HPV16L1—E7重组腺病毒rAd5HPV16L1—E7的构建及克隆表达

目的：研制人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｌ１－Ｅ７重组腺病毒,以期获得防治宫颈癌的组腺病毒减毒活疫苗和嵌合病毒样颗粒疫苗。方法：以ＨＰＶ１６型－１１４／Ｋ为模板,利用ＰＣＲ克隆技术构建可表达ＨＰＶ１６主要宙蛋白Ｌ１（１－３０１ａａ）和转蛋白Ｅ７（１－６０ａａ）融合基因的重组质粒ｐＵＣ１９Ｌ１－ｐＨＢＧ１０共转染２９３细胞,制备重组腺病毒ｒＡｄ５ＨＰＶ１５６Ｌ１－Ｅ７,密度梯度超速离心纯楷ＨＰＶ     

携带HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定

①目的构建携带人乳头瘤病毒16型（HPV16）E7病毒癌基因的复制缺陷型重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-E7。②方法应用PCR技术从宫颈癌组织中扩增E7病毒癌基因全长片段,并导入T载体进行测序,与Nucleotide中HPV16标准毒株序列比较鉴定。目的基因及穿梭质粒载体pAdTrack-CMV分别经Bgl Ⅱ和Hind　Ⅲ双酶切后连接,转化宿主菌E．coli DH5α,应用PCR法及限制性内切酶消化法双重鉴定重组质粒,并测序。③结果PCR扩增产物与Nucleotide中HPV16E7序列一致,重组穿梭质粒经Bgl　Ⅱ和Hind　Ⅲ双酶切后电泳,可观察到9220bp大小的载体条带和313bp大小的目的基因条带;将经PCR和双酶切鉴定的重组阳性克隆测序,结果证实克隆成功。④结论成功地构建了携带HPV16E7基因的重组腺病毒穿梭质粒。     

人乳头瘤病毒HPV16L1—E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质业中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９－７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２－８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的Ｔ－Ａ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ＰＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产竽相同粘末端的特点,     

HPV16L1ORF的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的获得足够量的人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1融合蛋白及含HPV16L1ORF序列的基因重组体。方法通过PCR扩增获得HPV16L1基因片段,将此片段插入原核细胞表达载体pGEMEX-1,构建相应的重组表达质粒pGEMEX-L1,将此质粒转化大肠杆菌JMl09(DE3),得到的转化子经IPTG诱导表达后进行菌体蛋白的Western blotting免疫印迹分析。结果HPV16L1基因重组体构建成功,克隆的目的基因片段在大肠杆菌中产生的融合表达产物在Western blotting检测中具有和抗HPV16L1阳性血清反应的抗原性。结论HPV16L1基因片段可在大肠杆菌中得到有效表达,表达产物可与相应的抗血清发生阳性反应。     

表达HPV16 L1、L2E7蛋白的非复制重组痘苗病毒的构建和鉴定

目的:构建防治宫颈癌的表达人乳头瘤病毒16型、HPV16)L1、L2E7蛋白的非复制重组痘苗病毒疫苗株.方法:以痘苗病毒为载体,利用同源重组技术筛选共表达HPV16 L1、L2E7蛋白的重组痘苗病毒,用PCR和Western-blot技术进行鉴定.结果:该病毒在鸡胚成纤维细胞(CEF)中连续传代15代,经PCR检测证实病毒基因组中有HPV16 L1、L2E7目的基因插入,Western-blot检测证实病毒可以稳定表达L1、L2E7蛋白.结论:构建的病毒NTVJL1L2E7可以在真核细胞中表达HPV16 L1、L2E7蛋白,可以作为治疗和预防HPV16相关疾病的候选疫苗.     

HPV16L1ORF的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：获得足够量的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｌ１融合蛋白及含ＨＰＶ１６Ｌ１ＯＲＦ序列的基因重组体。方法：通过ＰＣＲ扩增获得ＨＰＶ１６Ｌ１基因片段，将此片段插入原核细胞表达载体ｐＧＥＭＥＸ－１，表达后进行菌体蛋白质Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ免疫印迹分析。结果：ＨＰＶ１６Ｌ１基因重组体的构建成功，克隆的目的基因片段在大肠杆菌中产生的融合表达产物在Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测中个有抗     

人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组质粒的构建及其细胞的免疫性

目的:构建HPV16L1-E7C重组质粒并研究其细胞免疫性。方法:利用基因克隆技术将HPV16L1-E7CDNA片段定向插入pcDNA3.1载体,构建重组质粒pcDNA16L1-E7C,然后将其免疫C57BL/6小鼠,利用T淋巴细胞增殖试验检测免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖能力,同时利用ELISA试验检测免疫小鼠的脾淋巴细胞分泌γ-干扰素(IFN-γ)的水平。结果:特异性T细胞增殖试验中实验组3H-TdR掺入率为18339±1972,对照组为6737±1243,实验组小鼠T细胞增殖水平明显高于对照组(P<0.05)。DNA免疫后实验组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平为0.89±0.56,对照组为4.81±1.33,两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:重组质粒能增强小鼠的细胞免疫功能。     

