结直肠癌相关抗原的纯化及分析

<正>肿瘤细胞相关抗原对肿瘤临床诊断及预后监测具有重要意义.近年来应用单克隆抗体技术,鉴定出许多肿瘤相关抗原.目前在临床上应用的结直肠癌标志物除CEA外,还有CA19-9、结直肠癌相关抗原(CCA)等.本文采用鼠抗人结直肠癌单克隆抗体纯化结肠癌组织中的CCA,并对此抗原作初步分析.1 材料与方法1.1 可溶性抗原的制备 人结肠癌组织用生理盐水洗净.将肿瘤组织剪成小块,加入0.01mol/LpH7.2(含3mol/L氯化钾)磷酸缓冲液,制成匀浆.4℃搅拌14h.10000r/min离心30min,上清液用上述缓冲液透析48h.将此提取液边搅拌边滴加3mol/L 高氯酸,至其最终浓度成0.6mol/L,4℃搅拌30min,10000r/min离心30min,上清液透析,稍作浓缩.测定蛋白浓度为2.5×10~2mg/ml.1.2 单抗亲和层析柱的制备和亲和纯化CCA将抗CCA单克隆抗体腹水(IgGl,中国科学院细胞生物研究所提供)经二次盐析后,用pH8.3 0.1mol/L 碳酸缓冲液透析平衡.每毫升 CNBr活化Sepharose 4B凝胶加20mg抗体蛋白混合.室温倒转反应2h,继用1mol/L.pH7乙醇胺封闭2h,制成单抗亲和层析柱.最后用0.15mol/L pH7.2磷酸缓冲液平衡,装柱.将上述高氨酸提取液上亲和层析柱.解高用0.2mol/L pH2.5甘氨酸-HCI缓冲液,收集并及时中和所得抗原蛋白液.1.3 免疫酶法测定 取市售的CCA试剂盒(中科院及本     

青蒿琥酯对人骨髓瘤细胞抗血管生成的作用

目的:研究青蒿琥酯对人RPMI-8226细胞诱导血管新生的抑制作用。方法:采用MTT法检测青蒿琥酯对RPMI-8226细胞增殖抑制作用;通过鸡胚绒毛尿囊膜体内血管生长实验,观察青蒿琥酯对RPMI-8226细胞诱导体内血管生成的影响;免疫蛋白印迹检测鸡胚绒毛尿囊膜内血管内皮生长因子(VEGF)和血管紧张素1(Ang-1)含量的表达变化。结果:青蒿琥酯以时间、剂量依赖方式抑制RPMI-8226细胞增殖;24h和48h后,其IC50值分别为(36.33±2.65)μmol/L和(14.31±3.28)μmol/L。在鸡胚绒毛尿囊膜体内血管生长实验中,经3、6、12μmol/L青蒿琥酯处理后,与单纯RPMI-8226细胞组比较,新生血管数目分别减少21.9%、38.2%和76.9%,差异有统计学意义;同时鸡胚绒毛尿囊膜内VEGF含量分别显著下降22.2%、34.2%和52.6%;Ang-1蛋白表达量分别显著下降15.6%、24.2%和39.6%。结论:青蒿琥酯具有抑制RPMI-8226细胞诱导血管新生的作用,其作用机制与下调RPMI-8226细胞的VEGF和Ang-1表达有关。     

新城疫病毒体外感染胃癌细胞诱导HSP70的表达及意义

我们通过新城疫病毒 (NDV)感染诱导胃癌细胞HSP70 (热休克蛋白 )蛋白的表达 ,观察其在体外抗瘤活性 ,进一步探讨NDV的抗瘤机制 ,为未来肿瘤的生物治疗提供试验资料。“选用NDV F株 Ⅲ系 ,接种于SPF鸡胚尿囊腔复制增殖后 ,测其血凝效价为 1∶12 80 ,将NDV接种于铺成单层的人胃癌BGC 82 3细胞 (2× 10 6 ) ,试验组加入 1× 10 - 6 ml的NDV尿囊液 ,对照组加入等量正常尿囊液。分别于培养 8h、12h、18h、2 4h、30h、36h、4 2h、4 8h细胞用PBS轻轻洗去非贴壁细胞和细胞残渣 ,加 1%戊二醛固定 10min ,用结晶紫染色观察细胞病变 (CPE…     

