钙载体A_(23187)快速诱导人外周血单核细胞成树突状细胞

 目的　探讨钙载体 (calciumionophore ,CI)A2 3 187对正常人外周血单核细胞来源的树突状细胞(Dendriticcell,DC)形态、表面分子表达及免疫功能的影响。方法　分离健康献血者外周血单核细胞 ,分别加入 :重组人粒 /单集落刺激因子 (rhGM CSF) 10 0ng/ml、rhGM CSF 10 0ng/ml +IL 4 5 0ng/ml、rhGM CSF +A2 3 187(钙载体 ,CI)各 10 0ng/ml。体外培养 4 0h后 ,于光镜及电镜下观察细胞的形态、流式细胞仪检测细胞的表面标志、MTT比色法检测上述细胞对同种异体T细胞的刺激增殖作用。结果　外周血单核细胞在GM CSF +A2 3 187各 10 0ng/ml的条件下培养 4 0h ,就可看到典型的DC形态 ,其表面单核细胞的特征性标志CD14分子表达减少 ,HLA DR、CD80、CD86及CD83分子的表达均明显增高 ,且具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力。结论　外周血单核细胞在钙载体A2 3 187及GM CSF的共同作用下 ,4 0h就能获得成熟的DC     

自体恶性黑色素瘤抗原激活的树突状细胞体外诱导免疫试验

树突状细胞(dendritic cells,DC)是迄今为止所知的抗原呈递能力最强的抗原呈递细胞(antigen presenting cells,APC).肿瘤患者因DC免疫功能低下致宿主抗肿瘤免疫无能.研究表明,人外周血单核细胞在体外用粒/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)及白介素4(IL-4)诱导后,可培养出表达高水平MHCI、MHCII类抗原和CD80、CD86等因子的DC.本实验拟应用黑色素瘤患者外周血单核细胞,经GM-CSF及IL-4诱导后获得DC,再经自体肿瘤细胞冻融物冲击,在体外激活自体T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL),观察其体外抗肿瘤作用.     

外周血单核细胞与树突状细胞的命名

单核细胞与树突状细胞系细胞在血液中循环并最终迁移到组织中,它们在组织中进一步成熟并发挥免疫防御等多种功能。近年来,采用流式细胞术对这些细胞的表面标志分子特征进行了详细的分析,发现了相应的细胞亚群。国际免疫学会命名委员会（由英国莱斯特大学免疫学研究所Loems Ziegler-Heitbrock教授为首的18位科学家组成）对这些细胞进行了统一命名,将人和小鼠血液单核细胞分为三种类型：经典型（classical monocytes）、中间型（intermediate monocytes）和非经典型单核细胞（non-classical monocytes）;将人和小鼠血液树突状细胞也分为三种类型：浆细胞样(plasmacytoid dendritic cells)和两类髓样树突状细胞（myeloid dendritic cells)。目前该分类及其命名已被国际免疫学会批准,该命名将更好地促进科学家之间甚至是学科之间更广泛的交流。     

人外周血树突状细胞诱导及免疫学特性研究

[目的]从人外周血分离、纯化、扩增树突状细胞(DC),并对其形态学和免疫学特性进行初步探讨.[方法]从人外周血分离DC前体细胞(主要为CD14 细胞)用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)联合培养,诱导扩增成熟DC.观察DC形态、分析DC表型、核型及检测DC激发同种异体淋巴细胞增殖能力.[结果]分离的DC前体经rhGM-CSF和rhIL-4共同培养1周后,可获得大量成熟DC,扩增了24.5倍,纯度达90%以上.DC高表达分化抗原CD86、CD40、HLA-DR、CD83、CDIa,能强烈激活同种异体T淋巴细胞增殖.[结论]人外周血CD14 细胞经体外诱导培养,可以生成大量功能成熟的DC,从而为进一步开展DC的基础研究和临床应用打下基础.     

