人永生化成骨细胞hFOB1.19恶性转化的研究

目的 建立人胚永生化成骨细胞系(hFOB1.19)的恶性转化模型, 作为骨肉瘤癌变过程细胞分子生物学研究的模型.方法 通过克隆形成率实验确定N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)对hFOB1.19细胞转化浓度后,以MNNG作启动剂,佛波酯(12-0-Te-tradecanoyl phorbol 13-acetate, TPA)作促进剂对hFOB1.19细胞进行转化,90 d后通过细胞形态、DNA含量分析、软琼脂集落形成试验和裸鼠体内致瘤试验鉴定细胞恶性转化程度.结果 经MNNG和TPA协同处理hFOB1.19细胞90 d后,细胞中出现形态异常的转化灶,转化灶细胞失去接触抑制; 高倍体细胞数,转化组(81.08%) 高于对照组(55.03%);软琼脂克隆形成率明显增加;转化细胞在裸鼠皮下成瘤,病理组织学证实为低分化骨肉瘤.结论 模拟人体细胞发生恶性转化的过程,建立了人胚永生化成骨细胞系的恶性转化模型.     

大鼠肠上皮细胞系IEC-6的恶性转化研究

目的建立N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG）、佛波酯（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,PMA）对大鼠肠上皮细胞系IEC-6的恶性转化模型。方法通过克隆形成率实验确定MNNG、PMA对IEC-6细胞转化浓度,对IEC-6细胞进行分阶段多次干预。用软琼脂集落形成实验和裸鼠体内致瘤实验鉴定细胞恶性转化程度。结果经MNNG、PMA多次处理IEC-6细胞至24次后,细胞生长速度加快,排列紊乱,失去接触抑制,出现复层生长,并可在软琼脂上生长,且呈剂量反应关系,但在第24次之前的细胞则不能在软琼脂上生长。转化细胞在裸鼠体内形成瘤,病理组织学证实为低分化肠上皮细胞癌。结论MNNG、PMA具有使IEC-6细胞发生恶性转化的能力。     

hTERT基因永生化人毛乳头细胞系的转化特征

目的 探讨hTERT基因永生化人毛乳头细胞系是否具有转化特征.方法 采用脂质体转染法,将hTERT基因导入体外培养的正常人毛乳头细胞,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养.应用RT-PCR 法检测 hTERT mRNA 的表达.采用细胞形态学观察、染色体核型分析、软琼脂克隆形成实验和裸鼠致瘤实验分析转染细胞是否具有转化特征.结果 转染后获得1个阳性细胞克隆,扩大培养后细胞生长良好,现已连续传至50代.检测证实转染细胞稳定表达hTERT mRNA,细胞形态与未转染细胞基本相同,染色体核型正常,在软琼脂内不能生长,无裸鼠致瘤性.结论 hTERT基因永生化人毛乳头细胞系基本上是正常细胞而无明显转化特征.     

人乳头状瘤病毒18E6E7和TPA协同诱发人胚食管上皮恶性转化的研究

提要研究病毒和促癌物在食管癌形成的作用，用人胚食管上度培养和HPV18E6E7AAV感染。培养细胞分二组，SHEEC1组培养基中加入TPA(5ng/mL)4周。对照组SHEE未加TPA。细胞转化的形态，细胞周期,软琼脂培养和裸鼠致瘤性等指标皆证明SHEEC1已恶性转化。E6E7基因在FISH和PCR检测，两组细胞核皆呈阳性。结论：人胚食管上皮可用HPV18E6E7和TPA在体外协同诱导细胞恶性转化。人乳头状瘤病毒18E6E7和TPA协同诱发人胚食管上皮恶性转化的研究@沈忠英$汕头大学医学院肿瘤病理研究室@蔡维佳$汕头大学医学院肿瘤病理研究室@沈健$汕头大…     

从形态及功能研究MNNG诱导GES-1永生化细胞的恶性转化

目的 探讨甲基硝基亚硝基胍(methyl nitro nitrosoguanidine,MNNG)作用于GES-1永生化细胞所发生的恶性转化.方法 MNNG作用于GES-1永生化细胞24 h后,通过显微镜和软琼脂集落形成实验观察细胞形态学、染色体变化和集落形成情况.统计采用t检验.结果 经MNNG处理的GES-1细胞(命名为MC)核增大,畸形,核染色质变粗,核仁肥大,核分裂.染色体可见双倍及多倍体,染色体断裂.克隆形成实验可见细胞接触抑制消失克隆形成,t=5.139,P＜0.05.结论 经MNNG诱导的GES -1细胞的生长特性改变,呈现肿瘤细胞的形态学及生长特征.     

