钾通道阻断剂抑制乳腺癌细胞增殖作用的实验研究

目的探讨选择性钾离子通道阻断剂4-氨基吡啶(4-AP)对多西紫杉醇(DOC)抗人乳腺癌细胞MDA-MB-435S增殖、凋亡、周期的影响。方法通过MTT比色法分析DOC、4-AP以及两药联合应用对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S增殖的影响;流式细胞术AnnexinV-FITC/PI双染法和PI单染法检测2种药物对MDA-MB-435S凋亡和周期的影响。结果0.04～50μmol/LDOC可剂量依赖性抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S的增殖;4-AP(5mmol/L)本身具有抑制MDA-MB-435S细胞的增殖作用,并可使DOC(25μmol/L)对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S达最大抑制率的时间明显提前,DOC和4-AP对MDA-MB-435S细胞的增殖抑制有相加或协同作用,并呈剂量和时间依赖性。DOC(2μmol/L)单用24h时促进MDA-MB-435S细胞凋亡的作用并不明显,当与4-AP(5mmol/L)联合应用后能明显增加细胞早期凋亡的发生率;单用DOC可使MDA-MB-435S细胞阻断在G2/M期,单用4-AP可使MDA-MB-435S细胞阻断在G0/G1期,两药联合应用可使细胞阻断在G2/M期。结论DOC和4-AP分别在G2/M期和G0/G1期抑制MDA-MB-435S细胞增殖,4-AP通过促进DOC诱导MDA-MB-435S细胞凋亡从而抑制其增殖作用。     

丁酸钠对胰腺癌BxPC-3细胞凋亡机制的影响

目的:探讨丁酸钠对胰腺癌BxPC-3细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:采用MTT法观察不同浓度丁酸钠对BxPC-3细胞增殖的抑制作用;应用流式细胞仪检测丁酸钠作用于BxPC-3细胞后的凋亡情况;TRAP-ELISA法检测细胞端粒酶活性的变化;RT-PCR技术分析人端粒酶逆转录酶(hTERT)、bcl-2 mRNA的表达水平。结果:丁酸钠作用BxPC-3细胞能明显抑制细胞增殖,其作用具有时间和剂量依赖性。丁酸钠处理72 h的BxPC-3细胞凋亡率明显提高(P<0.01),S期细胞比例显著下降(P<0.05),G0/G1期细胞比例显著升高(P<0.05)。经丁酸钠处理的实验组端粒酶活性为0.96±0.12,未经丁酸钠处理的对照组端粒酶活性为4.18±0.34,二者之间差异有显著性(P<0.05)。丁酸钠处理的实验组hTERT mRNA水平为0.168±0.045,与对照组0.685±0.141比较差异有统计学意义(P<0.01),bcl-2实验组水平为0.138±0.034,与对照组0.715±0.026比较有统计学差异。结论:丁酸钠具有强烈诱导胰腺癌BxPC-3细胞凋亡的作用,其发生机制与丁酸钠下调hTERT Bcl-2 mRNA表达水平直接相关。     

槲皮素对乳腺癌细胞MDA-MB-435S抑制作用及其机制

目的探讨槲皮素抑制乳腺癌增殖的作用及其机制。方法MTT法检测槲皮素对ER阴性乳腺癌细胞MDA-MB-435S生长的抑制作用;流式细胞仪分析细胞周期;RT-PCR及免疫组化方法检测槲皮素作用后VEGF、p53mRNA及蛋白质的表达。结果(1)槲皮素可呈时间及浓度依赖性地抑制乳腺癌的生长和增殖,其IC50为17.59μM。(2)流式细胞仪分析发现,槲皮素作用48h后,细胞被阻滞于G0/G1期。(3)槲皮素作用后VEGF、p53mRNA及蛋白质的表达下调。结论(1)槲皮素具有抑制ER阴性乳腺癌细胞MDA-MB-435S生长的作用,并呈时间及浓度依赖性。(2)槲皮素抗乳腺癌增殖作用的可能机制槲皮素下调乳腺癌细胞VEGF mRNA和蛋白质的表达使肿瘤细胞的自分泌因子作用减弱;下调MTp53mRNA及蛋白质的表达从而将乳腺癌细胞阻滞于G0/G1期,不能继续增殖。     

