应用噬菌体随机肽库筛选腺病毒模拟肽的研究

目的 探讨模拟腺病毒表位肽的噬菌体对该病毒感染Hela细胞的保护作用，以便为研制防治腺病毒感染的新型疫苗奠定基础。方法 用3型腺病毒中和抗体筛选噬菌体随机六肽库，经3轮筛选后，随机挑取了21个噬菌体克隆，扩增后分别加入3型腺病毒感染的Hela细胞，用结晶紫染色法观察Hela细胞的病变程度。结果 10／21个克隆噬菌体短肽对3型腺病毒感染Hela细胞具有保护作用。结论 噬菌体表面的短肽可以模拟中和抗体相关的腺病毒表位，对3型腺病毒感染Hela细胞有一定的保护作用。     

应用噬菌体展示短肽探索腺病毒表位

腺病毒感染可以引起广泛的疾病,例如急性咽炎、气管炎、肺炎、结膜炎、角膜炎、及胃肠炎等,在我国引起肺炎的腺病毒绝大多数为3型或7型。对于腺病毒感染至今尚缺乏特异性地预防和治疗手段。本研究目的是为了获得含有中和抗体相关的3型腺病毒模拟表位短肽的噬菌体克隆,为设计新疫苗提供新的思路。从噬菌体肽库中筛选目的短肽是近年来发展起来的一项新技术,噬菌体肽库也称噬菌体表位库,即以噬菌体衣壳蛋白PⅢ为载体,插入一段编码外源短肽的随机基因片段,从而构成了一个长度固定、序列随机的短肽集合体。本研究用3型腺病毒中和抗体筛选噬菌体随机十五肽库,经三轮筛选后,随机挑取了22个噬菌体克隆,分别加入3型腺病毒感染的Hela细胞,用结晶紫染色法观察Hela细胞的病变程度。并选择一个有明显保护作用的,即病变程度较轻的阳性噬菌体克隆进行测序。结果发现8／22个克隆菌体短肽对3型腺病毒感染Hela细胞具有保护作用。其中一个有明显保护作用的噬菌体短肽的序列为：Leu-Val-Gly-Ile-Trp-His-Arg-Leu-Pro-Gly-Ala-His-Arg-Gly-Ala,即LVGI－WHRLPGAHRGA。我们得到的结论是噬菌体短肽可以模拟中和抗体相关的腺病毒表位,保护Hela细胞免受3型腺病毒感染。     

应用噬菌体肽库筛选NMDA受体抗原表位

目的利用噬菌体展示随机肽库技术,进行NMDAR1抗原表位研究.方法以R1JHL单克隆抗体作为筛选分子,生物淘洗噬菌体展示随机12肽文库.经过4轮的筛淘,ELISA结合实验鉴定阳性克隆,提取阳性克隆噬菌体单链DNA进行序列分析.结果对阳性噬菌体进行递呈肽氨基酸序列分析,获得一阳性克隆序列HYNLSSDRKVRL,与R1JHL单克隆抗体识别序列相比,两者存在一致性序列DRK.结论 DRK可能为NMDA受体抗原表位.     

呼吸道合胞病毒模拟表位合成肽疫苗的开发

开发诱导呼吸道合胞病毒 (RSV)中和抗体的合成肽疫苗是预防 RSV感染的有效途径。本文叙述了用针对 RSV F蛋白构象表位的单克隆抗体 MAb1 9筛选固相组合肽库 ,鉴定出与MAb1 9发生特异性反应的两个序列 ,并经氨基酸替换试验 ,提高了与 MAb1 9反应的亲和力。将模拟表位以多抗原肽 (MAP)形式免疫 Balb/ c小鼠 ,表现出明显的保护作用。     

呼吸道合胞病毒模拟表位合成肽疫苗的开发

并发诱导呼吸道合胞病毒（RSV）中和抗体的合成肽疫苗是预防RSV感染的有效途径。本文叙述了用针对RSV F蛋白构象表位的单克隆抗体MAb19筛选固组组合肽库，鉴定出与MAb19发生特异性反应的两个序列，并经氨基酸替换试验，提高了与MAb19反应的亲和力，将模拟表位以多抗原位（MAP）形式免疫Balb/c小鼠，表现出明显的保护作用。     