稳定表达EGFP的不同转移特性骨肉瘤细胞亚株建立及其生物学特性

目的：建立经绿色荧光蛋白基因转染的骨肉瘤细胞亚株并研究其生物特性。方法：利用脂质体转染pEGFP人人骨肉瘤MG63细胞系，通过细胞电泳，获得两株细胞克隆M6和M8，经体外细胞增殖、软琼脂形成、生长曲线、裸鼠成瘤试验综合分析其生物学行为改变。应用组织形态学观察、染色体分析、软琼脂克隆形成法研究癌细胞的生物学特性。结果：发现M6和M8两株均保持人类染色体核型，所形成肿瘤显示人成骨肉瘤上皮样组织形态，其中M6的群体倍增时间为38．4h，软琼脂形成率为18．7％，M8群体倍增时间为23．0h，软琼脂形成率为29．3％。裸小鼠背部皮下接种M6和M8，发现M8成瘤时间短，细胞增殖快，但在4周内两者均不发生转移。结论：骨肉瘤细胞亚系有不同的转移特性，GFP的整合及表达未对MG63细胞的生长状态造成明显影响，可作为报告基因进一步了解骨肉瘤细胞转移的差异性分析。     

Wistar大鼠自发性乳腺肿瘤细胞系的建立及其生物学特性

目的 从Wistar大鼠自发性乳腺肿瘤中分离出乳腺肿瘤细胞系(ZHL2006),并对其进行鉴定,为动物模型的开发、肿瘤发病机制的探讨提供有价值的线索.方法 对一例Wistar大鼠自发性乳腺腺癌瘤组织进行培养.对传代培养细胞进行细胞生长曲线测定、细胞形态结构分析、细胞染色体分析,检测广谱细胞角蛋白(PCK)表达、软琼脂集落形成实验等检测.将细胞接种于10只裸鼠,并对形成的肿瘤进行病理组织学检查,并进行分离培养.结果 ZHL2006细胞在体外生长迅速,群体倍增时间为43.6 h;倒置显微镜及Giemsa染色镜下观察细胞为多边形及梭形;透射电镜观察可见细胞表面有微绒毛,核高度不规则,核浆比例增大,核仁明显等;染色体数目和结构异常,具有癌细胞特性.广谱细胞角蛋白(PCK)染色阳性,说明其自上皮而非来自基质;同时ZHL2006细胞系在软琼脂中可形成克隆,具裸鼠致瘤性.该乳腺肿瘤细胞系经体外长期培养后已形成永生化细胞系,并具有明显的恶性细胞表型.裸鼠接种实验成功率为6/10,复制肿瘤细胞和原发肿瘤形态结构一致,细胞培养形态结构一致.结论 本研究成功的建立了大鼠乳腺肿瘤细胞系,该细胞系具有典型的恶性肿瘤特征,能应用于裸鼠并成功复制出乳腺肿瘤模型.     

黑素瘤细胞诱导人胚上皮干细胞的恶性转化

目的:探索体外肿瘤微环境中正常成体干细胞是否可以发生恶性转化而具有相关肿瘤学特性.方法:利用共培养池建立黑素瘤A-375细胞诱导表皮干细胞转化的模型,应用相差显微镜观察诱导前后表皮干细胞形态变化,免疫荧光法检测诱导后表皮干细胞E-钙黏着蛋白、肿瘤相关抗原P53突变蛋白的表达变化和双层软琼脂实验鉴定诱导后表皮干细胞克隆形成能力情况.结果:7 d后与黑素瘤细胞A-375直接接触共培养的表皮干细胞开始克隆样生长,细胞E-钙黏着蛋白表达下降,部分细胞表达P53突变蛋白,软琼脂培养克隆形成率为0.55%.结论:表皮干细胞经黑素瘤细胞直接诱导后,可以具有肿瘤细胞的相关生物学特性.结果表明,肿瘤微环境可以造成干细胞自我更新能力的失控.     