抑癌基因ING4转染对乳腺癌细胞MDA-MB-435S生物学行为的影响

目的 研究转染抑癌基因ING4对乳腺癌细胞系MDA-MB-435S生物学行为的影响.方法 携带ING4基因的真核表达质粒pcDNA3.0(+)-ING4利用脂质体瞬时转染乳腺癌MDA-MB-435S细胞,以转染pcDNA3.0(+)空载体和未转染的MDA-MB-435S作为阴性对照和空白对照.转染72 h后,RT-PCR检测转染前后ING4基因mRNA表达水平,MTT法检测转染各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞周期的变化,TUNEL实验检测各组细胞凋亡水平的变化.结果 转染ING4基因的MDA-MB-435S细胞ING4 mRNA表达水平明显上调;细胞增殖活力较空白组和阴性对照组下降(P＜0.05);细胞发生G2/M期阻滞(P＜0.05);细胞凋亡比例明显增加(P＜0.01).结论 ING4基因通过G2/M期阻滞和诱导细胞凋亡的方式抑制乳腺癌细胞生长.     

二甲基亚砜对人类食管癌细胞株作用机理的研究

探讨了2%二甲基亚砜(DMSO)对Eca-109细胞株作用的机理。实验结果表明:二甲基亚砜抑制了Eca-109细胞的增殖,使Eca-109细胞~3H-TdR掺入减少,对照组和实验组~3H-TdR掺入数分别为5250.3±87.2、2990.3±17.27,导致Eca-109细胞集落形成能力下降,对照组和实验组集落数分别为34.56±12.13、11.88±4.80。流式细胞术显示:对照组Eca-109细胞G0/G1,S和G2+M各期的百分比为:42.67±7.57,55.00±7.21,2.30±1.15;实验组细胞各期的百分比为71.00±9.85,20.67±15.04,8.00±5.29;(P<0.01)。实验结果提示:二甲基亚观能阻止Eca-109细胞从G0/G1期进入S期,从而可抑制细胞的生长。     

半夏总生物碱对人乳腺癌细胞增殖的抑制作用

目的探讨半夏总生物碱(total alkaloids from pinellia ternate,TATP)对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S增殖的影响。方法采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolil tetracolium,MTT)比色法以及集落形成率实验,检测不同浓度的TATP对MDA-MB-435S细胞株的生长抑制作用。应用单细胞凝胶电泳分析检测TATP导致MDA-MB-435S细胞的DNA损伤情况。结果人乳腺癌细胞MDA-MB-435S经TATP处理后,其体外增殖能力受到明显抑制且与药物剂量、作用时间呈正相关,经TATP作用24、48、72h后的半数抑制浓度分别为:98.37μg/ml、52.16μg/ml、33.63μg/ml。单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)中,TATP组细胞尾DNA含量、尾长及尾动量与对照组有统计学差异(P<0.01),且呈现浓度依赖性。结论在体外培养条件下,TATP能明显抑制MDA-MB-435S细胞增殖,其机制可能与DNA的损伤作用有关。     

p75NTR对乳腺癌耐药细胞MDA-MB-231/ADR耐药及细胞周期的影响

目的 探讨神经营养因子受体(p75NTR)对乳腺癌耐药细胞MDA-MB-231/ADR化疗耐药性及细胞周期的影响.方法 采用CCK-8法检测转染p75NTR及p75NTR-siRNA后乳腺癌耐药细胞系MDA-MB-231/ADR对耐药的影响;FCM检测转染p75NTR及p75NTR-siRNA的乳腺癌及耐药细胞的细胞周期分布及细胞凋亡的影响.结果 过表达p75NTR可有效增强MDA-MB-231/ADR细胞对ADM、GEM和OXA的耐药性(P<0.05);抑制p75NTR的表达可抑制MDA-MB-231/ADR细胞对ADM、GEM和OXA的耐药性(P<0.05).转染pcD-NA3.1-p75NTR后,MDA-MB-231/ADR-p75NTR细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期,G0/G1期细胞增至(61.12±1.89)%,S期细胞减至(32.76±0.23)%,凋亡率减至(16.83±1.29)%,差异有统计学意义(P<0.05);转染p75NTR-siRNA后MDA-MB-231/ADR-p75NTRsi1细胞的细胞周期于G0/G1期减至(39.26±1.31)%,S期细胞增至(52.88±1.74)%,凋亡率增至(21.49±1.41)%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 过表达p75NTR能够使乳腺癌耐药细胞MDA-MB-231/ADR细胞周期阻滞于G0/G1期,促进细胞存活,抑制其凋亡,降低MDA-MB-231/ADR细胞对化疗药物的敏感性而促进其多药耐药性.     

