs移植组小鼠肾脏中可检出BrdU+细胞分布,以术后第7天最多(11.32％±1.38％),在此基础上联合EPO干预可增加肾组织中BrdU+阳性细胞比例.AKI建模后肾组织SDF-1水平升高,建模后7d达高峰,EPO干预可显著增加SDF-1的表达. 结论:EPO干预可增加BM-MSCs移植后受损肾组织中移植细胞数量,增强AKI的修复作用,其中肾脏中促干细胞归巢因子SDF-1表达增加为其可能机制之一.     

Human bone marrow mesenchymal stem cells in vivo

Great confusion still exists amongst cell biologists, musculoskeletal and other specialists interested in regenerative medicine regarding the in vivo identity of human bone marrow (BM) mesenchymal stem cells (MSCs). Contrary to views held in some quarters, methods for the robust identification and purification of BM MSCs are now well established. Human BM MSCs represent a phenotypically homogeneous cell population that share an identical phenotype with marrow adventitial reticular cells (ARCs), which are stromal cells similar in nature to pericytes. When an extensive panel of markers is used to characterize BM MSCs, it appears that the diverse MSC markers described in different laboratories are expressed on the same cell population. Rare cell phenotypical analysis and in vitro colony forming unit-fibroblast (CFU-F) assays produce no compelling evidence that BM MSCs circulate in healthy man. Furthermore, although investigators speak of a number of specific MSC markers, a true marker of MSC 'stemness' and multipotentiality has not yet been defined since culture-expanded MSCs may lose some of these markers, but remain multipotential. This knowledge provides a platform for understanding MSCs in vivo leading to novel approaches for therapy development, including in situ tissue engineering.     

骨髓间充质干细胞条件培养液对急性百草枯中毒肺损伤的影响

目的通过将骨髓间充质干细胞(BMSCs)条件培养液注入到急性百草枯中毒大鼠体内,观察其对急性百草枯中毒肺损伤的影响。方法选4周龄SPF级雄性SD大鼠,原代培养BMSCs,传至第3代的BMSCs无血清培养24 h,收集的培养基即为BMSCs条件培养液。将30只SPF级雄性大鼠随机分为3组:百草枯组、BMSCs条件培养液治疗组(治疗组)、正常对照组。将BMSCs条件培养液通过尾静脉注入各组大鼠体内,观察各组大鼠肺组织肺泡炎评分、肺组织α-SMA表达水平和各组大鼠血浆中TNF-α、IL-1β的水平变化。结果与百草枯组相比,治疗组肺泡炎症反应较轻,肺组织α-SMA表达水平较低(P0.05),血浆中TNF-α、IL-1β的含量较低(P0.05)。结论 BMSCs条件培养液可减缓急性百草枯中毒引起的肺损伤。     

小鼠DNA酶真核表达质粒在小鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的 将构建好的小鼠DNA酶(DNaseI)真核表达质粒转染到小鼠骨髓间充质干细胞中,观察目的基因在细胞内的表达及分泌情况.方法 采用脂质体法将已构建好的小鼠DNaseI的真核表达质粒转染人小鼠骨髓间充质干细胞中,用Western blotting法检测DNaseI基因在骨髓间充质干细胞内的表达及DNA-甲基绿比色法检测培养上清液中DNaseI的活性.结果 小鼠DNaseI的真核表达质粒能够转染入小鼠骨髓间充质干细胞中,转染效率约为30%.转染后的小鼠骨髓间充质干细胞可以表达DNaseI蛋白且分泌出具有活性的DNaseI.结论 脂质体法能够将小鼠DNaseI的真核表达质粒转染入小鼠骨髓间充质干细胞中,小鼠DNaseI基因在小鼠骨髓间充质干细胞中成功表达并分泌具有生物活性的DNaseI.     

不同补肾法在脑梗死大鼠体内促骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用

目的 探讨不同补肾法在脑梗死大鼠体内对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化的影响.方法 用线栓法制备大鼠大脑中动脉梗塞(MCAO)模型,随机分为空白诱导组、左归丸诱导组、地黄饮子诱导组、右归丸诱导组、维甲酸(RA)诱导组、左归丸联合RA诱导组、右归丸联合RA诱导组、地黄饮子联合RA诱导组,不同补肾法代表方药含药血清孵育BMSCs,移植后7、14 d进行移植细胞神经标志蛋白的检测.结果 诱导BMSCs经静脉移植入大鼠体内后,阳性表达神经细胞的相关蛋白神经元特异性烯醇化酶(NSE)、Nestin及胶质纤维酸性蛋白(GFAP).结论 不同补肾法在脑梗死大鼠体内能够促BMSCs向神经元样细胞分化,且补阴类代表方左归丸和阴阳双补类代表方地黄饮子在体内诱导分化的效果优于补阳类代表方右归丸.