BHRF1基因对丝裂霉素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡影响

目的探讨EB病毒早期基因BHRF1的表达对丝裂霉素诱发胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-BHRF1表达载体,应用脂质体转染法将BHRF1表达载体转染胃癌细胞系SGC7901,MTT法检测细胞生长情况。实验分为细胞对照组、空载体对照组和目的基因转染组,细胞对照组仅接种SGC7901细胞,空载体对照组将pcDNA3.1空载体转染入SGC7901细胞中,目的基因转染组将重组质粒pcDNA3.1-BHRF1转染入SGC7901细胞中。分别培养24、48和72 h后,用浓度为30 mg/L的丝裂霉素处理,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色方法检测凋亡小体。结果 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒构建成功。MTT实验显示目的基因转染能明显拮抗由于丝裂霉素作用导致的细胞生长抑制;BHRF1转染＋丝裂霉素处理组凋亡小体明显少于对照组,细胞凋亡率明显低于对照组,差异均有统计学意义（F=6 250.510,q=56.992、51.613,P〈0.01）。结论 BHRF1基因具有明显拮抗丝裂霉素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的作用。     

WT1基因转染增加白血病细胞凋亡的实验研究

为了探讨WT1基因异构体对急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4凋亡的影响及其分子机制,应用电穿孔的方法将携带WT1基因异构体WTA（-17AA/-KTS）全长cDNA的真核表达载体及其对照质粒pCB6^＋转导白血病细胞株NB4,建立WT1基因异构体表达比例改变的单克隆细胞株;用MTT、形态学观察、DNA凝胶电泳、An-nexin V结合力测定等方法观察WT1基因异构体表达比例的转变对白血病细胞NB4诱导凋亡的影响;用RT-PCR方法检测细胞中p21、p53、bcl-2、bcl-XL、和c-myc等凋亡相关基因表达的改变.研究结果表明,MTT显示NB4/WTA细胞对As2O3的IC50值较对照组明显降低;经As2O3作用48小时,NB4/WTA细胞Annexin V结合力较对照组细胞升高,出现更为典型的凋亡形态学改变;在DNA凝胶电泳可见更为明显的DNA梯形条带,RT-PCR检测提示NB4/WTA细胞p21、c-myc基因的表达较对照组高,bcl-2表达下降,p53、bcl-XL基因表达无明显改变.结论：增加外源性WT1基因异构体WTA的表达从而将WT1基因异构体表达的比例由＋17AA/＋KTS优势型转变为-17AA/-KTS优势型,能使NB4细胞对As2O3引起的凋亡更为敏感,这些改变可能与p21、c-myc等基因的表达上调和bcl-2基因的表达下调有关.     

Fas基因在rhG-CSF诱导白血病细胞凋亡过程中的作用

目的探讨了Ｆａｓ基因是否参与重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧＣＳＦ）对白血病细胞的诱导凋亡过程。方法利用脂质体（ＤＯＴＡＰ）介导的基因转染技术将Ｆａｓ基因转入ＨＬ６０细胞中,并经原位杂交、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ及流式细胞术（ＦＣＭ）证实已成功建立了Ｆａｓ高表达的ＨＬ６０细胞株,用ＦＣＭ对Ｆａｓ基因在ｒｈＧＣＳＦ诱导白血病细胞凋亡过程中的作用进行了探讨。结果相同浓度的ｒｈＧＣＳＦ作用相同时间后转染的ＨＬ６０细胞凋亡率较未转染的ＨＬ６０细胞凋亡率明显增加,且随ｒｈＧＣＳＦ作用时间延长,Ｆａｓ在ＨＬ６０细胞中的表达逐渐增加。结论Ｆａｓ基因是凋亡诱导基因,ｒｈＧＣＳＦ诱导白血病细胞凋亡依赖Ｆａｓ径路传递凋亡信号。     

