干扰素γ和肿瘤坏死因子α对乙型肝炎病毒转录后调节序列功能的影响

目的　探讨干扰素γ(IFN γ)和肿瘤坏死因子α(TNF α)对乙型肝炎病毒转录后调节机制的影响。方法　在体外构建含有乙型肝炎病毒转录后调节序列 (HPRE)片段的pDM1 38质粒 (含有CAT报告基因 ) ,应用脂质体介导方法转染HepG2 细胞 ,观察IFN γ和TNF α对重组质粒载体CAT报告基因活性表达的影响 ,CAT基因活性的检测采用ELISA检测试剂盒。结果　成功构建了含有HPRE片段的重组质粒载体。转染重组质粒的HepG2 细胞CAT基因活性表达明显增强 ,而转染空载体的HepG2 细胞仅有本底表达 ,分别为 896pg ml± 2 1 4pg ml和 37pg ml± 1 1pg ml。IFN γ和TNF α对转染重组质粒的HepG2 细胞CAT活性表达的影响均具有浓度依赖性 ,而对空载体CAT活性的表达无影响。转染重组质粒的HepG2 细胞在未加入细胞因子时 ,其CAT表达活性为 896pg ml± 2 1 4pg ml;与IFN γ、TNF α及IFN γ +TNF α孵育后 ,其CAT表达活性分别为 32 4pg ml± 57pg ml,396pg ml± 82pg ml,1 75pg ml± 36pg ml,与未加入时比较 ,t=5 1 9,4 39,6 68,P <0 0 1 ,差异有显著意义。结论　IFN γ和TNF α可能通过抑制HPRE的功能 ,调控乙型肝炎病毒基因的表达     

三种抗纤维化细胞因子对HepG2细胞转化生长因子-β1基因启动子转录活性的影响

目的:观察抗肝纤维化细胞因子白介素10(IL-10)、肝细胞生长因子(HGF)和干扰素γ(IFN-γ)对含不同-509C＞T基因型的转化生长因子β1(TGF-β1)基因上游启动子转录活性的影响,探讨细胞因子可能的抗肝纤维化机制.方法:以TGF-β1基因上游5'侧翼区启动子(-1328 ～ 812)含有-509C＞T 位点的片段作为靶序列,将其与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因组成重组体phTGF2.14C、phTGF2.14T,脂质体法转染至人肝癌细胞系HepG2,应用IL-10(4 ng/ml)、HGF(10 ng/ml)和IFN-γ(20 ng/ml)作用于转染后HepG2细胞,ELISA法测定报告基因的表达.结果:转染phTGF2.14C的HepG2细胞报告基因活性明显高于转染phTGF2.14T者(P＜0.01).IFN-γ对转染phTGF2.14C、phTGF2.14T的HepG2细胞TGF-β1启动子转录活性均具有明显的抑制作用(P＜0.05),HGF对转染phTGF2.14C HepG2细胞的TGF-β1启动子转录活性具有促进作用(P＜0.05),IL-10对两种情况下HepG2细胞TGF-β1启动子转录活性调控作用均不显著.结论:C等位基因可明显增强TGF-β1基因启动子转录活性;IFN-γ可能通过抑制TGF-β1基因启动子转录活性抑制肝纤维化,而HGF、IL-10的抗纤维化作用可能与此途径无关.     

干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定

目的:利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达的载体,并进行活性鉴定.方法:设计表达短发夹RNA的互补DNA序列,经退火成双链,克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析.构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞,检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化,确定重组质粒的活性.结果:构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2.酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达.结论:成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体.     

髓系细胞触发受体-1真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建髓系细胞触发受体-1(TREM-1)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从人外周血总RNA中扩增TREM-1 基因的全长cDNA,插入克隆载体pUCm-T,BamH I和Pst I,酶切后将目的片段插入真核表达载体pEGFP-C3,构建含有TREM-1的重组质粒pEGFP-TREM-1,转染293细胞,用荧光显微镜观察、Western-blot鉴定蛋白表达.将pEGFP-TREM-1重组质粒转染THP-1细胞,100 ng/ml LPS刺激24 h后,半定量RT-PCR检测TNF-α和IL-1β基因的 mRNA水平.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为TREM-1基因;经转染的293细胞在荧光显微镜下可见荧光,并能表达TREM-1蛋白;重组TREM-1蛋白具有生物学活性,能增强TNF-α和IL-1β基因的mRNA水平.结论:成功构建了能够表达TREM-1的真核表达质粒pEGFP-C3-TREM-1,为进一步研究该基因的功能奠定了实验基础.     

