汉坦病毒M和S片段基因的克隆及在成纤维细胞中的瞬时表达

目的构建汉城病毒M片段和汉滩病毒部分S片段的重组基因pEGFP-M-S，并在成纤维细胞L929中进行瞬时表达。方法用PCR方法克隆分别装在两个模板载体中的部分M片段，连接人pcDNA3．1载体，利用简并密码子得到完整的M片段。将汉城病毒M片段开放阅读框全长3．4kb的基因与装有汉滩病毒S片段5’末端0．7kb基因的载体pEGFP-HTNV-S0．7用酶切位点连接，构成4．1kb的重组基因，并转染成纤维细胞，进行48h、72h表达。结果成功得到预期大小的4．1kb的重组基因，并在成纤维细胞中进行了瞬时表达。结论汉城病毒M片段和汉滩病毒部分S片段基因的重组基因在成纤维细胞中瞬时表达，产生了M片段的约70kD和55kD的两个糖蛋白，并在与S片段拼接处经蛋白酶切割产生了约26kD的核蛋白，免疫印迹分析产生的约26kD的蛋白具有抗汉坦病毒的抗原活性。     

糖基转移酶-2基因silD在大肠埃希菌中的克隆与表达

从伊纽小单孢菌（Micromonospora inyoensis）扩增参与西索米星生物合成的糖基转移酶基因silD（1181bp），并分别将其克隆到pUC18和表达载体pET-30a上。其开放性阅读框长1173bp，编码含390aa（43．04ku）的多肽链，在大肠埃希菌BL21（DE3）：：pET-silD中实现表达。基因silD的碱基序列与gntD（来自M．echinospora）的碱基序列的同源性高达94％。预测的silD蛋白序列与GntD的同源性为98％。这是继从依纽小单孢菌克隆参与生物合成西索米星的抗性基因srml（AY661430）、西索米星2-脱氧蟹肌醇合成酶基因sisB（DQ250993）和糖基转移酶基因sisZ（DQ250994）后，克隆到的又一新基因。该基因在GenBank的接受号为DQ250992。基因silD的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

人脂联素基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人脂联素（adiponectin）基因，并在大肠杆菌宿主系统中高效表达出adiponectin蛋白进行鉴定。方法：从人皮下脂肪组织提取总RNA，确认其正确性后经RT-PCR扩增得到全长cDNA片段，此片段经纯化回收后克隆至pMD 18-T载体，经行DNA序列分析，进一步克隆构建到表达载体至pET-DEST42中，用IPTG在大肠杆菌中诱导表达。结果：含重组adiponeetin质粒的大肠杆菌经0．4mmol／L的IPTG诱导6h后有高表达。结论：adiponeetin基因的克隆构建和在大肠杆菌中的表达获得成功。     

人体β-防御素-3突变基因的构建及在大肠埃希菌中的融合表达

目的从人正常皮肤组织中提取β-防御索-3基因进行定点突变后在E．coli中融合表达。方法从人正常皮肤组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到编码β-防御素-3成熟肽的cDNA序列，测序正确后，寻找合适的突变位点，设计含突变位点的引物，用PCR重叠延伸法对β-防御素-3成熟肽cDNA序列进行定点突变，将突变产物克隆至pUC18进行序列测定及在E．coli中融合表达。结果测序结果表明，经RT—PCR所得的β-防御素-3成熟肽序列与GeneBank中报道的编码人β-防御索-3成熟肽的cDNA序列完全-致。经过突变β-防御素-3成熟肽第29位谷氨酰胺密码子由CAG突变为精氨酸密码子CGA，其余核苷酸序列均未发生变化。将突变β-防御素-3基因在E．coli中诱导表达3～5h后可见突变β-防御素-3蛋白表达。结论成功构建并表达了β-防御素-3突变体基因，为进-步对突变体进行真核表达、生物活性研究奠定了基础。     

天蚕素A截短肽在大肠埃希菌中的高效表达及活性分析

将构建好的含抗菌肽天蚕素A(cecropin A,CA)截短肽CA19(36、210)1～5倍串连体的pET-31b(+)载体进行诱导表达,其表达量比单体表达明显提高.将融合蛋白用亲和层析法将其纯化,其纯度达到90%以上.纯化融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备了其特异的多克隆抗体.纯化串连融合蛋白用溴化氰切割成单体检测其活性,发现均具有抑菌活性.本研究为抗菌肽的基因工程制备提供了新途径.     