两株人成骨肉瘤克隆细胞株的建立及其生物学特性

通过克隆技术及体内移植,从自建的成骨肉瘤细胞 Ｌ Ｔ Ｈ Ｏ Ｓ（简称 Ｓ）中获得两株细胞克隆 Ｓ１ 和 Ｓ２,应用组织形态学观察、染色体分析、软琼脂克隆形成法以及裸小鼠体内成瘤试验研究癌细胞的生物学特性。结果发现 Ｓ１ 和 Ｓ２ 两株均保持人类染色体核型,所形成肿瘤显示人成骨肉瘤上皮样组织形态,其中 Ｓ１ 的细胞电泳率高达１．０, Ｓ２ 为０．７０, Ｓ１ 的群体倍增时间为２２．４ ｈ,软琼脂形成率为３３．５％ , Ｓ２ 群体倍增时间为２４．０ ｈ,软琼脂形成率为２３．１％ 。裸小鼠右后肢皮下接种 Ｓ１ 和 Ｓ２,发现 Ｓ１ 成瘤时间短,细胞增殖快,但在４ 周内两者均不发生转移;通过尾静脉注射 Ｓ１ 和 Ｓ２ 细胞,发现４ 周时,接种 Ｓ１ 细胞的裸鼠出现广泛的实验性肺转移,接种 Ｓ２ 细胞的裸鼠肺部仅见几个分散的癌细胞。     

人胰岛素样生长因子Ⅱ型受体反义基因对肝癌细胞恶性表型的影响

目的 研究人胰岛素样生长因子Ⅱ型受体（IGF-ⅡR）反义基因对SMMC-7721人肝癌细胞恶性表型的逆转作用。方法 构建IGF-ⅡR正、反义基因真核表达质粒,用磷酸钙-DNA共沉淀的方法,导入SMMC-7721人肝癌细胞株,经G418培养基筛选稳定的抗性细胞。采用Northern杂交检测对转染细胞内源性IGF-ⅡR基因转录的抑制,观察转染细胞克隆形成率,细胞生长曲线,软琼脂生长及裸鼠致瘤能力的变化。结果 IGF-ⅡR反义基因转染肝癌细胞的内源性IGF-ⅡR基因转录受到有效抑制,转染细胞克隆形成率明显降低,并失去在软琼脂上生长的能力,裸鼠致瘤性明显降低,但细胞生长曲线无明显变化。结论 IGF-ⅡR反义基因可以有效阻断IGF-Ⅱ至IGF-ⅡR的自泌/旁泌生长刺激信号环路,一定程度地抑制肝癌细胞的恶性表型。     

Twist调控骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭

目的探讨增强或降低Twist表达对不同恶性程度的骨肉瘤细胞体外增殖、迁移、侵袭及体内成瘤的作用。方法Real-time PCR 及Western blot检测Twist在143B、MG63及TE85三种不同骨肉瘤中的基础表达。采用Ad-Twist及Ad-siTwist腺病毒感染 细胞,细胞生长曲线检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞的平行迁移能力,Transwell实验检测细胞的垂直迁移及侵袭能力。 Ad-Twist及Ad-siTwist感染Luc标记的143B细胞,制备胫骨近端骨肉瘤模型,活体成像动态观察细胞在体内的生长。结果在 骨肉瘤细胞中Twist 的基础表达显著高于C3H10 细胞（P<0.05）,其中在143B细胞表达最高,MG63 细胞次之,TE85 细胞中最 低,Twist的表达水平与骨肉瘤细胞的恶性程度呈正相关。Ad-Twist及Ad-siTwist感染细胞分别能显著提高或降低骨肉瘤细胞 中Twist的mRNA及蛋白水平的表达（P<0.05）。生长曲线结果显示Twist过表达能显著促进骨肉瘤细胞的增殖,而抑制Twist的 表达后,骨肉瘤细胞的增殖能力降低（P<0.05）。Transwell实验发现Twist过表达后,3种骨肉瘤细胞迁移或侵袭至小室的细胞 数明显增多,而抑制Twist的表达可降低骨肉瘤细胞的迁移侵袭能力（P<0.05）。143B细胞具有良好的体内成瘤能力,Twist过表 达促进143B细胞在裸鼠体内生长,活体成像动态观察荧光信号显著高于对照组,抑制Twist表达可显著抑制细胞在裸鼠体内生 长,信号明显弱于对照组。结论Twist可增强骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及体内成瘤能力。     

