组织特异性转录调控序列及在肿瘤基因治疗研究中的应用

肿瘤特征性蛋白“持家基因”转录调控序列是肿瘤细胞内特异活化的基因调控序列，可使外源基因在肿瘤细胞中特征性地表达。本文综述了普通启动子及组织特异性启动子的基本结构与功能，转录调控因子对启动子的调节以及目前在肿瘤基因治疗研究领域中应用价值的人酪氨酸酶（Tyr）启动子，甲胎蛋白（AFP）启动子，癌胚抗原（CEA）启动子等的研究进展。     

逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子肝癌特异性基因治疗实验研究

为探讨肿瘤坏死因子基因对肝癌的治疗作用，分别构建ＳＶ４０早期启动子和白蛋白增强子／启动子调控小鼠肿瘤坏死因子基因的逆转录病毒载体ＭＮＳＴ和ＭＮＡＴ，以及ＳＶ４０早期启动子和人甲胎蛋白增强子／ＳＶ４０启动子调控的逆转录病毒载体ＬＴＳＮ和ＬＴＡＳＮ。构建物导入ＰＡ３１７细胞中包装成重组病毒，感染肿瘤细胞，证明白蛋白增强子／启动子和甲胎蛋白增强子均能使肿瘤坏死因子基因在肝癌细胞中高效特异表达。ＭＮＡＴ病毒和ＰＡ３１７／ＭＮＡＴ产病毒细胞ｉｎｖｉｖｏ法基因治疗有特异抗肝癌效果。提示组织特征蛋白“持家基因”转录调控序列在肿瘤组织特异性免疫基因治疗研究中有重要意义。     

癌胚抗原基因转录调控序列的克隆及在肿瘤基因治疗研究中…

肿瘤特征性蛋白“看家基因”转录调控序列（ＴＲＳ）是肿瘤组织特异性基因治疗的基础。本文综述了癌胚抗原（ＣＥＡ）基因ＴＲＳ的克隆、鉴定过程及其在肿瘤基因治疗，尤其是前药转换基因治疗的应用并对应用ＣＥＡ基因ＴＲＳ开展大肠癌、肿癌等特异性基因治疗研究提出展望。     

癌胚抗原基因转录调控序列的克隆及在肿瘤基因治疗研究中的应用

肿瘤特征性蛋白“看家基因”转录调控序列（ＴＲＳ）是肿瘤组织特异性基因治疗的基础。本文综述了癌胚抗原（ＣＥＡ）基因ＴＲＳ的克隆、鉴定过程及其在肿瘤基因治疗，尤其是前药转换基因治疗的应用并对应用ＣＥＡ基因ＴＲＳ开展大肠癌、肺癌等特异性基因治疗研究提出展望。     

使用热休克蛋白基因启动子调控靶基因在肿瘤局部表达

目的：利用人热休克蛋白基因启动子结合加热选择性诱导目的基因在肿瘤局部表达,建立肿瘤基因治疗新方法。方法：分离不同大小的人热休克蛋白70基因5’端调控顺序作为启动子,以绿色荧光蛋白（GFP）作报告基因,构建热诱导型GFP表达质粒,转染体外培养的肿瘤细胞,或将稳定转导GFP表达质粒的肿瘤细胞移植到大鼠皮窗内,或将热诱导型GFP腺病毒注射到肿瘤内,加热后直接利用荧光显微镜观察GFP表达水平。结果：400bp人热休克蛋白70基因5’端调控顺序背景表达水平低,加热后可被显著激活,能作为启子有效驱动下游目的基因的表达,GFP作报告基因使体内外肿瘤细胞内目的基因的表达水平仅通过荧光显微镜便能直接观察到。结论：利用热诱导型启子结合加热能选择性诱导目的基因在肿瘤局部表达,为肿瘤基因治疗提供了一种新方法。     

人端粒酶反转录酶启动子调控的肿瘤特异性载体的构建及表达

 目的: 构建由人端粒酶反转录酶(hTERT)启动子调控的具有肿瘤细胞特异性表达能力的荧光蛋白质粒。方法: 利用PCR技术克隆hTERT 基因启动子,利用分子生物学方法以该启动子替换pEGFP-C3质粒的CMV启动子,构建重组质粒（hTERTp-EGFP）。用脂质体转染法将hTERTp-EGFP质粒分别转染至肿瘤细胞和正常细胞, 观察此两种细胞内绿色荧光蛋白的表达差异。结果: 成功构建重组质粒hTERTp-EGFP,转染结果显示该质粒在肿瘤细胞中表达,而在正常细胞中无明显表达。结论: 重组质粒hTERTp-EGFP具有肿瘤特异性表达能力。     

组织特异性启动子在溶瘤腺病毒中的应用

溶瘤腺病毒（Oncolytic Adenovirus,Ad）是肿瘤基因治疗的研究热点。利用肿瘤或组织特异性启动子（Tissue—specific promoter,TSP）控制腺病毒关键基因的表达、实现腺病毒在肿瘤细胞特异性复制是目前溶瘤腺病毒构建的主要策略。另外,负载治疗基因可以增强杀灭肿瘤细胞的效果,     

