人乳头瘤病毒11型基因组DNA在HaCaT株中的转染

目的 探讨转染与筛选技术获取稳定携带有HPV11基因组DNA的细胞的可能性。方法 对含有pBR322.HPV11质粒的大肠杆菌培养扩增,然后进行质粒的提取与纯化,并用限制性内切酶BamHⅠ切割下HPV11全长基因。低熔点琼脂糖回收后,用T4 DNA连接酶进行线状DNA的自身环化,再与pIK-neo质粒、用Lipofectamine试剂共转染HaCaT细胞。通过G418筛选阳性细胞克隆,将阳性克隆细胞合并与培养扩增后,用FQ-PCR技术检测细胞内HPV11DNA的存在,用巢式RT-PCR技术检测HPV11 E1^E4 mRNA的表达。结果 HPV11型基因组DNA转染至HaCaT细胞后,经G418筛选约2周,培养皿内即可见对G418抵抗的阳性细胞克隆出现,其形态与普通HaCaT细胞相似。用FQ-PCR在筛选后的HaCaT细胞中检测到HPV11DNA的存在,平均病毒DNA载量为（15.9 ± 16.8）拷贝/细胞。传代3次后细胞内病毒DNA无丢失,载量为（23.9 ± 1.1）拷贝/细胞。与未传代细胞相比,二者间差异无统计学意义（t = -0.822,P > 0.05）。巢式RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV11 E1^E4 mRNA表达的特异性628 bp条带。结论 HPV11基因组DNA可通过脂质体转染法成功导入HaCaT细胞内,通过筛选可获得阳性细胞,且经3次传代后HPV11DNA仍然存在。     

整合素α6单克隆抗体对人乳头瘤病毒6/11病毒颗粒体外感染HaCaT细胞的影响

目的 探讨整合素α6单克隆抗体(GoH3)对人乳头瘤病毒(HPv)6/11病毒颗粒(VP)体外感染HaCaT细胞的影响.方法 ①采用4组不同浓度的HPV6/11 VP体外感染HaCaT细胞;②加入6组不同浓度的GoH3后,以106拷贝/ml HPV6/11 VP体外感染HaCaT细胞;③加入稀释倍数为1∶100的GoH...     

人乳头瘤病毒体外研究的技术及进展

人乳头瘤病毒的体外研究技术在人乳头瘤病毒研究中占有重要地位。通过人乳头瘤病毒的人工感染及感染细胞分化诱导技术,目前已可在体外完成多种型别人乳头瘤病毒的复制周期。常用的人乳头瘤病毒体外研究技术、人乳头瘤病毒复制与转录调控、人乳头瘤病毒与宿主细胞相互作用、人乳头瘤病毒感染的干预与治疗等热点问题引起人们的关注。     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

人乳头瘤病毒体外研究的技术及进展

人乳头瘤病毒的体外研究技术在人乳头瘤病毒研究中占有重要地位.通过人乳头瘤病毒的人工感染及感染细胞分化诱导技术,目前已可在体外完成多种型别人乳头瘤病毒的复制周期.常用的人乳头瘤病毒体外研究技术、人乳头瘤病毒复制与转录调控、人乳头瘤病毒与宿主细胞相互作用、人乳头瘤病毒感染的干预与治疗等热点问题引起人们的关注.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

表达人乳头瘤病毒6b和11型E6/E7基因的小鼠肿瘤细胞株的建立

目的 构建含有人乳头瘤病毒(HPV)6b和11型E6/E7基因的表达质粒和建立这些基因的转染细胞株。方法 分别将HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7克隆于含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.1,经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性克隆,荧光显微镜观察,RT-PCR鉴定mRNA转录。结果 通过酶切鉴定和基因测序证实,构建质粒中目的基因片段序列完全正确。转染后荧光显微镜下可观测到B16细胞发出绿色荧光。以G418筛选的抗性细胞克隆提取RNA并经RT-PCR扩增出与目的基因大小一致的基因片段。结论 建立的小鼠肿瘤细胞B16表达HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7基因。提示转染的细胞株可移植于小鼠,利于体内研究这些基因的生物学作用和免疫学机制。     