噬菌体展示技术生物淘选CTGF表位的研究

噬菌体展示技术筛选缔组织生长因子（CTGF，connective tissue growth factors）蛋白表位。用含有30mmol／L葡萄糖的DMEM培养液干预人肾小球系膜细胞2d后，提取CTGF天然蛋白，应用Western blot—ting方法鉴定CTGF单克隆抗体的特异性；以CTGF单克隆抗体为筛选工具，对噬菌体随机12肽库进行筛选，逐步增加选择压力，经过3轮筛选后随机挑取4个克隆测序，用竞争抑制和间接ELISA方法检测噬菌体阳性克隆的特异性。Westernblotting分析显示，CTGF单克隆抗体能与CTGF天然蛋白及重组蛋白特异性结合。噬菌体文库经过3轮筛选后得到的阳性克隆，测序结果表明4个克隆的序列高度一致，推导获得小肽序列，命名为ZD521；竞争抑制和间接ELISA分析与预期结果一致。本研究用噬菌体展示技术成功获得与CTGF单抗高度结合的小肽，为CTGF功能研究以及进一步以该肽为疫苗预防和治疗纤维化疾病打下基础。     

从随机肽库中筛选与β1肾上腺素能受体有结合活性的小肽

目的用噬菌体肽库技术筛选与β1肾上腺素能(β1-AR)受体有结合活性的小肽,为初步建立一种检测受体数目的方法和研究模拟小肽的生物学活性打下基础。方法以合成β1-AR细胞膜外第2环多肽序列为靶分子,对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选,并用酶联免疫吸附分析法(ELISA)和竞争抑制实验鉴定阳性克隆的结合性和特异性。结果经3轮筛选,阳性克隆得到富集,在30个阳性克隆中,有2个阳性克隆可与靶分子有较强结合活性,其中1个能特异性阻断抗β1-AR兔血清多抗与靶分子结合。结论该小肽与靶分子有特异性结合。     

肺癌特异性结合多肽的体外筛选和鉴定

目的应用噬菌体随机肽库技术筛选出与肺癌细胞特异性结合的多肽。方法以人肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,人胚肺细胞MRC-5为吸附细胞,对噬菌体随机12肽库进行3轮全细胞减性筛选后,随机挑取噬菌体克隆进行ELISA鉴定;对亲和力较高的阳性克隆进行DNA测序并翻译为氨基酸序列;化学合成异硫氰酸荧光素标记的多肽(FITC-ZS-5),采用细胞和组织免疫荧光法鉴定FITC-ZS-5与肺癌细胞的亲和力及特异性。结果通过3轮减性筛选后,与NCI-H1299细胞结合的噬菌体克隆得到有效的富集;ELISA结果显示5号克隆对NCI-H1299细胞亲和力最高,将其命名为Phage ZS-5;测序结果显示Phage ZS-5所表达的多肽序列在国内外均未见报道,细胞及组织免疫荧光实验结果显示FITC-ZS-5对肺癌细胞及组织具有较高的亲和力和特异性。结论应用噬菌体随机肽库技术筛选到肺癌靶向性多肽ZS-5,为肺癌的靶向治疗和诊断奠定基础。     

噬菌体随机肽库淘选肺癌细胞NCI-H1299特异性结合多肽

目的利用噬菌体展示肽库筛选出与肺癌NCI-H1299细胞特异性结合的多肽,鉴定其特异性和亲和力,为寻找肺癌早期诊断和治疗标志物打下基础。方法以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细胞,在37℃下对噬菌体随机十二肽库进行三轮减性筛选,挑取单克隆ELISA初步鉴定噬菌体克隆亲和力;阳性克隆提取质粒,测序后合成多肽,鉴定多肽的亲和力及特异性。结果经ELISA初步鉴定,随机挑选的20个单克隆中,其中6号对NCI-H1299亲和力最高,将其命名为PhageZS6。细胞免疫荧光试验进一步证明,合成的相应多肽FITCZS6对NCI-H1299具有高亲和力。结论利用噬菌体随机十二肽成功筛选出与肺癌细胞具有较高亲和力的多肽ZS6,为肺癌的早期诊断和靶向治疗奠定基础。     

从噬茵体7肽库中筛选畦巴因特异性结合的短肽

以哇巴因为靶分子,从噬菌体7肽库中筛选与哇巴因特异性结合的短肽.经过3轮淘筛并通过ELISA法鉴定,获得14个阳性克隆,通过对噬菌体ssDNA电泳鉴定和序列分析筛选得到3种短肽:肽A、B和C的筛选一致率分别为64.3%(9/14),28.6%(4/14)和7.14%(1/14).Genbank中蛋白质同源性分析显示,肽A、B、C均不与钠泵蛋白同源.放射性配基受体结合法检测结果表明,合成的肽A能够与哇巴因结合.哇巴因特异性结合短肽的获得将为阻遏内源性哇巴因与钠泵的结合、防治高血压奠定基础.