附子多糖诱导肝癌患者外周血树突状细胞分化成熟的实验研究

  目的  探讨附子多糖是否能在体外诱导肝癌患者外周血单核细胞向树突状细胞分化并成熟表达细胞表面分子, 为进一步研究附子多糖抗肿瘤作用机制奠定基础。  方法  取肝癌患者外周血体外分离单个核细胞, 去除淋巴细胞后进行培养, 实验组加入低、中、高3种不同浓度的附子多糖, 另设加入GM-CSF、IL-4和TNF-α的阳性对照组和不加任何诱导剂的阴性对照组, 共培养10d。其间进行细胞计数、倒置显微镜下动态观察细胞形态、MTT法细胞活力检测、扫描电镜细胞成像、流式细胞仪检测细胞表型(CD80、CD83、CD86)等检测。  结果  中浓度附子多糖组能够诱导肝癌患者外周血单核细胞分化为树突状细胞, 并促进细胞增殖, 高度表达CD80、CD83、CD86等共刺激分子和表面标记物, 与阳性对照组相比, 两组结果比较无明显差异, 与高、低浓度附子多糖组和阴性对照组结果相比有显著差异。  结论  适当浓度附子多糖能够在体外有效诱导肝癌患者外周血单核细胞分化为树突状细胞并表达成熟表型, 从而作为第二信号活化T淋巴细胞, 激发肿瘤免疫。      

肺癌患者外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定

目的 探索体外扩增成熟树突状细胞(dendritic cell，DC)的方法，并进一步鉴定Dc的形态及表型，为开展肿瘤临床生物治疗奠定基础。方法 取肺癌患者外周血，经淋巴细胞分离液分离得到DC前体细胞，加入生长因子DCGF诱导DC生成，并加入自体肿瘤相关抗原刺激。收集细胞用透射电镜观察，并用流式细胞仪测定细胞表型。结果 应用该法扩增细胞可以得到大量成熟DC。电镜观察DC具有典型的形态。流式细胞仪细胞表型测定CD80为81．8％，HLA—DR为98．3％，CD86为69．8%，CDla为19．7％，CD14为66．9．1％，CD80和HLA-DR较未成熟DC的表达明显增加。结论 肺癌患者外周血体外培养可成功地获得成熟的DC，进一步为肿瘤临床生物治疗奠定了基础。     

肿瘤干细胞-DC疫苗联合白介素-2治疗小鼠恶性黑色素瘤的研究

摘 要：［目的］ 研究荷载肿瘤干细胞（CSCs）抗原的树突状细胞疫苗联合白介素-2（IL-2）治疗小鼠恶性黑色素瘤的研究。［方法］ 利用Aldefluor染料从小鼠恶性黑色素瘤细胞系D5中分选出肿瘤干细胞,将CSCs制备成细胞裂解液加载在DC细胞上制备成CSCs-DC疫苗。将D5细胞接种至C57BL/6小鼠皮下建立小鼠恶性黑色素瘤模型,随机分成磷酸盐缓冲液组 (PBS)、白介素-2组（IL-2）、CSCs-DC疫苗组（CSCs-DC）、CSCs-DC疫苗联合白介素-2组（CSCs-DC+ IL-2）,并给予相应的治疗。测量并记录各组肿瘤大小变化和小鼠生存期,实验终点取小鼠脾脏,体外培养激活后利用ELISA法测定B细胞分泌IgG水平,LDH细胞毒性实验测定细胞毒性淋巴细胞(CTL)活性。 ［结果］ CSCs-DC+IL-2组肿瘤生长明显慢于PBS组,IL-2组及CSCs-DC组（P<0.05）。小鼠生存期CSCs-DC+IL-2组最长为58.33±1.67天,CSCs-DC组为51.67±0.33天,较IL-2组43.33±2.40天长,PBS组平均生存时间最短,为34.00±1.53天。CSCs-DC+IL-2组小鼠脾脏中B细胞分泌IgG水平和CTL活性最高,CSCs-DC组次之,IL-2组较CSCs-DC组和CSCs-DC+IL-2组低,但较PBS组高,差异有统计学意义（P<0.01）。［结论］CSCs-DC疫苗联合IL-2方案在治疗恶性黑色素瘤的小鼠模型中效果较CSCs-DC疫苗组和IL-2组好,与IL-2提高T/B细胞活性有关。     