重组人PPARα基因载体phPPARα-IRES2-EGFP高效体外转染表达体系的建立

目的 建立体外phPPARα-IRES2-EGFP质粒高效转染并获得重组基因hPPARα高效表达的体系.方法 采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将phPPARα-IRES2-EGFP转染入293细胞,荧光显微镜观察质粒转染的293细胞绿色荧光蛋白(GFP)报告基因表达强度及转染效率,并对转染细胞hPPARα的表达进行荧光定量PCR和Western Blot检测.结果 荧光显微镜下可见转染phPPARα-IRES2-EGFP的293细胞GFP报告基因高表达,转染效率高达(83±9)%;并且,其hPPARα mRNA表达水平高于空载体转染对照组3个数量级,hPPARα蛋白表达也远高于对照组(P＜0.01),说明导入的重组质粒能够高效表达bPPARα.结论 成功建立重组质粒phPPARα-IRES2-EGFP高效体外转染表达体系,为hPPARα受体功能的研究及基于hPPARα为靶标的药物筛选平台的建立奠定了基础.     

人HIF-1α基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的重组腺病毒载体,并观察其对HepG2细胞的转染情况.方法 采用基因工程技术,经过亚克隆将人HIF-1α基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,经脂质体转染HEK293细胞,进行重组腺病毒的包装、扩增.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HepG2细胞感染效率的监测.结果 酶切鉴定及PCR结果证明重组腺病毒载体成功,人HIF-1α重组腺病毒滴度达1.15×1010 pfu/ml,阴性对照腺病毒的滴度为8×1010 pfu/ml,并对HepG2细胞具有很强的感染力.结论 应用细菌内同源重组法成功构建了含人HIF-1α基因的重组腺病毒载体.     

TNF-α拮抗胰岛素样生长因子-1对人α1(Ⅰ)胶原启动子的激活

目的:探讨TNF-α对胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)激活人α1(Ⅰ)胶原启动子的作用.方法:构建含不同长短α1(Ⅰ)胶原启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的重组体pCOLH1 0.27,pCOLH1 2.5;用脂质体法瞬时转染至NIH3T3细胞和人皮肤成纤维细胞中,加入IGF-1或(和)TNF-α,测定CAT活性.结果:100 ng/ml IGF-1可使转染至NIH3T3细胞的pCOLH1 0.27和pCOLH1 2.5表达的CAT活性分别增高至对照的(5.4±0.25)倍与(5.8±0.3)倍, 使转染至人皮肤成纤维细胞的这两个重组体表达的活性分别增高至对照的(4.5±0.22)倍与(4.9±0.2)倍.而TNF-α能抑制IGF-1诱导的pCOLH1 2.5活性.结论:TNF-α在转录启动水平抑制IGF-1对人α1(Ⅰ)胶原基因表达的促进作用.     

杆状病毒载体介导的氯霉素乙酰转移酶基因在HepG2中的表达

目的 重组杆状病毒AcMNPV载体并观察其在人肝癌细胞株中的基因转移效率及表达。方法 用PCR方法获得氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因及CMV与核因子（NFκB）启动子和增强子序列,并插入AcMNPV中,用同源重组方法获得CAT重组杆状病毒。分别感染昆虫细胞Sf5和人肝癌细胞株HepG2或HepG2.2.15细胞,测定CAT表达相对活性。结果 由CMV启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2或HepG2.2.15细胞均可表达CAT,而NFκB启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2细胞中CAT表达低,而在有HBV表达的HepG2.2.15细胞中有较高的CAT表达活性。结论 重组杆状病毒能在人肝癌细胞中表达外源基因,而且成功构建了HBV感染细胞特异性表达的杆状病毒载体。     

干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α对表达乙肝病毒的HepG2.2.15细胞的协同致凋亡作用