Calphostin C对乳腺癌细胞侵袭能力的影响

目的探讨Calphostin C对高转移乳腺癌MDA-MB-435S细胞侵袭能力的抑制作用。方法高转移乳腺癌MDA-MB-435S细胞系购于中国医学科学院上海细胞库,通过划痕实验、Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验及细胞黏附实验观察Calphostin C对MDA-MB-435S细胞侵袭能力的影响。结果划痕实验结果显示,与对照组比较,实验组MDA-MB-435S细胞伤口愈合显著减慢,对照组细胞伤口24 h基本愈合,而实验组细胞伤口24 h仍未愈合。Transwell迁移和侵袭实验结果显示,实验组MDA-MB-435S细胞迁移、侵袭并穿过Transwell小室底膜的细胞数显著少于对照组(P<0.05)。细胞黏附实验结果显示,与对照组比较,实验组MDA-MB-435S细胞与纤维连接蛋白的黏附性显著降低(P<0.05)。结论 Calphostin C可显著抑制高转移乳腺癌MDA-MB-435S细胞的侵袭能力。     

益气活血方对乳腺癌MDA-MB-435S细胞和MDA-MB-231细胞的影响

目的:观察益气活血方对乳腺癌MDA-MB-435S细胞和MDA-MB-231细胞的影响。方法:采用四甲基偶氮唑蓝法观察益气活血方对人乳腺癌MDA-MB-435S细胞和MDA-MB-231细胞增殖的影响;釆用四甲基偶氮唑蓝法等观察益气活血方对MDA-MB-435S细胞和MDA-MB-231细胞黏附能力的影响;采用Transwell小室模型观察益气活血方对MDA-MB-435S细胞和MDA-MB-231细胞侵袭能力的作用。结果:益气活血方对MDA-MB-435S和MDA-MB-231细胞的增殖具有抑制作用,呈现时间和质量浓度依赖性(P0.05)。益气活血方对MDA-MB-435S和MDA-MB-231细胞体外黏附具有抑制作用,当质量浓度为80mg·L-1时,对MDA-MB-435S细胞体外黏附抑制作用呈现时间依赖性(P0.05);益气活血方对MDA-MB-231细胞体外黏附的抑制作用呈现时间和质量浓度依赖性(P0.05)。益气活血方对MDA-MB-435S和MDA-MB-231细胞侵袭能力具有抑制作用,呈质量浓度依赖性(P0.05)。结论:益气活血方可以通过抑制影响乳腺癌MDA-MB-435S细胞和MDA-MB-231细胞的增殖、黏附和侵袭,达到抑制乳腺癌转移的作用。     

反义人DNMT1基因对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖和细胞周期的影响

目的 构建表达人DNMT1基因(DNA methyltransferase 1,DNMT1)反义RNA的真核表达质粒,观察其对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖的影响.方法 应用DNA重组技术,将人DNMT1基因的cDNA片段克隆至pcDNA3.1(-)载体中,构建DNMTl反义RNA真核表达质粒,测序验证,将其转染人人乳腺癌细胞系中,利用荧光定量PCR法检测转染前后细胞DN-MT1基因mRNA表达水平的变化;Western blot检测转染后DNMT1蛋白表达变化;应用MTT法检测细胞生长状况,绘制细胞生长曲线;流式细胞术分析细胞周期的变化.结果 成功构建出能够表达DNMT1反义RNA的真核表达质粒.转染该质粒后,与未转染组和转染正义质粒组相比,MDA-MB-435s细胞中DNMT1基因mRNA和DNMT1蛋白表达量均显著下降;细胞生长变慢;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加.结论 反义DNMT1能够特异性下调该基因的表达,并抑制乳腺癌细胞的增殖,为乳腺癌基因治疗提供了新的靶标.     

Duffy抗原趋化因子受体抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长和肺转移

目的 探讨Duffy抗原趋化因子受体（DARC）对人乳腺癌细胞株成瘤性和肺转移的影响及其作用机制。方法 建立DARC过表达的MDA-MB-435肺高转移性细胞株（MDA-MB-435HM-DARC）,观察体外细胞生物学行为的改变,检测培养上清中DARC配体CXCL8（IL-8）和CCL2（MCP-1,JE）浓度;建立人乳腺癌BALB／c裸鼠原位移植瘤模型,观察肿瘤生长曲线与肺内转移灶,检测瘤内DARC、JE、CD34、基质金属蛋白酶．9（MMP-9）等的变化,并进行相关性分析。结果 MDA-MB-435HM-DARC在体外的增殖及侵袭性未见明显改变,但培养上清中CXCL8、CCL2的浓度明显降低。体内实验显示MDA-MB-435HM-DARC移植瘤生长延迟而且体积缩小,肺内转移灶数目减少,同时瘤内CCL2蛋白水平、微血管密度（MVD）降低,MMP-9的产生也减少。结论 DARC作为促血管生成趋化因子的清除槽,可抑制由趋化因子诱导的血管生成,从而抑制乳腺癌的生长和肺转移。     