HPV16L1E7的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：研究人乳头瘤病毒(HPV)的主要衣壳蛋白L1和主要的转化蛋白E7的融合基因在原核细胞中的表达，为研制HPVl6L1E7疫苗和诊断试剂盒提供依据。方法：采用聚合酶链反应(PCR)以重组质粒pUCl9UE7为模板扩增HPVl6L1E7基因片段，克隆至载体pMDl8-T中，并用限制性内切酶将HPVl6L1E7基因切下，克隆至原核表达质粒pQE30中，经IPTG诱导表达，再使用SDS-PAGE和蛋白印迹检测其抗原性和表达水平。结果：HPVl6L1E7融合蛋白能被抗HPVl6L1抗体识别，分子量为66KD，经IPTG诱导4h后，表达的HPVl6L1E7融合蛋白占菌体总蛋白量的25％以上。结论：成功构建的表达载体pOE30-L1E7可在原核表达细胞中高效表达，且表达出的HPVl6L1E7融合蛋白具有反应活性，可与HPVl6抗体发生反应。     

HPV16-E7H2P融合钙网蛋白基因重组腺病毒载体疫苗的构建与免疫学鉴定

目的 构建表达钙网蛋白(CRT)与乳头瘤病毒16型E7基因H2P突变型(HPV16-E7H2P)融合蛋白重组腺病毒载体(Ad-CRT/HPV16-E7 H2P),为研发新型乳头瘤病毒治疗性疫苗奠定基础.方法 首先利用RT-PCR的方法扩增CRT基因,并进一步构建CRT与HPV16-E7H2P基因融合重组的pJW4303表达载体,将目的基因加上特定的CACC接头后克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆.经过入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应获得表达克隆Ad-CRT/HPV16-E7 H2P.表达克隆线性化后转染HEK293A包装细胞,得到重组腺病毒.结果 构建的Ad-CRT/HPV16-E7H2P经PCR和测序鉴定构建正确;转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.95 × 1011 pfu/mL,该重组病毒载体能正确表达CRT/HPV16-E7H2P融合蛋白.结论 成功构建了Ad-CRT/HPV16-E7H2P,为HPV慢性感染以及宫颈癌的防治奠定了基础     

HPV16E6羧基端编码基因的克隆及真核细胞表达

目的探讨用人乳头瘤病毒16型(HPV16)早期基因E6羧基端基因片段(E6C)研制DNA疫苗的可行性。方法采用PCR方法从质粒pHPVl6中获得E6C端基因片段,将其克隆入含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体,脂质体介导基因转染LA795小鼠肺腺癌细胞并检测E6C的表达。结果成功构建了真核表达质粒pLNCE6C,免疫组化结果显示真核表达质粒pLNCF6C在LA795细胞中获得有效表达。结论选择去除转化功能区的E6C端基因构建真核表达质粒是一有益的尝试,为进行动物DNA免疫试验奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1的纯化

目的 :探讨人乳头瘤病毒 16型主要衣壳蛋白 L 1的纯化方法。方法 :分别利用亲和层析和离子交换层析对重组融合蛋白 p ET30 a- 6× His- L 1进行了纯化。结果 :以包涵体形式表达的重组蛋白在变性条件下经 Ni- NTA Agarose、Q- Sepharose FF纯化 ,透析复性后均获得较高纯度 ,回收率分别为 30 %和2 9%。结论 :亲和层析和离子交换层析都是纯化重组 L 1蛋白的适宜方法 ,二者纯化效率相当。     

CONSTRUCTION AND IMMUNOGENICITY OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 6B L1 RECOMBINANT PLASMID

Objective To construct a DNA vaccine as a prophylactic model to prevent condyloma acuminatum and detect its immunogenicity in mice. Methods The major capsid protein (L1) gene of human papillomavirus (HPV) 6b was inserted into an eukaryotic expression plasmid (pcDNA3.1). The recombinant plasmid was transfected into COS-7 cells. Western blot were performed to detect whether L1 protein can be expressed in eukaryotic cells. Eighteen female BALB/c mice were tested for immunogenicity study. Results The recombinant plasmid (pcDNA3. 1-HPV6bL1) was verified as HPV6b L1 gene by sequencing. Western blot showed specific strip. Anti-L1 protein antibodies could be detected in the mice‘s sera inoculated with pcDNA3.1-HPV6bL1. Similarly, IL-4, IL-2, and IFN-γ were increased in the same mice. Conclusion HPV6b L1 recombinant plasmid was constructed successfully which had immunogenicity for BALB/c mice. It provided experimental evidence for the research of DNA vaccine of condyloma acuminata.     