目的研究干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对表达乙肝病毒的HepG2.2.15细胞的协同致凋亡作用及其意义。方法光学显微镜观察细胞形态,MTT方法定量测定细胞成活力,用琼脂糖凝胶电泳阶梯状条带分析有无凋亡。结果1 000U/mL IFN-γ单独或与5ng/mL TNF-α联合能诱导表达乙肝病毒的HepG2.2.15细胞凋亡。用拉米夫定抑制乙肝病毒能降低IFN-γ和TNF-α对HepG2.2.15细胞的致凋亡作用。结论IFN-γ和TNF-α对表达乙肝病毒的HepG2.2.15细胞有协同致凋亡作用。拉米夫定能降低IFN-γ和TNF-α对HepG2.2.15细胞的致凋亡作用。     

杆状病毒载体介导的氯霉素乙酰转移酶基因在HepG2中的表达

目的 重组杆状病毒AcMNPV载体并观察其在人肝癌细胞株中的基因转移效率及表达。方法 用PCR方法获得氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因及CMV与核因子（NFkB)启动子和增强子序列,并插入AcMNPV中,用同源重组方法获得CAT重组杆状病毒,分别感染昆虫细胞Sf5和人肝癌细胞株HepG2或HepG2.2.15细胞,测定CAT表达相对活性。结果 由CMV启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2或HepG2.2.15细胞均可表达CAT,而NFkB启动子驱动的CAT重组杆状病毒在HepG2细胞中CAT表达低,而在有HBV表达的HepG2.2.15细胞中有较高的CAT表达活性。结论 重组杆状病毒能在人肝癌细胞中表达外源基因,而且成功构建了HBV感染细胞特异性表达的杆状病毒载体。     

纳米磁流体介导的重组质粒PEGFP-AFP-hTN Fα对肝癌细胞HepG2的体外杀伤作用

目的探讨纳米磁流体作为肝癌基因治疗载体的可行性及AFP增强子能否使外来基因在AFP阳性细胞内高表达。方法构建重组质粒PEGFP-AFP-hTNFα并通过纳米磁流体分别转染入AFP表达阳性的肝癌细胞HepG2及AFP表达阴性的宫颈癌细胞Hela。转染12h后，于荧光显微镜下动态观察；48h后，RT-PCR和Westemblot分析HepG2细胞中hTNFα基因的表达情况，用MTT法检测HepG2细胞的存活，用流式细胞分析HepG2细胞的凋亡。结果纳米磁流体能将重组质粒PEGFP-AFP-hTNFα转入HepG2细胞，并且其转染效率高于脂质体；RT-PCR及Westemblot证明转染的HepG2细胞有hTNFα基因的表达；MTT及流式细胞分析说明hTNFα基因发挥杀伤细胞作用。结论纳米磁流体能将重组质粒PEGFP-AFP-hTNFα转染HepG2细胞并获得表达，可作为肝癌基因治疗的基因载体。采用AFP增强子可使目的基因在HepG2细胞中定向而特异性表达。     

人胰岛素样生长因子ⅡP3启动子调控融合基因质粒构建的研究

目的构建人胰岛素样生长因子Ⅱ基因(IGF-Ⅱ)P3启动子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,观察其在肝癌细胞株HepG2及宫颈癌细胞株HeLa细胞中的表达及其作用。方法应用基因重组技术,构建IGF-ⅡP3启动子驱动EGFP与HSV-tk融合表达穿梭质粒载体,脂质体转染技术将其转入HepG2及HeLa中,48h后荧光显微镜下观察荧光表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HSV-tk和EGFP的mRNA表达,四甲基偶氮唑蓝实验检测转染融合蛋白载体后给予不同浓度的更昔洛韦对HepG2及HeLa细胞毒作用。结果酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功;转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光;RT-PCR检测到HSV-tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达;更昔洛韦(GCV)对转染了携此质粒载体的HepG2细胞有选择性细胞毒作用,1、10、和100μg/ml3个浓度GCV作用72h后(实验均重复3次),对转染细胞的抑制率分别为19.8%±1.3%、36.2%±2.0%和48.7%±1.9%,与细胞病毒转染HepG2组(24.1%±1.9%、45.1%±1.7%、69.4%±3.6%)和此质粒转染HeLa细胞组(25.1%±1.6%、49.3%±1.1%、72.2%±2.9%)相比,差异有统计学意义(均P<0.01)。结论成功构建IGF-ⅡP3启动子驱动携带HSV-HSV-tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用,为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定基础。     