川楝素上调FOXO1的表达增强多柔比星的体外抗乳腺癌活性

目的: 探讨川楝素对乳腺癌多柔比星化疗的辅助治疗作用并研究其机制。方法: MTT法检测乳腺癌细胞系MDA-MB-435和MDA-MB-231的细胞活力;流式细胞术检测MDA-MB-435的细胞凋亡;western blot实验检测MDA-MB-435细胞中FOXO1、Bim、Noxa的表达水平,细胞色素c的释放水平及caspase-9、caspase-3的活化水平。结果: 川楝素明显增强MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞系对不同浓度多柔比星的敏感性。多柔比星联合川楝素处理的MDA-MB-435的相对细胞活力(0.55±0.04)显著低于多柔比星单治疗组(0.87±0.07,P<0.05)和多柔比星+川楝素+FOXO1 siRNA组(0.79±0.07,P<0.05)。多柔比星联合川楝素处理的MDA-MB-435的细胞凋亡率(34.2±2.8)显著高于多柔比星单治疗组(9.3±0.8,P<0.05)和多柔比星+川楝素+FOXO1 siRNA组(12.5±1.1,P<0.05)。多柔比星联合川楝素处理的MDA-MB-435细胞中FOXO1、Bim、Noxa的表达水平,细胞色素c的释放水平及caspase-9、caspase-3的活化水平均显著高于多柔比星单治疗组和多柔比星+川楝素+FOXO1 siRNA组。结论: 川楝素上调FOXO1的表达增强多柔比星的体外抗乳腺癌活性。     

二氢杨梅素通过SIRT1/ROS/JNK途径增强顺铂对乳腺癌细胞的杀伤活性

目的: 探讨天然药物活性成分二氢杨梅素是否对顺铂有协同抗乳腺癌效应并研究其机制。方法: MTT法和Annexin V染色流式细胞术检测二氢杨梅素和顺铂处理对乳腺癌细胞系MDA-MB-435细胞活力和细胞凋亡的影响。采用western blot方法检测二氢杨梅素是否影响MDA-MB-435细胞中SIRT1的表达。运用二氢乙啶(DHE)染色流式细胞术及western blot方法研究二氢杨梅素联合顺铂对MDA-MB-435细胞ROS/JNK通路的影响。结果: 顺铂联合二氢杨梅素对MDA-MB-435的细胞活力抑制率(61.5±5.1)和凋亡诱导率(36.8±2.9)显著高于顺铂单治疗组的的细胞活力抑制率(15.2±1.4,P<0.05)和凋亡诱导率(7.6±0.6,P<0.05)。流式细胞和western blot实验结果显示二氢杨梅素处理可显著抑制MDA-MB-435细胞SIRT1蛋白的表达水平并显著增强顺铂对MDA-MB-435细胞活性氧簇(ROS)的诱导、JNK蛋白的磷酸化和caspase-9、caspase-3的活化。另外,顺铂+二氢杨梅素+SIRT1组MDA-MB-435的细胞活力抑制率(19.7±1.6)和凋亡诱导率(10.8±0.9)显著低于顺铂联合二氢杨梅素组MDA-MB-435的细胞活力抑制率(61.5±5.1,P<0.05)和凋亡诱导率(36.8±2.9,P<0.05)。结论: 二氢杨梅素通过抑制SIRT1的表达增强顺铂对乳腺癌细胞的杀伤活性。     

乳腺癌中STAT3对HSP27和c-MYC表达的调控作用

目的:研究人乳腺癌组织中信号转导和转录激活因子3(STAT3)对热休克蛋白27(HSP27)和c-MYC的调控作用. 方法:应用免疫组化检测51例人乳腺癌组织STAT3,HSP27,c-MYC蛋白的表达,分析他们的相互关系及与临床预后相关指标的关系. 在体外应用诱骗寡核苷酸(Decoy ODNs)抑制乳腺癌细胞MDA-MB-435S STAT3活性,Western blot检测MDA-MB-435S细胞HSP27,c-MYC蛋白表达,MTT检测肿瘤细胞增殖力,FCM检测MDA-MB-435S细胞周期和凋亡. 结果:在人乳腺浸润性导管癌组织中,STAT3的表达与HSP27和c-MYC表达均成正相关(rs=0.454,P=0.001;rs=0.541,P=0.000). 使用Decoy ODNs抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S STAT3活性能使其HSP27和c-MYC表达明显下调(P均<0.01),并使细胞阻滞于G0/G1期,凋亡增加,细胞增殖能力下降(P<0.01). 结论:STAT3表达可能通过上调HSP27和c-MYC的表达,抑制乳腺癌细胞的凋亡和促进其增殖,从而有利于乳腺癌进展并使其恶性程度增高.     