Malignant transformation and abnormal expression of eukaryotic initiation factor in bronchial epithelial cells induced by cadmium chloride

Objective To analyze the relationship between malignant transformation and abnormal expression of eukaryotic initiation factor 3 （eIF3 p36） in human bronchial epithelial （16HBE） cells induced by cadmium chloride （CdCl2）. Methods 16HBE cells were treated several times with different concentrations of CdCl2. Tumorigenic potential of transformed cells was identified by assays for anchorage-independent growth in soft agar and for tumorigenicity in nude mice after the 35th passage. Total RNA was isolated from 16HBE cells induced by CdC12, including non-transformed, Cd-transformed, and Cd-tumorigenic cell lines. Special primers for eIF3 p36 were designed and the expression of eIF3 mRNA in different cell lines was detected with fluorescent quantitative-polymerase chain reaction technique （FQ-PCR）. Results The 35th passage of 16HBE cells transformed by CdCl2 exhibited overlapping growth. Compared with the non-transformed cells, colonies of transformed cell lines in soft agar showed statistically significant increases and dose-dependent effects （P〈0.01）. All Cd-induced transformed cell lines formed rumors in nude mice within 2 weeks of inoculation, but none of the mice injected with non-transformed cells showed tumors even after 3 weeks. All tumors were pathologically identified as poorly differentiated squamous cell carcinoma. The eIF3 p36 genes in different stages of 16HBE cells transformed by CdCl2 were elevated as compared with the non-transformed control （P〈0.01）, and the eIF3 expression increased with the degree of cell malignancy. Conclusion CdCl2 is capable of inducing morphological transformation in 16HBE cells and transformed cells are potentially tumorigenic. Over-expression of eIF3 p36 is positively correlated with malignant transformation of 16HBE cells induced by CdCl2 and may be one of the molecular mechanisms potentially responsible for carcinogenesis due to Cd.     

不同细胞系在骨肉瘤动物模型中的成瘤差异性比较

目的:探讨不同细胞系在骨肉瘤动物模型中的成瘤差异性。方法:⑴对Mg-63和U-2 OS两系细胞分别行细胞划痕实验和transwell实验;⑵32只裸鼠随机分为Mg-63细胞悬液法、组织块法与U-2 OS细胞悬液法、组织块法4组,每组8只。两种细胞系分别采取细胞悬液法和组织块移植法进行股骨远端原位骨肉瘤重建,统计4组原位骨肉瘤模型成瘤率、瘤重以及肿瘤转移率等指标。结果:细胞划痕实验中,Mg-63和U-2 OS在划痕48 h后迁移距离分别为(381.2±23.6)、(591.9±35.1)μm。骨肉瘤细胞transwell实验中,Mg-63和U-2 OS 16 h后穿膜细胞数分别为24.0±2.6,81.9±3.1。骨肉瘤造模实验中,Mg-63悬液法组成瘤率、肺转移率、淋巴结转移率、4周瘤重分别为62.5%,10.4%,0,(2.1±0.1)g;Mg-63组织块法组分别为100%,76.8%,20.7%,(2.4±0.3)g;U-2 OS悬液法组分别为100%,45.8%,0,(2.4±0.6)g;U-2 OS组织块法组分别为100%,82.3%,41.1%,(2.6±0.4)g。结论:U-2 OS细胞系拥有较高的组织侵袭性和细胞增殖能力,是一种良好的骨肉瘤原位模型制作细胞系。     

EB病毒BARF1基因对人胃上皮细胞恶性转化的作用

目的 探讨EB病毒编码BARF1基因在人胃上皮细胞恶性转化中的作用.方法 用携带BARF1基因的真核载体PIRES2-EGFP/BARF1,转染人胃上皮细胞系GES-1,通过G418筛选,获得稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞株.GES-1细胞被分为4组,包括1个转染BARF1基因的细胞组,1个转染BARF1基因并...     