RNA干扰MBP-1基因对胃癌细胞SGC-7901增殖影响

目的：探讨 MBP-1（c-myc promter binding protein 1,MBP-1）基因表达沉默对胃癌细胞株 SGC-7901细胞增殖影响。方法实验分3组：空白对照组（未转染胃癌细胞）、阴性对照组（转染错义序列）和干扰组（转染 MBP-1 shRNA）。设计2条针对MBP-1基因的小干扰 RNA 片段及1条阴性对照 siRNA,并构建入 pSIREN-retroQ 质粒。将构建的重组 pSIREN-retroQ 质粒通过 Lipofectamine 2000脂质体转染胃癌 SGC-7901细胞,嘌呤霉素筛选稳转株细胞。Real time PCR 和 Western blot 分别检测MBP-1表达。MTT 法对 MBP-1干扰后 SGC-7901细胞增殖进行检测。结果通过 PCR 扩增阳性克隆及测序,说明已成功构建MBP-1干扰及对照重组 pSIREN-retroQ 质粒。通过 Lipofectamine 2000脂质体将重组质粒转染胃癌 SGC-7901细胞,并通过嘌呤霉素筛选2周,说明已成功构建 MBP-1干扰及对照 SGC-7901稳转株细胞。Real time PCR 检测,干扰组 MBP-1 mRNA 相对表达量与空白对照组相比显著下调（P ＜0.05）。Western blot 检测 MBP-1蛋白表达,干扰组 MBP-1表达量与空白对照组相比也都显著下调。MTT 法检测结果表明,MBP-1干扰组细胞在48、72、96和120 h 增殖能力比空白对照组都有显著的升高（P ＜0.05）。结论下调 MBP-1基因表达能明显促进胃癌细胞 SGC-7901的增殖,从而为胃癌基因治疗提供了新靶点。     

三氧化二砷诱导胃癌细胞凋亡及其机制的探讨

目的观察氧化砷对胃癌细胞是否具有凋亡诱导作用,并进一步研究bcl-2基因家族和bax在此过程的表达作用,以了解三氧化二砷(AS2O3)作用于胃癌细胞的机制。方法AS2O3作用于胃癌细胞株,用Annexin-v荧光探针、流式仪及免疫组织化学等方法检查bcl-2和bax的表达。结果经AS2O3作用的胃癌细胞bcl-2基因表达水平降低,bax基因表达水平增加。结论氧化砷可诱导胃癌细胞发生凋亡。     

PLK1基因缄默在K562细胞凋亡中的作用

目的观察缄默PLK1基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对K562细胞内PLK1表达和细胞凋亡的影响,探讨PLK1在白血病发病中的作用,寻找更为有效的白血病治疗途径。方法设计合成针对PLK1基因1416~1436位点的shRNA片段,并将其克隆于绿色荧光蛋白的表达载体pEGFP-H1中,命名为pEGFP-H1/PLK1。通过电穿孔转染法将其导入K562细胞中,分为对照组、pEGFP-H1空载体转染组和pEGFP-H1/PLK1shRNA重组质粒转染组,转染后24,48h,分别通过RT-PCR和Western blot检测各组细胞PLK1基因和蛋白水平的变化,以MTT方法测各组细胞的增殖活性,比色法检测各组细胞的半胱天冬酶3(caspase-3)蛋白酶活性,并通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡和G2/M期转变情况。结果PLK1mRNA相对水平(与内参的灰度比值)对照组为1.25±0.07,空载体转染24,48h组分别为1.21±0.08和1.23±0.09,shRNA重组质粒转染24,48h组分别为0.52±0.04和0.25±0.02,shRNA重组质粒转染组较其他两组明显降低(P<0.01)。各组细胞PLK1的蛋白水平变化趋势与PLK1mRNA表达相似。相应地,对照组、空载体转染48h组、shRNA重组质粒转染24,48h组的凋亡率分别为(8.3±0.6)%、(8.7±0.7)%、(49.7±3.8)%和(82.3±6.9)%,后两者与前两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。此外,与对照组和空载体转染组相比,shRNA重组质粒转染组的细胞增殖能力明显下降(P<0.05),且位于G2/M期的细胞较对照组和空载体转染组显著增加。以上结果均于转染后48h时较明显(P<0.05)。结论构建的shRNA能明显抑制转染细胞PLK1的表达和增殖,并可促进转染细胞的凋亡,并使停留于G2/M期的细胞显著增加。     

基因fas的表达对细胞色素C诱导HL-60细胞凋亡的影响

本研究观察fas基因表达的变化对细胞色素C诱导急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60细胞凋亡的影响，并探讨细胞色素C诱导HL-60细胞凋亡的机制。将体外培养的HL-60细胞分成6组，细胞色素C终浓度分别为0（对照组）、9．375、18．75、37．5、75、150mg／L，用流式细胞仪检测细胞色素C对HL-60细胞的凋亡作用．用RT—PCR和Westernblot检测以凋亡为主的HL-60细胞中fas的表达水平。结果表明：细胞色素C终浓度分别为0、9．375、18．75及37。5mg／L时HL-60细胞是以凋亡效应为主，fas基因的mRNA和蛋白的表达随着细胞色素C浓度的增高而增高，当细胞色素C浓度为75mg／L、150mg／L时，HL-60细胞是以坏死效应为主。结论：细胞色素C能够上调fasmRNA及其蛋白的表达，从而可以诱导HL-60细胞的凋亡。     