不同RNA干预技术对人乳头瘤病毒11型E7基因的沉默作用

目的探讨RNA干预技术的两种形式在体外对人乳头瘤病毒（HPV）11型E7基因的沉默作用。方法化学合成1对小片段干扰RNA（siRNA-11E7）、同时构建3个短发夹状小RNA（shRNA）表达质粒（pRNAT-11E71^#、2^#、3^#），分别转染稳定表达HPV11E7的C57BL／6小鼠黑素瘤细胞系B16细胞株，采用实时荧光定量PCR技术检测细胞转染前后靶基因mRNA的表达水平。结果siRNA-11E7转染细胞后6、12、24、48、72、96、120h对靶基因表达的抑制率分别为12.60％、31.41％、41.93％、42.93％、74．35％、32.71％、29．00％；最佳作用浓度为25nmol／L（抑制率70.06％），最低作用浓度可至3.13nmol／L（抑制率47.00％）。以0．4μg pRNAT-11E71^#、2^#、3^#及上述3个质粒等量混合转染细胞72h后对靶基因表达的抑制率分别达44．52％、59．26％、89.62％、54.09％，阴性质粒无干预作用。pRNAT-11E73^#作用6、12、24、48、72、96、120h对靶基因表达抑制率分别为0、17．50％、40．90％、42．40％、61．90％、51．50％、0％；最佳作用剂量0．2μg。结论siRNA及shRNA表达载体均可在体外安全高效地沉默HPV11E7基因的表达，其干预作用存在一定的量效性和时效性，且可能存在最佳作用浓度（剂量）和最佳作用时间。     

聚合酶链反应检测人乳头瘤病毒的进展

聚合酶链反应以其特异、敏感和快速准确等特点已广泛用于人乳头瘤病毒感染的临床诊断及流行病学研究。以此为基础 ,结合核酸杂交、酶谱分型、DNA芯片等技术 ,使人乳头瘤病毒研究手段日益增多 ,检测方法逐渐完善。就聚合酶链反应检测人乳头瘤病毒的进展作一综述     

5-ALA-PDT法在HPV11.HaCaT细胞模型中的应用

目的：确定光动力疗法(5-ALA-PDT)对携带HPV11全基因组的HaCaT细胞(HPV11.HaCaT)模型的影响。方法：HPV11.HaCaT细胞培养传代后分别用不同浓度5-ALA(0.375、0.75、1.5、3mM),或不同剂量红光(10、20、40J/cm2),或不同浓度5-ALA结合不同剂量红光处理。用MTT法检测细胞增殖,实时荧光定量PCR测定HPV11早期基因E5、E6和E7 mRNA的表达。结果：0.75mM以上浓度的5-ALA联合20或40J/cm2红光,细胞存活率均在50%以下(P<0.01)。0.375mM 5-ALA联合20J/cm2红光能明显降低HPV11E6和E7 mRNA表达,相对表达量为0.28和0.26(P<0.01),而0.75mM 5-ALA联合20J/cm2红光处理对HPV11 E6和E7 mRNA表达影响不明显,相对表达量为0.85和1.46(P>0.05),但以上两种处理条件对HPV11 E5 mRNA的表达均无明显影响。结论：5-ALA-PDT法应用于HPV11.HaCaT细胞模型能抑制HPV11.HaCaT细胞增殖,并能降低该细胞中HPV11 E6、E7mRNA的表达。     