三氧化二砷诱导恶性黑色素瘤A375和B16细胞凋亡的研究

目的: 研究不同浓度的三氧化二砷(As-2O-3)对恶性黑色素瘤人A-{375}细胞和小鼠B-{16}细胞的凋亡诱导作用,为As-2O-3治疗恶性黑色素瘤提供新的理论和实验依据.方法:用流式细胞术(FCM)检测A-{375}细胞和B-{16}细胞的凋亡诱导及杀伤作用:用不同剂量的As-2O-3(0.1 mmol*L{-1}、0.25 mmol*L{-1}和0.5 mmol/L{-1}),对小鼠进行腹腔注射(10 ml*kg{-1},连续注射10 d后,检测小鼠血清与心、肝、肾有关的生化指标.结果:As-2O-3浓度分别为5 μmol*L{-1}、10 μmol*L{-1}和20 μmol*L{-1}时,A-{375}和B-{16}细胞的凋亡率分别为11.85 %、55.51 %、54.90 %和9.81 %、26.45 %、9.93 %:As-2O-3诱导A-{375}和B-{16}细胞总的凋亡和坏死率分别为11.90 %、55.71 %、57.40 %和12.96 %、26.99 %、87.13 %;不同剂量的As-2O-3(0.1 mmol*L{-1}～0.5 mmol*L{-1})对小鼠肝、肾和心肌等功能无明显影响,与对照组各项指标无显著性差异(P>0.05).结论:不同浓度的As-2O-3能明显诱导恶性黑色素瘤A-{375}及B-{16}细胞凋亡和坏死,对A-{375}细胞的凋亡诱导作用强于B-{16}细胞.As-2O-3(0.1 mmol*L{-1}～0.5 mmol*L{-1})对小鼠肝、肾和心肌等功能无明显损伤.     

肿瘤患者自体血浆诱导树突状细胞的实验研究

目的探讨以实体瘤患者自体血浆替代胎牛血清诱导外周血单核细胞(PBMC)来源的树突状细胞(DC)的可行性,为临床应用提供实验依据。方法以血细胞分离机分离经动员的实体瘤患者外周血单核细胞(PBMC),在自体血浆(AP)、胎牛血清(FCS)等培养条件下,加入rhGM-CSF、rhIL-4和nrhTNF-α培养7~9 d诱导成为树突状细胞,进行细胞形态、表型及刺激T细胞增殖能力分析。结果在不同血清条件下,PBMC经诱导后均出现典型的树突状细胞形态和超微结构;但流式细胞术分析显示,以自体血浆培养的DC共刺激分子CD86为(74.09±0.92)%,MHCⅡ类分子HLA-DR为(91.73±1.96)%,显著高于FCS培养的DC;并且同种混合淋巴细胞反应结果显示AP-DC具有更高效的刺激T细胞活化增殖的能力。结论以AP代替FCS,实体瘤患者PBMC可被诱导为表型更成熟的DC;该方法既可去除异种蛋白干扰,又利于DC成熟,可作为临床应用DC的培养途径。     