pshuttle-Egr-1-hSmac质粒联合X线照射对乳腺癌MDA-MB-435细胞增殖的抑制作用

目的:构建pshuttle-Egr-1-hSmac质粒并转染人乳腺癌MDA-MB-435细胞,观察其抑制肿瘤细胞的辐射增敏作用。方法：转染pshuttle-Egr-1-hSmac质粒的MDA-MB-435细胞经过2 Gy X线照射不同时间（4、8、12、24 和48 h）和0.5 ~ 5.0 Gy X线照射后24 h收集细胞,采用RT-PCR和Western blotting法检测Smac mRNA及其蛋白表达。将细胞分为对照组、pshuttle质粒组、pshuttle-Egr-1-hSmac 质粒组、2 Gy 组、pshuttle+2.0 Gy组 和pshuttle-Egr-1-hSmac+ 2.0 Gy组,MTT法检测各组细胞增殖;克隆形成实验检测细胞存活能力;Annexin Ⅴ-FITC双染法检测细胞凋亡;PI单染法检测细胞周期。结果:对照组和pshuttle质粒组MDA-MB-435细胞中Smac mRNA无表达,而pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组MDA-MB-435细胞Smac mRNA表达水平随时间延长逐渐升高,于24和48 h时表达水平最高;经0.5 ~ 5.0 Gy X线照射后24 h MDA-MB-435细胞Smac mRNA表达水平随照射剂量增加而逐渐增加,在2.0和5.0 Gy X线照射后Smac mRNA表达水平最高。pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组4、8、12和24 h后Smac蛋白表达水平逐渐升高,24 h后表达水平最高。经过0、0.5、1.0、2.0和5.0 Gy X线照射后24 h Smac蛋白表达水平逐渐升高,尤其以5.0 Gy X线照射时表达水平最高。MTT法检测时程效应,2.0 Gy、pshuttle+2.0 Gy和pshuttle-Egr-1-hSmac+2.0 Gy质粒组24、48和72 h细胞A490值明显低于对照组（P<0.01）;剂量效应,pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组1.0～5.0 Gy X线照射后,MDA-MB-435细胞A490值明显低于0 Gy X线照射(P<0.05或P<0.01)。pshuttle-Egr-1-hSmac质粒组细胞存活分数明显低于对照组（P<0.01）。pshuttle-Egr-1-hSmac+2.0 Gy组细胞凋亡率明显高于2.0 Gy组（P<0.01）,G0/G1期和S期细胞百分率明显低于2.0 Gy照射组（P<0.01）,G2/M期细胞百分率明显高于2.0 Gy组（P<0.01）。结论：X线照射能增加pshuttle-Egr-1-hSmac质粒转染的MDA-MB-435细胞有效表达Smac mRNA及蛋白,能抑制细胞存活,且诱导G2/M期阻滞和凋亡增加;Smac基因联合放射治疗可明显增加乳腺癌细胞的放射敏感性。     

LKB1基因与乳腺癌细胞侵袭性相关因子的研究

目的观察LKB1基因对乳腺癌细胞的侵袭性影响及机制。方法筛选LKB1基因转染的MDA-MB-435乳腺癌细胞,随机取样一株高表达细胞株和一株低表达细胞株,同时与未转染细胞株和空质粒转染细胞株比较。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和明胶．酶谱法观察基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9和促进微血管生成的因子VEGF、bFGF的基因表达情况,并应用Western印迹对其蛋白定量分析。应用Tramswell试验对其进行膜穿透能力检测。结果LKB1基因转染的乳腺癌细胞的mRNA和蛋白水平上MMP-2、MMP-9和VEGF、bFGF基因表达的相对吸光度（A）值皆低于未转染细胞和空质粒细胞,且LKB1基因高表达细胞株较低表达细胞株更低。同时发现Tramswell试验中LKB1转染的细胞侵袭能力下降（18．1％±1．0％、22．4％±1．8％vs47．6％±1．3％、45．6％±1.2％,均P〈0．01）。结论LKB1基因作为一种抑癌基因对乳腺癌细胞的侵袭性可能起重要作用。