三个中国汉族人纯合细胞DQA1基因启动子多态性的分子生物学 …

近年来国外发现参与Ⅱ类基因转录调控的启动子也存在多态性，运用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和末端终止法，对三个中国旅游人ＨＬＡ纯合细胞的ＤＱＡ１基因启动子区（ＱＡＰ）３１８ｂｐ的核苷酸（包括顺式作用元件Ｘ、Ｙ、Ｘ２和Ｗｂｏｘ）进行了扩增产测序，发现等位基因ＤＱＡ１＊０３０１１（纯合细胞ＳＭＹ２３Ａ）的ＱＡＰ结合和白种人的同一等位基因ＤＱＡ１＊０３０１１的ＱＡＰ不同，而与ＤＱＡ１＊０３０１２的ＱＡＰ结构相同     

三个中国汉族人纯合细胞DQA1基因启动子多态性的分子生物学研究

近年来国外发现参与Ⅱ类基因转录调控的启动子区也存在多态性，运用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和末端终止法，对三个中国汉族人ＨＬＡ纯合细胞的ＤＱＡ１基因启动子区（ＱＡＰ）３１８ｂｐ的核苷酸（包括顺式作用元件Ｘ、Ｙ、Ｘ２和Ｗｂｏｘ）进行了扩增和测序，发现等位基因ＤＱＡ１＊０３０１１（纯合细胞ＳＭＹ２３Ａ）的ＱＡＰ结合和白种人的同一等位基因ＤＱＡ１＊０３０１１的ＱＡＰ不同，而与ＤＱＡ１＊０３０１２的ＱＡＰ结构相同，表明在ＤＱＡ１与ＱＡＰ之间可能发生了重组     

肿瘤细胞中的表遗传编码紊乱

不改变基因的DNA编码，通过改变DNA双链与组蛋白间紧密度来决定基因是否转录表达，这称为表遗传编码机制。表遗传编码的生理作用是通过组蛋白修饰和DNA甲基化，调控细胞在适当的时间、空间位置表达适当的基因，从而控制细胞的增殖状况和分化方向。在细胞发育过程中，细胞内DNA甲基化水平增龄性增高，基因转录活性逐渐降低，使细胞从幼稚增殖进入成熟分化。肿瘤细胞中出现表遗传编码紊乱，致细胞增殖失控，不能进入分化成熟阶段。基因启动子出现甲基化重排，阻碍转录因子与启动子结合，导致基因转录丧失正常调控，合成成熟功能蛋白受阻。利用表遗传机制（如RNA干涉）可成为肿瘤治疗的新方法。     

前列腺特异抗原基因启动子中二个与雄激素调节相关的序列

人前列腺特异抗原（ＰＳＡ）基因特异地在前列腺上皮细胞中表达。且受雄激素调节。其雄激素应答元件（ＡＲＥ）位于－１７０附近。为确定雄激素对该基因的诱导作用是否受ＡＲＥ上游序列的影响，把ＰＳＡ启动子区的不同长度的ＤＮＡ片段与无启动子的报告基因ＣＡＴ相连，然后与雄激素受体表达质粒一起共传染人前列腺肿瘤细胞ＰＣ－３。结果表明ＡＲＥ上游ＲＦ３６（－４０６～─３７１）和ＲＦ１５（─３４０～─３２６）两个序列可促进雄激素对ＰＳＡ基因的诱导作用。这些序列可与ＰＣ－３细胞中的某些调节蛋白结合。这些调节蛋白可能通过与雄激素受体的相互作用影响雄激素对ＰＳＡ基因的诱导作用。     

瘤体内注射IL－2基因后肿瘤细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞的功能分析

将脂质体包裹的ＩＬ－２基因直接注射至Ｂ１６Ｆ１０黑色素瘤瘤体内，研究肿瘤细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）的功能变化。１０ｄ后，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ鉴定显示瘤体内注射ＩＬ－２基因后肿瘤细胞及ＴＩＬ中ＩＬ－２ｍＲＮＡ表达阳性；经Ｇ４１８筛选后的肿瘤细胞培养上清中可检测出ＩＬ－２；肿瘤细胞表面表达了较高水平的ＭＨＣⅠ类抗原（Ｈ－２Ｋ￣ｂＤ￣ｂ）；ＴＩＬ表面粘附分子ＬＡＦ－１表达也明显高于对照组，其杀伤Ｂ１６细胞的活性明显增强。结果表明瘤体内注射脂质体包裹的ＩＬ－２基因后，可在肿瘤原位将基因转移至肿瘤细胞及ＴＩＬ中，提高肿瘤细胞的ＭＨＣⅠ类抗原的表达，增强肿瘤细胞的免疫原性，并通过提高ＴＩＬ粘附分子的表达，共同促进ＴＩＬ的肿瘤特异性杀伤功能。     