与黑素结合的羟氯喹对长波紫外线诱导HaCaT细胞死亡的光保护机制研究

目的:观察与黑素结合的羟氯喹(HCQ)对细胞内活性氧基(ROS)的清除以及对长波紫外线(UVA)诱导人角质形成细胞(HaCaT细胞)凋亡和坏死的保护.方法:自一株产黑素的嗜麦芽假单胞菌AT18的培养液中分离纯化获得细菌衍生黑素,在体外与不同浓度HCQ结合后处理培养的HaCaT细胞,随后给予半数致死剂量(30 J/cm2)的UVA照射.照射12 h后,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞存活率;碘化丙啶(PI)染色结合流式细胞仪检测细胞凋亡率;采用二氯荧光素二酯(DCFH-DA)标记法测定细胞内ROS水平.结果:低浓度(10、50 μmol/L)HCQ与黑素结合后能明显保护HaCaT细胞抵抗半数致死剂量(30 J/cm2)UVA照射,尤其是50 μmol/L HCQ 50 mg/L黑素处理组细胞存活率较单纯黑素和单纯HCQ组显著增高(P＜0.05);相反,用高浓度(250 μmol/L)HCQ与黑素结合处理细胞,细胞存活率较单纯黑素和单纯HCQ组减低.与单纯黑素和单纯HCQ组相比,10 μmol/L HCQ与黑素结合还能显著提高细胞内ROS的清除能力和抑制UVA'诱导HaCaT细胞凋亡.结论:低浓度HCQ与黑素结合能协同增强黑素对细胞内ROS的清除,抑制UVA诱导的皮肤细胞凋亡,这些作用很可能关系到治疗皮肤型红斑狼疮时抗疟药的抗光敏机制.     

HPV-11 E7重组腺病毒体外转染树突细胞对其功能的影响

目的 研究腺病毒载体介导HPV-11 E7基因转染树突细胞(DC)对其表型和功能的影响。方法 用最佳感染滴度(MOI)重组腺病毒pAD-E7转染成熟DC,流式细胞仪检测转染前后DC表型变化,并用~3H-TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种淋巴细胞增殖的能力及ELISA检测DC、T细胞共同培养上清中细胞因子的水平。结果 MOI 100为pAD-E7转染DC最佳滴度,pAD-E7转染成熟DC前后对细胞表面的特征性表型CD1a、CD83及CD40、HLA-DR无影响,转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,能刺激T细胞分泌大量IFN-γ、IL-12。结论 pAD-E7转染成熟DC对其功能无明显影响,转染后的DC与T细胞共孵育能诱导T细胞向Th1细胞极化。     

UVA辐射对HaCaT细胞分泌和表达趋化因子CXCL11/I-TAC的影响

目的 探讨UVA对IFN-γ和TNF-α诱导的HaCaT细胞分泌和表达CXCL11/I-TAC的影响。方法 用ELISA检测不同剂量UVA（2、4、8 J/cm2）照射后培养24 h的HaCaT细胞上清中CXCL11/I-TAC分泌水平。用实时荧光定量PCR检测CXCL11/I-TAC mRNA表达水平。结果 正常培养的HaCaT细胞仅分泌和表达微量的CXCL11/I-TAC蛋白或mRNA。当用10 μg/L的IFN-γ和TNF-α联合刺激后,HaCaT细胞分泌或表达的CXCL11/ I-TAC显著升高。UVA在2、4、8 J/cm2呈剂量依赖性抑制CXCL11/I-TAC的分泌或表达。结论 UVA照射抑制角质形成细胞分泌和表达CXCL11/I-TAC,从而在一定程度上降低了对Th1/Tc1细胞的趋化。     