Alterations of FHIT gene and P16 gene in nickel transformed human bronchial epithelial cells

INTRODUCTION Nickel is a widely distributed occupational and environmental pollutant. Epidemiological studies demonstrated that the incidence of respiratory tract cancer is correlated with worksite exposure to nickel. Nickel is also a potent carcinogen in laboratory animals. The International Agency for Research on Cancer (IARC) has classified nickel compounds as confirmed human carcinogens[1]. However, the mechanism of nickel carcinogenesis remains unknown. Insoluble nickel compounds…     

人鼻咽癌DNA对Rat-Ⅰ细胞株的转化活性及其基因表达的研究

为了解EB病毒基因组阳性人鼻咽癌DNA在转染正常细胞后可能发生的生物学作用,作者将人鼻咽癌活检组织的DNA(EB病毒基因组阳性),用磷酸钙方法转染正常Rat-Ⅰ细胞,使其恶转;用软琼脂培养的转化细胞能贴壁生长,并形成克隆;转化细胞易与PHA发生凝集;克隆接种裸鼠形成纤维肉瘤;转化细胞和裸鼠肿瘤组织用抗C_3补体免疫荧光法检测EBNA呈阳性;染色体原位杂交显示在某些细胞中期染色体上有银粒出现。     

MG-63骨肉瘤原位模型的建立

目的 建立裸鼠股骨骨肉瘤原位模型.方法 体内连续传代筛选MG-63细胞系获得高成瘤率的细胞,MG-63细胞悬液或MG-63细胞皮下成瘤瘤组织块接种于裸鼠股骨下端.观察MG-63细胞在股骨骨肉瘤原位模型的成瘤特性,并比较两种成瘤方法的成瘤率,常规影像学检查以及肿瘤组织病理检查.结果 两周内可见局部肿瘤形成.术后4周X线片可见股骨下段溶骨及成骨改变、肿瘤样骨形成.光镜下可见典型的骨肉瘤病理特征,成骨作用明显.细胞悬液法成瘤率70%,组织块法成瘤率100%,两种方法成瘤率的差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功建立了裸鼠股骨下段原位肿瘤移植模型,为骨肉瘤的研究提供了更接近人体内环境的研究基础.     

手术切除的结直肠癌组织中的肿瘤干细胞的培养及鉴定

目的获得结直肠癌患者手术切除癌组织的肿瘤干细胞（CSC）,培养并鉴定其干细胞特性。方法通过原代培养手术切除 结直肠癌组织获得结直肠癌细胞,再通过有限稀释法和无血清培养法筛选结直肠癌CSC,软琼脂集落实验检测CSC和对照组人 结直肠癌细胞株SW480 的增殖能力;用低数量级细胞裸鼠皮下成瘤实验,检测结直肠癌CSC和SW480 的成瘤能力;并运用 Western blot及免疫荧光方法,检测CSC和SW480的免疫表型。结果临床结直肠癌标本原代培养的CSC,加入血清培养可使 CSC分化。软琼脂集落形成实验结果显示,原代培养的CSC克隆形成率为56.64%和54.45%,对照组人结直肠癌细胞株SW480 的克隆形成率为4.41%,CSC与SW480集落形成率的差异具有统计学意义（P<0.01）。裸鼠皮下成瘤实验中,原代培养的CSC 皮下注射500 个细胞可形成皮下瘤,而SW480 皮下注射500 个细胞不形成皮下瘤。CSC 表达CD133、CD44,不表达CK7; SW480细胞不表达CD133、CD44,表达CK7。结论原代培养的手术切除结直肠癌组织标本获得的肿瘤细胞,再行无血清培养 可形成CSC,鉴定具有CSC的自我更新及分化能力。