TNF-α regulates netrin-1 expression through enhancing promoter activity

目的 探讨TNF-α对netrin-1基因表达的影响,并对其调控机制作初步研究.方法 采用RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测TNF-α对netrin-1表达的影响.用PCR反应扩增netrin-1启动子序列,克隆至pGL3荧光素酶报告基因载体,转染HEK 293A细胞,通过检测荧光素酶活性观察TNF-α对netrin-1转录水平的表达调控.结果 TNF-α(20 ng/ml)能上调netrin-1的表达.成功构建pGL3 netrin-1-promoter荧光素酶表达载体,并证实构建的报告基因载体启动子具有活性;发现TNF-α可使netrin-1启动子活性增加(P＜0.05),并以剂量和时间依赖方式调节netrin-1启动子的活性.结论 细胞因子TNF-α可能通过调控启动子的活性而调节netrin 1的表达.     

小鼠胚胎成纤维细胞介导的IL-12抗S-180肿瘤作用

目的：将IL-12重组载体转染入小鼠成纤维细胞,研究探讨转染后的抗肿瘤作用.方法：取小鼠胚胎获得原代成纤维细胞,应用PEI法将IL-12重组载体转染到小鼠胚胎成纤维细胞,同时设对照.建立肉瘤细胞（S-180）荷瘤小鼠模型,分别接种S-180细胞.于注射瘤细胞后定期给予转染后的成纤维细胞瘤体内注射,并设对照组.于致瘤后第21日处死小鼠,测肿瘤质量; ELISA法检测小鼠血清IL-12及γ-干扰素（IFN-γ）的表达; 检测NK（natural killer cells）细胞活性和脾淋巴细胞增殖情况、CD4/IFN-γ、CD8/IFN-γ双标记阳性细胞的克隆能力.结果：抑瘤率、NK细胞活性及淋巴细胞增生反应、血清IL-12、IFN-γ水平、CD4/IFN-γ及CD8/IFN-γ双标记阳性细胞的百分率均高于对照组（P〈0.01）.结论：转染后的IL-12重组质粒可进一步增强机体的免疫功能发挥其抗肿瘤的治疗作用.     

重组质粒phPPARγ1-IRES2-EGFP高效体外转染表达体系的建立

目的:建立含人PPARγ1受体基因phPPARγ1-IRES2-EGFP重组质粒高效体外转染表达体系.方法:采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将phPPARγ1-IRES2-EGFP转染入293细胞,荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光蛋白(GFP)报告基因表达强度及其转染效率,并对转染细胞hPPARγ1表达进行荧光定量PCR和Western Blot分析.结果:荧光显微镜下可见转染phPPARγ1-IRES2-EGFP质粒的293细胞GFP报告基因高表达,转染效率为(83±11)%;荧光定量PCR和Western Blot检测结果表明,转染细胞hPPARγ1表达水平高于空载体对照组3个数量级,说明导入的重组质粒能够高效表达hPPARγ1.结论:成功建立phPPARγ1-IRES2-EGFP重组质粒高效体外转染表达体系,为hPPARγ1受体功能研究和基于hPPARγ1为靶标的药物筛选平台建立打下了良好的基础.     