EB病毒BHRF1基因及其抑制细胞凋亡功能

BHRF1是EBV基因组中具有抑制细胞凋亡功能的基因片段，属Bcl-2基因家族，本文阐述了BHRFI基因及其蛋白产物的特征、表达和抑制凋亡功能，对其在EB病毒致病机理的认识及有关疾病的防治等方面的重大意义进行了分析。     

bcl-2基因转染阻断Fas介导的Jurkat细胞凋亡

目的：通过ｂｃｌ２阻断Ｆａｓ介导的细胞凋亡了解ｂｃｌ２基因在淋巴瘤癌变过程中逃避机体免疫监控的作用机制。方法：应用基因重组技术重组ｐＬＸＳＮｂｃｌ２，采用电穿孔法将其与空载体分别转染包装细胞系ＰＡ３１７，将阳性克隆病毒上清感染人Ｔ淋巴瘤细胞株Ｊｕｒｋａｔ，用Ｇ４１８筛选，其阳性克隆进行免疫组化检测，应用抗Ｆａｓ抗体诱导细胞凋亡来模拟细胞毒Ｔ细胞的杀伤机制，观察ｂｃｌ２在淋巴瘤逃避免疫机制中的作用。结果：转染人ｂｃｌ２基因的Ｊｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔｂｃｌ２）细胞较对照Ｊｕｒｋａｔ及转染空载体Ｊｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔｎｅｏ）细胞，ｂｃｌ２表达量明显增加，而Ｆａｓ基因表达量无明显变化。其Ｊｕｒｋａｔｂｃｌ２能明显耐受抗Ｆａｓ抗体诱导的细胞凋亡。结论：人ｂｃｌ２基因在淋巴瘤中过量表达，能部分阻断抗Ｆａｓ抗体诱导的细胞凋亡，ｂｃｌ２基因过量表达可能是淋巴瘤癌变过程中逃脱机体免疫监控的机制之一。     

NM-3诱导裸鼠体内人胃癌细胞的凋亡机理

目的:探讨新的血管生长抑制剂NM- 3对体内人胃癌细胞凋亡的作用。方法:建立人胃腺癌裸鼠皮下异体移植模型。移植后第1周开始腹腔注射NM- 3,1周3次,剂量为10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg,分别联合卡铂5mg/kg,1周2次;并与生理盐水对照组,NM -3或卡铂单独治疗比较(应用NM 3 5 周,卡铂3 周)。移植后第7 周处死裸鼠,测量肿瘤大小,计算抑瘤率,FCM法分析肿瘤细胞凋亡指数(AI)。结果:单用NM- 3剂量分别为10mg/kg、20mg/kg及40mg/kg时,肿瘤的平均重量分别为1220±116.85mg、1041±143.51mg和767.5±140.11 mg,显著低于生理盐水对照组的肿瘤平均重量1754±144.18mg(P<0.05)。单用卡铂组的抑瘤率为5.6%,对人胃癌没有明显抑制作用。当单用NM 3 剂量10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg时,抑瘤率分别为30.4%、40.6%、56.2%,相对于对照组有明显的抑瘤作用(P<0.05),而且显著高于卡铂组抑瘤率5.6%。NM 3 3个剂量组联合卡铂治疗的AI分别是:5.66%±0.65%、8.98%±1.43%、21.66%±2.96%;生理盐水对照组为1.37±0.19%,卡铂组为1.85±0.22%。结论:NM 3能诱导体内人胃癌细胞的凋亡,抑制胃癌的生长。     