产ESBLs大肠埃希菌基因型分布及耐药性分析

目的探讨大肠埃希菌的耐药性特点和产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株的基因型分布。方法对临床分离的128株大肠埃希菌进行耐药性统计和产ESBLs菌基因型分析。结果产ESBLs菌株对临床常用抗菌药物的耐药率远高于非产ESBLs菌株;产ESBLs菌株对氨苄西林、氨曲南和头孢噻肟的耐药率分别为85.7%(48/56)、89.3%(50/56)和96.5%(54/56);而非产ESBLs菌株对氨苄西林、氨曲南和头孢噻肟的耐药率分别为68.1%(49/72)、69.4%(50/72)及76.4%(55/72);产ESBLs菌株CTX-M型、TEM型及SHV型基因的阳性率分别为85.7%(48/56)、8.9%(5/56)、5.4%(3/56)。结论产ESBLs菌株在临床分离的大肠埃希菌中已较为普遍,且耐药率高,临床应根据药敏及耐药基因合理使用抗菌药物。     

大肠杆菌测试片在吡拉西坦片大肠埃希菌检查中的应用

目的 探讨大肠杆菌测试片在吡拉西坦片大肠埃希菌检查中替代药典方法的可行性。方法 采用替代方法验证指导原则的有关规定,对定性检验的各项验证参数进行实验研究,并与药典方法进行比较。结果 经统计,测试片法的各项验证参数均与药典方法相当,结果无显著性差异(P>0.05)。结论 大肠杆菌测试片具有结果准确、操作简便的特点,可作为吡拉西坦片大肠埃希菌检查的替代方法。     

我院2013年大肠埃希菌分布与耐药性分析

目的：了解南方医科大学附属郑州人民医院2013年大肠埃希菌分布及其对常用抗菌药物的耐药性,为临床选择抗菌药物提供参考。方法对2013年各科室标本中分离的630株大肠埃希菌进行抗菌药物敏感试验,依据2010年 CLSI 标准判读,并进行分析。结果630株大肠埃希菌中以中段尿、脓液及痰液检出最多,分别占50.00％、26.67％、17.94％。大肠埃希菌对一、二、三代头孢菌素,庆大霉素及喹诺酮类药物的耐药率较高,对阿米卡星、头孢西丁、碳青霉烯类抗菌药物、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦的敏感性好,但出现了2株耐碳青霉烯类抗菌药物的大肠埃希菌。结论大肠埃希菌是泌尿道感染的常见致病菌,其对常用的抗菌药物耐药率较高。规范使用抗菌药物对防止和延缓细菌耐药具有重要意义。     

泌尿道感染大肠埃希菌476株耐药分析

目的：了解医院泌尿道感染的主要病原菌及大肠埃希菌的耐药性,指导临床合理用药。方法对2011年2月至2013年11月该院住院及门诊尿路感染患者尿培养分离出的476株大肠埃希菌进行药敏分析。结果尿路感染476株大肠埃希菌中产ESBLs菌株检出率为62.4%;大肠埃希菌对阿米卡星、美罗培南、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦和头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低,对青霉素类、头孢类及喹诺酮类耐药率较高,产ESBLs 株耐药率明显高于非产ESBLs。结论泌尿道感染中大肠埃希菌分离率最高,且细菌耐药严重,特别是产ESBLs株耐药更为严重,应当加强细菌耐药监测,指导临床合理选用抗菌药物,减缓耐药菌株的产生。     

大肠杆菌偏嗜性人胰岛素样生长因子1基因的克隆及表达

目的：提高以大肠杆菌为工程菌制备重组人胰岛素样生长因子1（rhIGF-1）的产率。方法：依据大肠杆菌遗传密码子使用频率表，人工合成3条DNA单链，PCR拼接扩增出适于在大肠杆菌中表达的人IGF-1基因。将此基因克隆入pGEM-T载体进行DNA序列分析后亚克隆入表达载体pBV220，诱导表达，表达产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定，酶联免疫分析（ELISA）检测表达产物中rhIGF-1的含量。结果：经基因改造后．rhIGF-1主要以包涵体的形式存在于碎菌后的沉淀中，其产率较改造前提高近4倍。结论：所构建的大肠杆菌偏嗜性人IGF-1基因可显著提高rhIGF-1的产率。     

突变型人白细胞介素-2基因在大肠杆菌中的表达

目的：建立突变型人白细胞介素-2（rhIL-2）基因大肠杆菌表达系统，为rhlL-2的生产及临床应用奠定基础。方法：自人胎盘组织中提取总RNA，逆转录PCR（RT-PCR）扩增突变型人IL-2基因cDNA，通过对下游引物的设计将编码125位半胱氨酸（c125）的密码子TGT更改为编码丝氨酸的密码子TCT。构建表达型重组质粒pBV-IL-2，温度诱导表达．表达产物行SDS一聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）及WesternBlot鉴定。结果：DNA序列分析证实，重组质粒pBV-IL-2含有突变型人IL-2编码序列及正确的开放读码框架。SDS-PAGE显示，诱导表达碎菌后的沉淀中有分子质量大小约为16．5ku的外源蛋白产生。经Western印迹（WesternBlot）证明为rhlL-2。结论：成功构建了突变型人白细胞介素-2大肠杆菌表达系统。表达产物主要以包涵体的形式存在于碎菌后的沉淀中。     