宫颈癌患者外周血树突状细胞的体外扩增和鉴定

 目的 探索体外扩增宫颈癌患者外周血来源的成熟树突状细胞(denelritic cell，DC)的方法，并鉴定DC的形态、结构、表型及生物学活性。方法 淋巴细胞分离液分离宫颈癌患者外周血，得到DC前体细胞(PBMC)，以(3M-CSF、IL-4、TNF-α诱导培养。用光镜和透射电镜观察形态结构，流式细胞仪检测细胞表面特异性分子，MTT法测定DC刺激T细胞增殖的活性。结果 联合应用细胞因子可诱导扩增出源自宫颈癌患者外周血的成熟DC，具有典型形态特征，较高表达HLA-DR、CD1a、CD80，能强烈激发同种异体T细胞增殖反应。结论 宫颈癌患者外周血体外培养可成功获得成熟的DC，为开展宫颈癌临床免疫治疗奠定了基础。     

肺癌患者外周血树突状细胞的生物学特性研究

目的：探讨肺癌患者外周血来源的树突状细胞（dendritic cells, DC）生物学特性。方法：从肺癌患者外周血分离获得单个核细胞，用细胞因子GMCSF (100 μg/L)，IL4 (50 μg/L)体外培养诱导。凋亡肿瘤细胞负载24 h后加入TNFα（10 μg/L）或CD40激发型单抗于培养DC中，继续诱导3～4 d。分别测定DC的表型、DC摄取抗原能力；混合淋巴细胞反应（MLR）对T细胞增殖能力的测定；细胞计数和3HTdR掺入观察DC对T细胞的激发和扩增效应，并与健康志愿者外周血来源的DC进行比较。结果： 患者外周血单个核细胞和正常人外周血单个核细胞来源的DC均高表达CD1α，CD83，CD80，CD86和HLADR等DC的相关抗原和共刺激分子；患者的未成熟DC能有效摄取FITCDextran，经TNFα或CD40激发型单抗激发诱导后，成为成熟和有功能的DC,几乎完全失去对抗原的摄取能力，与健康人外周血来源DC组相比无明显差别(P>0.05)；患者单个核细胞来源的DC在体外具有激发自体和同种异体外周血T细胞增殖的能力。结论：肺癌患者的外周血来源单个核细胞可以诱导成为具有功能的成熟DC。     

胰腺癌病人外周血树突状细胞体外扩增及表型检测

胰腺癌 (pancreaticcarcinoma,PC)是常见的消化道恶性肿瘤之一 ,早期诊断率和手术切除率均较低。胰腺癌细胞对放化疗不敏感 ,以往的生物免疫治疗很不满意 ,因而胰腺癌的治疗十分棘手 ,预后十分恶劣 ,被列为二十一世纪医学顽固堡垒 ,所以 ,以提高胰腺癌总体疗效为目的规范化综合治疗成为当前研究的重要课题。树突状细胞(dendriticcells,DC)在综合治疗中显得特别重要 ,已知DC是人体内最具潜能的抗原提呈细胞 ,能提呈抗原给MHC Ⅰ (classⅠmajorhistocompatibilitycomplex ,MHC Ⅰ )类限制性CD8+ T淋巴细胞和MHC Ⅱ (classⅡmajorhisto…     

恶性黑色素瘤33例临床细胞学分析

本文对33例恶性黑色素瘤进行了临床资料及细胞形态学分析,归纳了其临床特点,在细胞学上把恶性黑色素瘤分为五型:即大上皮样型、小上皮样型、梭形型、肉瘤细胞型、无色素型,并描述了各型的形态特点,对本病的细胞学诊断有一定的参考意义。     

直肠恶性黑色素瘤1例

患者,男,52岁,因便中带血就诊于江苏省中医院,指检示距肛门3.0 cm处可及一约3.0 cm×4.0 cm肿块,肠镜病理示恶性肿瘤,于2005年12月18日行直肠Miles手术,病理示直肠下段近齿状线处恶性黑色素瘤,侵及肠壁全层,达肛门括约肌,上下切缘阴性,另送肠系膜肿块为淋巴结(1/1),肠系膜淋巴结(3/5).     