NM-3对体外胃癌细胞株SGC-7901的作用和机制探讨

目的：研究新小分子血管生成抑制剂NM-3对体外培养的胃癌SGC79n1细胞的作用，并探讨NM-3对胃癌抑制作用的机理。方法：将体外培养的人胃癌细胞株SGC7901用NM-3、卡铂及生理盐水处理，观察细胞的生长规律。并在不同时间段以流式细胞仪检测细胞的凋亡率，分析细胞周期分布。结果：将药物作用后1h，2h，3h，6h，12h，24h，48h，72h的胃癌SGC7901细胞通过流式细胞仪检测胃癌细胞早期凋亡率及凋亡峰。发现NM-3组（1mol／L）在72h内与对照组比较细胞早期调亡率无显著差异（P2〉0．05）；经0．1mol／L卡铂处理的细胞组早期即可诱导发生明显的凋亡，并随着时间的延长调亡率增高，呈时间依赖性，与对照组相比较，有显著差异（P〈0．05）。对细胞周期分布的分析中，NM-3组（1mg／L）Sub-G1峰与对照组比较无显著差异（P〉0．05）。而卡铂能使细胞周期发生相对变化，随着药物作用时间的增加，Go／G1期细胞增多，而S期覆G2／M期细胞则相应减少。结论：NM-3对胃癌组织的生长抑制主要是通过作用于血管内皮细胞，减少肿瘤新生血管生成。而对体外培养的人胃癌细胞无直接诱导其凋亡的作用。     

沉默Caveolin-1基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨沉默 Caveolin-1（Cav-1）基因对人膀胱癌细胞株5637增殖和凋亡的影响。方法通过siRNA转染人膀胱癌细胞株5637（沉默组）,以转染 FAM-siRNA为阴性对照组,未转染细胞为正常对照组。Re-al-time PCR法检测Cav-1基因沉默的效率,CCK-8法检测各组细胞的增殖情况,流式细胞术检测各种细胞的凋亡情况。结果 siRNA转染可显著降低人膀胱癌细胞株5637中 Cav-1 mRNA 的表达水平。沉默组细胞的增强能力明显减低,而细胞凋亡率明显升高（均P＜ 0.05）。结论沉默Cav-1基因可抑制人膀胱癌细胞株5637的细胞增殖并促进细胞凋亡。     

转基因过表达Clusterin对秀丽线虫毒性作用的研究

目的:探讨转基因过表达Clusterin对秀丽线虫(C.elegans)的毒性作用。方法:采用野生型N2秀丽线虫作为研究对象,构建转基因过表达Clusterin质粒,通过显微注射获得过表达Clusterin和绿色荧光蛋白(GFP)的转基因线虫。将野生型N2秀丽线虫和过表达Clusterin线虫同步化后,观察上述两组线虫的寿命和成虫2 d后热休克的存活情况。结果:与野生型N2秀丽线虫比较,转基因过表达Clusterin线虫的寿命明显缩短(P<0.01);在热休克2 d后,转基因过表达Clusterin线虫的存活明显缩短(P<0.05)。结论:转基因过表达Clusterin对秀丽线虫具有明显的毒性作用,在热休克2 d后毒性加重。     

大葱提取物抗胃癌作用的研究

目的观察大葱提取物对体外培养的人胃癌细胞MGC803诱导分化和凋亡的影响，探讨大葱抗癌的作用机制及抗癌的有效成分。方法应用流式细胞仪（FCM）和电镜技术，检测细胞分化和凋亡。结果FCM检测显示：大葱提取物可诱导胃癌细胞分化和凋亡；DNA直疗图上出现二倍体峰及亚二倍体峰凋亡峰。电镜观察癌细胞出现分化和凋亡形态学变化。结论大葱提取物能明显抑制体外培养的胃癌细胞生长增殖，诱导胃癌细胞分化和凋亡，是其抗癌作用的主要机制。其起主要作用的部分为大葱的脂溶性（大葱油）部分，水溶性部分作用微弱。     

FHIT基因异常转录与胃癌相关性的研究

目的研究胃癌组织中脆性组氨酸三位体(fragile histidine triad,FHIT)基因转录的改变。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对43例胃癌组织及其相应癌旁非癌组织进行FHIT基因cDNA检测。结果除5例胃癌、2例非癌组织缺失FHIT基因野生型cDNA外,其余标本均扩增出FHIT基因野生型cDNA片段。22例(51.2％)胃癌、9例(20.9％)的癌旁非癌组织扩增出FHIT基因异常cDNA片段,二者统计学差异有显著性(P＜0.05)。结论FHIT基因的异常转录可能与胃癌的发生有关。     