重组人干扰素大肠杆菌高效表达系统的建立

目的:构建重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)原核表达系统,以获得rhIFN-α2b在大肠杆菌中的高效表达。方法:依据大肠杆菌遗传密码子频率表,在不改变氨基酸组成的情况下,人工半合成适于在大肠杆菌中表达的rhIFN-α2b编码序列;经PCR扩增后,克隆人表达型质粒载体pDH;筛选阳性菌落,温度诱导表达,表达产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(WesternBlot)鉴定,并以人羊膜细胞-水泡性口炎病毒(WISH-VSV)系统鉴定rhIFN-α2b抗病毒活性。结果:PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定可见与预期大小符合的512bp的DNA条带;重组质粒pDH/IFN-α2b经序列分析,证实含有与预期相符且读码框架正确的hIFN-2b编码序列;SDS-PAGE可见与IFN-α2b分子质量大小一致的蛋白质条带,WesternBlot鉴定此条带为rhIFN-2b,其比活性达(1.8～2)×108U/mg。结论:rhIFN-α2b在大肠杆菌中的高效表达系统构建成功,且能高水平地表达出具有生物活性的rhIFN-α2b。     

人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测

目的:在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。方法:利用PCR技术扩增人脂联素基因完全编码序列,选用Gateway原核表达体系,经过BP反应、LR反应两步反应,将PCR产物克隆入pET-DEST42质粒,构建融合表达载体pET-DEST42/attB-adiponectin,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达脂联素融合蛋白,经镍柱亲和层析纯化,NDSB201高效复性后,使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞,RT-PCR法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖-6-磷酸酶转录水平的影响。结果:成功构建了表达载体pET-DEST42/attB-adiponectin,DNA序列测定结果与预期一致。IPTG诱导表达的融合蛋白经纯化后Western Blot鉴定具有人脂联素抗原性,并可使培养的肝细胞中葡萄糖-6-磷酸酶转录水平下降。结论:获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一步研究脂联素的生理机制奠定了基础。     

蛇毒蛋白基因的大肠杆菌表达研究进展

蛇毒是多种生物活性蛋白和多肽的混合物，由于蛇毒在基础医学和临床上的特殊作用以及天然蛇毒蛋白获取方法的局限性，采用生物工程方法规模化生产高纯度的蛇毒蛋白已成为当前及今后的研究方向。该文就蛇毒蛋白基因在大肠杆菌中表达的研究近况进行介绍。     

人过氧化氢酶基因的克隆与表达

目的利用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达人过氧化氢酶(catalase,CAT)。方法从人cDNA文库中获得CAT编码基因,并利用pMAL-c2x、pBV221质粒分别构建了融合和非融合表达载体并进行了表达和活性检测。结果融合表达与非融合表达均可获得可溶性蛋白质,非融合的表达产物具有CAT活性,而融合表达产物在切除融合蛋白质(MBP)部分后表现出明显的CAT活性。结论从大肠杆菌表达体系能表达具有生物活性的CAT,此项研究为后续重组酶性质的研究和开发利用奠定了基础。     

欧文氏菌SCB125中2—酮醛糖酸还原酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

根据酶活测定PAGE活性染色初步证明欧文氏菌SCB125中存在酶活较高的2－酮醛糖酸还原酶（2－KR）,能够以2,5－二酮－D－葡萄糖酸（1）、2－酮－L－古洛糖酸（2）古洛糖酸（2）或者2－酮－D－葡萄糖酸（3）为底物。抽提欧文氏菌染色体DNA为模板,利用PCR技术扩增,克隆得到两个2－KR酶基因(tkrA和tkrB)通过酶切和测序证明：2－KR A基因发生多处突变,而－KR B基因保守,将含有这两个基因的片段分别连接到表达载体PBL并转化大肠杆菌DH5α后,均获得高酶活表达,如果进一步用基因锡除的方法破坏欧文氏菌染色体上野生型2－KR基因,可以获得一个表达1还原酶的理想宿主,为实现从葡萄糖一步发酵生产维生素C前体2打下基础。     

Persephin基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :获取Persephin(PSP)基因并实现其高效表达。 方法 :利用PCR方法以染色体DNA为模板 ,扩增编码人PSP成熟蛋白的基因片段 ,将其克隆于 pUC19质粒 ,进行序列分析 ,将基因重组于硫氧还蛋白融合表达载体pThioHisA并进行表达。结果 :序列分析结果与文献报道一致 ,表达的hPSP占菌体总蛋白质 15 %左右。结论 :人PSP基因在大肠杆菌Top10中获得了高效、稳定表达 ,为进一步的基础研究与临床应用奠定了基础。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达

目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子 1(hIGF 1) ,构建hIGF 1原核表达载体 ,并进行表达与纯化。方法以pUCIGF质粒为模板 ,PCR扩增了hIGF 1基因。经适当酶切后 ,构建表达载体pRSET IGF ,转入大肠杆菌BL2 1(DE3)进行表达 ,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化。结果带有重组质粒pRSET IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,以可溶性形式表达 7.8kD大小的蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白量的10 %～ 2 0 % ,纯化后目的蛋白纯度达 95 %以上 ,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF 1抗原活性。结论构建了pRSET IGF重组质粒 ,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达 ,为获得大量基因工程产品奠定了基础