热激活Rac-MEKK-JNK信号通路与hsp90β基因表达

目的探讨Rac-MEKK-JNK(Rac-丝裂原活化的蛋白激酶的激酶的激酶-C-jun N端蛋白激酶)信号通路对热诱导hsp90β基因表达的调控作用以及Hsp90蛋白对Rac信号通路传递的调节过程.方法将载体PcDNA3、显性负突变Rac(DN-Rac),显性负突变MEKK(DN-MEKK)和显性负突变JNK(DN-JNK)表达质粒分别与hsp90β基因转录调控片段介导的氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因质粒β3.1共转染Jurkat和LETPa-2细胞,采用以竞争性RT-PCR为基础的系统检测CAT报告基因转录水平.用Western印迹分析检测转染了DN-Rac、DN-MEKK和DN-JNK的细胞在热刺激前后c-Jun的表达水平和磷酸化状态.用体外激酶活性分析法检测geldanamycin(GA)对热诱导的JNK活性的影响.结果转染DN-Rac、DN-MEKK及DN-JNK均能抑制42℃1 h诱导的β3.1报告基因的表达,Jurkat细胞中CAT的热诱导表达分别为对照组的(72.8±5)%、(60±13.2)%及(47.7±12.1)%;LETPa-2细胞中CAT的热诱导表达分别为对照组的(16.17±5.1)%、(50.2±8.7)%及(47.5±10)%.转录因子c-Jun的表达和磷酸化水平也在一定程度上被抑制.GA处理细胞可明显抑制热诱导激活的JNK激酶活性和c-Jun的磷酸化水平,但不影响JNK和c-Jun的蛋白表达水平.结论Rac-MEKK-JNK通路参与hsp90β基因的热诱导表达,hsp90可能对热激活化的Rac信号通路有调节作用.     

乙型肝炎病毒X基因对大鼠肾小球系膜细胞增殖和肿瘤坏死因子α表达的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因表达的蛋白HBx对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(GMC)表达肿瘤坏死因子α(TNF-α)及细胞增殖的影响.方法 扩增HBV X基因,与pCI-neo载体连接,构建pCI-neo-X真核表达载体.采用脂质体法将其转染大鼠GMC,用Western blot法检测HBx的表达;以半定量RT-PCR测定体外培养大鼠GMC TNF-α mRNA的表达;采用ELISA法测定培养上清液中TNF-α的含量;MTT法测定细胞增殖.结果 HBx在转染pCI-neo-X的GMC中表达, 转染后36、48 h HBx表达明显.转染pCI-neo-X组GMC TNF-α mRNA的表达明显高于未转染和空载体转染组.细胞转染pCI-neo-X后培养36、48 h,上清液中TNF-α浓度分别为(185.3±70.7)、(140.3 ±42.1) pg/ml,而未转染组分别为(41.7±10.3)、(43.7±10.6)pg/ml,空载体转染组分别为(44.l±10.1)、(33.3±8.6)pg/ml,均明显低于转染pCI-neo-X组(均P<0.05).转染pCI-neo-X后可诱导GMC出现增生反应,且在转染后36、48 h最明显,与未转染和空载体转染组差异均有显著性意义(P<0.05).结论 HBx可诱导大鼠GMC增生,并在基因和蛋白水平上调GMC TNF-α表达. HBx对GMC的增殖作用可能与其诱导TNF-α的高表达有关.     

乙型肝炎病毒抑制α-干扰素诱导抗病毒蛋白表达的研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)对α-干扰素(IFN-α)诱导抗病毒蛋白表达的影响及其机制.方法 以人肝胚瘤细胞株HepG2为研究对象,将能够表达完整HBV病毒颗粒的质粒pSM2转染HepG2细胞,再将0～1 000 IU/ml浓度IFN-α处理细胞6 h,运用ELISA和Southern blot技术分析转染细胞上清...     

人hepcidin真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的 构建人hepcidin全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达hepcidin的HepG2细胞系,以应用于拮抗hepcidin从而增强铁吸收的活性药物筛选.方法 化学合成结合PCR拼接hepcidin 全长结构基因,插入原核表达载体pMD18-T中,测序正确后再经HindⅢ与EcoRⅠ双酶切,定向插入真核表达载体pcDNA3.0内,酶切鉴定后,采用脂质体转染法将重组质粒转染人HepG2细胞,G418选择抗性细胞克隆,ELISA检测转染细胞hepcidin的蛋白表达.结果 经酶切鉴定,成功构建hepcidin真核表达载体pcDNA3-hepcidin;重组质粒转染HepG2,经G418筛选3周获得抗性细胞克隆,其hepcidin蛋白表达量为普通HepG2细胞表达量的3倍.结论 成功构建了稳定高表达hepcidin的HepG2细胞,该稳定转染细胞系的建立为进一步研究hepcidin降低肠道铁吸收的分子机制以及筛选拮抗hepcidin作用的活性药物奠定了实验基础.