康莱特注射液对人胆管癌细胞 RBE 和 HCCC9810生长、凋亡、迁移的影响

目的:探讨康莱特注射液对人胆管癌细胞 RBE 和 HCCC9810 生长、凋亡、迁移的影响。 方法:使用康莱特注 射 液 处 理 人 胆 管 癌 细 胞 RBE 和 HCCC9810 , 运 用 CCK-8 法 检 测 康 莱 特 注 射 液 对 人 胆 管 癌 细 胞 RBE 和HCCC9810 的增殖情况,流式细胞仪检测两者的凋亡率, Transwell 实验检测两者的迁移能力,通过 Western%Blot 检测两者信号通路中关键蛋白 Caspase-3 、 Bcl-2 和 Bax 的表达情况。 结果:较之空白对照组,随着康莱特药物作用时间的延 长 ,两 者 细 胞 的 生 长 增 殖 程 度 逐 渐 受 到 抑 制 ( P <0.05 ),在 作 用 96%h 时 达 到 较 好 抑 制 状 态 ; Transwell 实 验 结 果 显示 , 人 胆 管 癌 细 胞 RBE 和 HCCC9810 经 康 莱 特 处 理 后 迁 移 数 量 减 少 ( P <0.05 ); 实 验 组 人 胆 管 癌 细 胞 RBE 和HCCC9810 凋 亡 率 明 显 增 加 ( P<0.05 ), 两 者 信 号 通 路 中 关 键 蛋 白 Caspase-3 、 Bax 蛋 白 表 达 明 显 上 调 ( P<0.05 ),Bcl-2 蛋白表达下调( P<0.05 )。 结论:康莱特注射液可以抑制人胆管癌细胞 RBE 和 HCCC9810 的生长和迁移能力,促进其凋亡,机制可能与其能上调凋亡信号通路关键蛋白 Caspase-3 、 Bax 和下调 Bcl-2 蛋白表达有关。     

外源性线粒体融合素基因-2转染对肝癌细胞体外生物学行为的影响

目的 研究外源性线粒体融合素基因-2(mitofusin-2 gene，mfn2)对肝癌细胞株HepG2体外生物学行为的影响。 方法 基因重组构建并鉴定mfn2真核表达质粒pEGFPmfn2，用脂质体将质粒转染培养人肝癌细胞株HepG2，经G418筛选阳性细胞克隆，逆转录-聚合酶链反应检测转染后细胞mfn2 mRNA的表达水平；Western-blot检测线粒体融合蛋白的表达，四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测mfn2对HepG2细胞增殖的影响，Annnexin-V/PI双标流式细胞术检测转染细胞凋亡的变化。结果 重组真核表达质粒pEGFPmfn2经限制性内切酶双酶切，电泳后显示约约2.3kp的mfn2片段和4.7kb的pEGFP-N2¬载体片段。RT-PCR及Western-blot显示转染组有mfn2基因mRNA及其蛋白表达。MTT实验提示转染mfn2基因后，HepG2细胞增殖受到抑制；流式细胞分析显示转染组与转染空质粒组和空白对照组相比可促进细胞凋亡。结论 成功构建了pEGFPmfn2真核表达质粒，外源性mfn2基因可抑制肝癌细胞的增殖，并可诱导肝癌细胞凋亡。     

新基因Mip1的过表达对去血清培养条件下C2C12细胞生长周期的影响

【目的】建立稳定表达新基因Mip1的细胞株,并探讨正常和应激状态下Mip1过表达对细胞生长周期的影响。【方法】脂质体转染Mip1的真核表达质粒于C2C12细胞中,G418筛选阳性克隆,Western blot鉴定高表达克隆,流式细胞术检测正常和去血清状态下Mip1转基因细胞株和空栽体转基因细胞株的生长周期分布情况。【结果】建立了稳定高表达新基因Mip1的C2C12细胞株,并发现Mip1的过表达可减轻去血清对C2C12细胞的生长抑制作用。[结论]Mip1在应激状态下可能具有促细胞生长的功能。     

Xbp-1基因沉默对硼替佐米诱导人多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响

本研究旨在探讨xbp-1基因沉默对硼替佐米诱导骨髓瘤细胞株NCI-H929(H929)凋亡的影响。通过小发夹RNA(shRNA)干扰xbp-1基因表达,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测靶细胞凋亡率,采用Wes-ternblot检测XBP-1蛋白水平。结果表明:通过慢病毒载体PLL3.7介导的xbp-1 shRNA表达,能有效抑制H929细胞XBP-1蛋白表达,xbp-1 shRNA表达细胞的凋亡率显著高于对照组[(10.13±0.61)%vs(2.5±0.2)%,p0.05];经硼替佐米处理后,xbp-1基因功能缺陷的H929细胞的凋亡率显著高于空载体组[(45.07±1)%vs(2.73±0.25)%,p0.05]。结论:xbp-1基因沉默能够显著增强硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞的促凋亡活性。