重组人甲胎蛋白基因顺式调控元件功能的研究

将６种含有人甲胎蛋白（ＡＦＰ）基因启动子、增强了和／或沉寂子不同组合的荧光素酶报告基因真核表达载体分别转染３种人肝癌细胞系及１种肺腺癌细胞系，测定瞬时表达的荧光素酶活性。结果显示６种重组人ＡＦＰ基因顺式作用元件在ＡＦＰ阳性肝癌细胞均具有特异启动活性，而在ＡＦＰ阴性的肝癌细胞和非肝癌细胞无启动活性。在这６种重组人ＡＦＰ顺式元件中，以２．２ｋｂ的调控元件（去除了ＡＦＰ基因沉寂子。保留其启动子和增强子序列）启动活性最高，从而为下一步的靶向性肝癌基因治疗提供了较理想的肝癌细胞特异性启动元件。     

人端粒酶逆转录酶核心启动子调控的人TRAIL蛋白在人卵巢癌细胞中的表达

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因核心启动子（hTERT）调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体真核表达载体，并检测TRAIL在转染的卵巢癌细胞SKOV3中的表达情况。方法：利用基因重组方法将TRAIL基因克隆人带有hTERT基因核心启动子pIRES2-EGFP真核表达载体中。获得由hTERT基因核心启动子调控的绿色荧光蛋白和带有效应型TRAIL基因的真核表达载体hTERTpromoter-pIRES2-EGFP-TRAIL。采用脂质体介导的方法将hTERT调控的TRAIL基因真核表达载体转染人卵巢癌SKOV3细胞，采用G418筛选获得阳性克隆；应用免疫细胞化学法、蛋白质印迹分析、流式细胞术（FCM）结合间接免疫荧光、RT—PCR法检测转染前后卵巢癌细胞中外源基因的表达。结果：经酶切鉴定及测序结果证实所构建载体正确。转染细胞中的TRAIL表达明显高于对照组细胞。结论：成功地构建了hTRET基因核心启动子调控的TRAIL基因真核表达载体，并在人卵巢癌细胞系SKOV3中得到稳定表达，为进一步研究其对卵巢癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础。     

瘤体内注射IL—2基因后肿瘤细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞的功能分析

将脂质体包裹的ＩＬ－２基因直接注射至Ｂ１６Ｆ１０黑色素瘤瘤体内，研究肿瘤细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）的功能变化。１０ｄ后，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定显示瘤体内注射ＩＬ－２基因后肿瘤细胞及ＴＩＬ中ＩＬ－２ｍＲＮＡ表达阳性；经Ｇ４１８筛选后的肿瘤细胞培养上清中可检测出ＩＬ－２；肿瘤细胞表面表达了较高水平的ＭＨＣＩ类抗原（Ｈ２Ｋ＾ｂＤ＾ｂ）；ＴＩＬ表面粘附分子ＬＡＦ－１表达也明显高于对照组，其     

多源性微卫星序列转染RER^＋细胞株观察肿瘤细胞遗传不稳…

目的 利用ＲＥＲ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｅｒｒｏｒ）表型的人肿瘤细胞株，在体外观察肿瘤细胞微卫星序列（ＭＳ）频发突变，研究了人类肿瘤细胞基因组ＤＮＡ遗传不稳定性。方法 把含有人工合成的简单重复序列（ＣＡ）１４和ＬａｃＺ标志基因的重组质粒ｐＣＭＶ－ＣＡＲ经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ方法转染ＲＥＲ＾＋或ＲＥＲ＾－人结肠癌 。（ＣＡ）１４插入ＬａｃＺ编码序列之中，干扰了ＬａｃＺ基因的正确读码。当（ＣＡ）１４     

MHC—Ⅱ类基因启动子及其多态性Ⅰ——顺式作用DNA元件研究进展

ＭＨＣ－Ⅱ类基因在免疫应答的调控中起着关键的作用，人类ＨＬＡ－Ⅱ类基因位于第６号染色体上ＭＨＣ复合体的Ｄ区，近年来国外已在一些Ⅱ类基因启动子区发现有多态性，且这种多态性在Ⅱ类基因中普遍存在，这不仅说明Ⅱ类基因启动子本身的调节活性十分复杂，也深化了对Ⅱ类分子表达调控的认识。本文以Ⅱ类基因启动子的结构为基础对启动子顺式作用元件的多态性作一综述。     

MHC－Ⅱ类基因启动子及其多态性Ⅰ──顺式作用DNA元件研究进展

ＭＨＣ－Ⅱ类基因在免疫应答的调控中起着关键的作用。人类ＨＬＡ－Ⅱ类基因位于第６号染色体上ＭＨＣ复合体的Ｄ区，近年来国外已在一些Ⅱ类基因启动子区发现有多态性，且这种多态性在Ⅱ类基因中普遍存在，这不仅说明Ⅱ类基因启动子本身的调节活性十分复杂，也深化了对Ⅱ类分子表达调控的认识。本文以Ⅱ类基因启动子的结构为基础对启动子顺式作用元件的多态性作一综述。