人外周血树突状细胞的体外诱导和鉴定

目的：建立从人外周血体外诱导扩增树突状细胞(DC)的方法：方法：从正常人外周血F1细胞分离单个核细胞，经三种细胞因子——重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(rh GM—CSF)、重组人白细胞介素4(rh IL-4)和重组人肿瘤坏死因子(rh TNFα)联合诱导培养，10天后收获细胞，利用光学显微镜、透射电镜观察其外部形态和细胞超做结构，流式细胞仪检测其细胞表面抗原，自体混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞的增殖活性：结果：培养收获了高纯度的DC，这些细胞表面有大量的不规则突起，核也呈不规则状，核仁小，核膜异染色质聚集，含有丰富的细胞器，如核糖体、内质网、溶酶体等；细胞表面高水平表达HLA—DR、CD1α、CD80、CD83和CD86；自体混合淋巴细胞反应表明诱导所得的DC具有很强的激发同种T细胞增殖的能力。结论：人外周血单个核细胞经细胞因子诱导培养可以得到大量的成熟DC。     

肺癌恶性胸腔积液中树突状细胞的诱导及生物学特性

肺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，发病率有逐年增高的趋势，常并发恶性胸腔积液，使病情加重，需要反复抽液。而恶性胸腔积液中含有丰富的免疫活性细胞，如能用于患者的免疫治疗，则既避免了细胞的大量丢失，又较化疗等传统方法有其自身的优势。[第一段]     

干扰素对恶性黑色素瘤治疗的现状

恶性黑色素瘤是一种恶性程度较高,且极易转移的恶性肿瘤,临床疗效很差。一般术后5年存活率为20～30％,放疗基本无效,药物疗效亦不明显。联合化疗的效果也不优于单用氨烯咪胺、亚硝基脲或顺铂,且毒性增加。药物治疗的有效病例缓解期和存活期分别为2月和4～6月。迄今新老化疗药物都难以改变本病的临床过程。自本世纪80年代初,很多学者试用干扰素治疗本病,初步认为有较好的抗瘤性,且获得一定临床效果。一、临床效果经数年Ⅰ、Ⅱ期临床试     

IFN-α联合GM-CSF诱导胃癌患者外周血单个核细胞分化为树突状细胞

目的： 探索干扰素-α（interferon-α,IFN-α）联合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF）体外诱导胃癌患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）向树突状细胞（dendritic cell,DC）分化的可能性。 方法： 10 例胃癌患者PBMC分别用GM-CSF 100 ng/ml联合IFN-α 500 IU/ml（命名为IFN-α DC） 或GM-CSF 100 ng/ml联合50 ng/ml IL-4（命名为IL-4 DC）体外培养,然后用CD40L、LPS诱导DC成熟。Giemsa染色法观察IFN-α DC和IL-4 DC的形态,流式细胞术分析IFN-α DC和IL-4 DC表面CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达情况,同种异体混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLR）检测不同的成熟DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。 结果： IFN-α DC和IL-4 DC均呈现典型DC形态。IFN-α DC和IL-4 DC分别在诱导第3天和第5天时,细胞表面CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR表达达到较高水平,成熟IFN-α DC表面CD83\[（78.25±15.36）% vs （50.14±10.24）%,P<0.05\]和CD86\[（84.84±10.12）% vs （62.93±15.12）%,P<0.05\]的表达均高于成熟IL-4 DC。成熟IFN-α DC刺激异体T淋巴细胞增殖能力强于未成熟IFN-α DC（P<005）。在DC与T细胞数量比为1∶40和1∶20时,成熟IFN-α DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力明显强于成熟IL-4 DC\[（39.43±9.21）% vs （27.34±10.63）%,（60.31±7.86）% vs （48.63±6.25）%;均P<0.05\]。 结论： 相比常用的IL-4联合GM-CSF诱导方法,IFN-α联合GM-CSF可以在更短时间内将胃癌患者PBMC诱导成具有更强刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的DC细胞,这可能与其表面CD83和CD86表达增高有关。