尖锐湿疣组织中人乳头状瘤病毒感染与生存素和增殖细胞核抗原的表达

目的 探讨人乳头状瘤病毒（HPV）6／11、16／18在尖锐湿疣（CA）组织中的感染情况及其与生存素和增殖细胞核抗原（PCNA）表达的关系。方法 HPV分型PCR检测试剂盒检测HPV6／11、16／18在41例尖锐湿疣组织、23例正常皮肤组织中的表达情况，同时用SP免疫组化法检测生存素及PCNA蛋白的表达。结果 ①正常对照组未检测到HPV6／11、16／18感染；HPV6／11在尖锐湿疣中的感染率为87．80％（36／41），与正常对照组比较差异有统计学意义（P〈0．005）；HPV16／18在尖锐湿疣中的感染率为19．51％（8／41），与正常对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。②生存素和PCNA在尖锐湿疣组织中的阳性率分别为53．66％（22／41）和87．80％（36／41），在正常皮肤组织中的阳性率分别为8．70％（2／23）和47．83％（11／23）。尖锐湿疣组中生存素和PCNA表达的阳性率与正常对照组比较差异均有统计学意义．且尖锐湿疣中两者的阳性表达呈正相关（P=0．009）。③生存素及PCNA在有HPV6／11感染患者中的表达明显强于无HPV6/11感染患者。结论 HPV感染可上调生存素与PCNA的表达。     

血管内皮生长因子受体家族在HaCaT细胞中的表达

目的 探讨血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族在角质形成细胞系HaCaT细胞的表达。方法 RT-PCR法检测HaCaT细胞中VEGFR家族中VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3及neuropilin (NRP)-1、NRP-2的mRNA表达,蛋白免疫印迹法检测VEGFR家族蛋白质的表达,同时免疫荧光法定位VEGFR家族在HaCaT细胞中的表达情况。结果 RT-PCR发现VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3及NRP-1、NRP-2 mRNA在HaCaT细胞中均有表达;蛋白免疫印迹发现VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3蛋白质相对分子质量均为180 000,NRP-1、NRP-2为140 000。HaCaT细胞膜及细胞质内检测到较强的VEGFR家族荧光信号,以细胞膜表达为强。结论 在mRNA及蛋白质水平,HaCaT细胞均表达VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3及NRP-1、NRP-2。     

角质形成细胞生长因子对HaCaT细胞增殖的影响

目的:研究角质形成细胞生长因子(KGF)对HaCaT细胞增殖的影响,探讨KGF与银屑病表皮过度增殖的关系。方法:利用HaCaT细胞体外培养,采用KGF为增殖诱导剂,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测不同浓度的KGF对HaCaT细胞增殖率的影响;检测KGF对细胞生长曲线及细胞集落形成的影响。结果:MTT实验表明,KGF可刺激HaCaT细胞增殖,刺激作用呈浓度依赖性(r=0.981,P<0.05);10 ng/mL KGF作用下HaCaT细胞的生长速度较对照组明显加快(P<0.05),集落形成率较对照组增加(P<0.05),且细胞呈明显的增殖形态,形成的集落较大,集落内细胞多呈星状,胞内染色质丰富。结论:KGF具有显著的促HaCaT细胞增殖作用,银屑病皮损区域KGF表达增加可能是引起表皮过度增殖的重要致病因子。     

角质形成细胞生长因子受体反义寡核苷酸对HaCaT细胞增殖的影响

目的 研究角质形成细胞生长因子受体反义寡核苷酸(KGFR ASODN)对角质形成细胞生长因子(KGF)促HaCaT细胞增殖效应的抑制作用。方法 HaCaT细胞体外培养,采用绘制生长曲线、MTT实验、集落形成实验研究KGFR ASODN对KGF促增殖效应的抑制作用。采用流式细胞仪研究KGFR ASODN对KGFR表达的影响。结果 反义序列1和反义序列2均可抑制HaCaT细胞的生长速度(P<0.05)。高于0.25μg/mL质量浓度反义序列1和反义序列2均可抑制KGF介导的HaCaT细胞增殖(P<0.05)。高于0.25μg/mL质量浓度反义序列1和反义序列2都可抑制KGF诱导的HaCaT细胞集落形成(P<0.05)。HaCaT细胞存在KGFR基础表达,高于0.25μg/mL质量浓度反义序列1和反义序列2均可抑制HaCaT细胞KGFR表达(P<0.05),抑制率呈浓度依赖性,正义序列核苷酸(S-ODN)对KGFR表达无抑制作用(P>0.05)。结论 KGFR ASODN可有效抑制KGFR表达,进而抑制KGF介导的HaCaT细胞过度增殖。