细菌内同源重组构建携带人DMT1基因的重组腺病毒

目的 利用细菌内同源重组法构建携带二价金属离子转运蛋白1(DMT1)编码基因的重组腺病毒.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人胚近段小肠中获取人的全长DMT1-IRE的cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-DMT1-IRE,在感受态大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy1同源重组,利用卡那霉素抗性平板初步筛选重组质粒阳性克隆,经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定获得到重组腺病毒载体pAdEasy1-DMT1-IRE.线性化的重组质粒转染HEK293细胞,获得高滴度的重组腺病毒.结果 RT-PCR反应扩增出1 841 bp的片段,重组质粒阳性克隆pAdEasy1-DMT1-IRE经PacⅠ酶切后获得一大于20 kb的大片段和4.5 kb的特征性片段,PCR鉴定扩增出DMT1的片段,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的 基因DMT1-IRE.转染293细胞后细胞表达GFP荧光,显示293细胞稳定表达外源性的DMT1-IRE基因.结论 携带DMT1-IRE基因的重组腺病毒质粒构建成功,获得高滴度的重组腺病毒,为DMT1基因进一步功能的研究提供基础.     

人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的ＴＡ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ｐＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产生相同粘末端的特点,产生Ｌ１Ｅ７Ｃ重组基因片段,将其克隆入质粒ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔｓｋ,构建了ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ重组克隆质粒,ＨｉｎｄⅢ、ＸｈｏⅠ酶切ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ,释放Ｌ１Ｅ７Ｃ基因片段,定向重组入ｐＣＡ１４腺病毒载体,成功构建真核表达载体ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组腺病毒载体：ｐＣＡ１４Ｌ１Ｅ７Ｃ,为研制ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组Ａｄ５载体疫苗和ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ嵌合蛋白疫苗打下基础     

HPV16L2开放读码框编码表位的基因克隆和表达

利用质粒p16L2Ex6-3和pATH10,制备了含有HPV16L2ORF编码表位的基因克隆p16L2REx6-3。将此重组质粒转化大肠杆菌HB101,并诱导其有效表达,产生一分子量约为40KD的含有E.coli trpE的融合蛋白。Western blot分析结果表明,此蛋白可与感染HPV16的患者血清呈阳性免疫反应,提示该克隆的表达蛋白具有HPV16,的型抗原特异性。     

腺病毒和腺伴随病毒基因元件提高白细胞介素6在真核细胞中的表达效率

目的：构建高效真核表达载体以提高细胞因子在真核细胞中的表达效率。方法：利用基因克隆技术构建了两个新的白细胞介素６（ＩＬ６）真核表达载体ｐＡｄＣＩＩＬ６和ｐ３３５ＣＩＬ６。将它们瞬时转染ＣＯＳ７细胞后，利用ＩＬ６依赖株７ＴＤ１对上清中的ＩＬ６进行检测。结果：两种新建载体分别能提高ＩＬ６在真核细胞中的表达效率５．５和３．４倍。结论：腺病毒的病毒相关Ⅰ和ⅡＲＮＡ（ｖｉｒｕｓａｓｏｃｉａｔｅｄⅠａｎｄⅡＲＮＡ，ＶＡⅠａｎｄＶＡⅡ）和腺伴随病毒（ａｄｅｎｏａｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）的倒转末端重复序列（ｉｎｖｅｒｔｅｄｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）能提高细胞因子在真核细胞中的表达     

融合基因GM-CSF-BZLF1重组腺病毒表达载体的构建

目的构建粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和EB病毒即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法采用逆转录-聚合酶链反应分别获得GM-CSF和BZLF1编码序列的cDNA,应用剪接式重叠延伸(SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行连接,构建融合基因GM-CSF-BZLF1。将融合基因GM-CSF-BZLF1定向亚克隆至pAdTrack-CMV质粒,在原核细胞E.coliBJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,构建融合基因GM-CSF-BZLF1真核表达载体pAd-GM-CSF-BZLF1。将真核表达载体pAd-GM-CSF-BZLF1转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒vAd-GM-CSF-BZLF1。RT-PCR鉴定感染重组腺病毒的293细胞中GM-CSF-BZLF1基因的表达。结果 GM-CSF-BZLF1基因插入重组腺病毒表达载体的预期位置,且插入序列完全正确;感染重组腺病毒vAd-GM-CSF-BZLF1的293细胞中检测到融合基因GM-CSF-BZLF1的转录表达。结论成功地构建了融合基因GM-CSF-BZLF1重组腺病毒表达载体,为进一步探讨GM-CSF-BZLF1的功能提供了理论基础和实验依据。