HBV颗粒的纯化及生物学活性鉴定

目的优化纯化HBV患者血清中HBV颗粒的技术方法。方法在蔗糖介质中,分别以100 000 g和70 000 g进行不连续蔗糖梯度(60%,45%,35%,25%,15%)离心5 h,离心后,分段吸取6份收集液,PCR荧光定量检测各组分HBV滴度;收集前5份收集液进行超滤,去蔗糖,PCR荧光定量检测HBV超滤液;电镜观察70 000g纯化后的HBV超微形态;70000 g纯化后的HBV颗粒感染树鼩肝细胞,检验70 000 g纯化后的HBV感染活性。结果100 000 g离心造成大量HBV在离心过程中损失,收获率只有21%,70 000g离心不仅降低了离心中的病毒损失,而且可有效对HBV和血清进行分离,收获率达到78%以上,较100 000g还提高3.7倍多。电镜可观察到纯化后病毒液中有大量的病毒颗粒;纯化后的HBV颗粒感染活性良好,可有效感染原代树鼩肝细胞。结论70 000 g不连续蔗糖梯度离心可有效分离纯化HBV病毒,较100 000 g收获率明显提高,纯化后的HBV不但具有典型的HBV特征,还具有良好的生物学感染活性。     

人肺腺癌GLC-82细胞提取热休克蛋白70抗瘤效应的研究

为了寻找一种肺腺癌有效的治疗方法，我们探索肺癌GLC-82细胞产生的热休克蛋白70(HSP-70)的杀瘤作用。HSP-70的制备如下：常规培养的人肺腺癌GLC-82细胞经43℃30min处理后，置常规培养条件下培育12h，以EDTA．胰蛋白酶复合消化液分散细胞，调整细胞浓度为106／ml，加入10倍体积的细胞裂解液混匀，置4℃ 12～20h，细胞裂解成絮状．经透析浓缩后以低温高速离心，     

分泌抗日本血吸虫排泄分泌抗原McAb杂交瘤细胞株的建立

<正> 本文报道用日本血吸虫尾蚴感染家兔,45天后用灌注法收集成虫,置台氏液中于25℃培育24小时,收集培养液,离心后取上清,蒸馏水透析、冻干,以此排泄分泌抗原(ESA)免疫BALB/c小鼠,于加     

Anti-Gr-1去除新生小鼠髓源性抑制细胞的动态变化

目的 分析anti-Gr-1去除新生小鼠髓源性抑制细胞(MDSCs)的动态变化,探讨其去除MDSCs的效率和反应时间.方法 将50只BALB/c新生小鼠随机分成5组,每组10只,根据不同时间点腹腔注射anti-Gr-1(15 μg);于出生后第9天收取肝脏、脾脏标本,并将各自充分研磨后的组织悬液通过Percoll液进行梯度离心,分离出其中的单个核细胞;利用流式细胞仪分别检测肝、脾组织的髓源性抑制细胞(CD11b+Gr-1+)数量.结果 ①经anti-Gr-1注射4h后,实验组脾脏中的MDSCs百分比明显低于正常对照组[(9.19±1.40)％比(26.01±2.26)％,t=20.266,P＜0.05],并能有效维持24～48 h,去除率达到64.6％,当48 h后MDSCs百分比(16.87±3.49)％,去除率下降至35.1％;②经anti-Gr-1注射24h后,实验组肝脏中的MDSCs百分比与正常对照组比较[(8.98±1.03)％比(15.75±1.10)％,t=11.12,P＜0.05],具有统计学意义,去除率为42.9％,至48 h后MDSCs百分比(4.57±0.95)％,去除率达到70.9％;③同一实验组,脾脏和肝脏各自的M-MDSCs/G-MDSCs比值区别较大.结论 Anti-Gr-1对肝脏、脾脏的MDSCs去除效率和反应时间不同:经anti-Gr-1注射后4～48 h,脾脏的MDSCs去除率为35.1％ ～64.6％,而24 ～48 h后肝脏的MDSCs去除率为42.9％～70.9％.     

流感病毒A／Guangdong／28／94HA1基因序列分析

自１９６８年流感病毒ＨａＮ２亚型首次引起人类暴发流行以来，该亚型病毒在人群中一直传播。我们在血清学抗原分析的基础上，采用ＲＴ－ＰＣＲ测序方法，对１９９４年广东地区的流行毒株Ａ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／２８／９４ＨＡ１基因序列进行分析，了解其核苷酸的变异程度。材料与方法１．流感毒株：Ａ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／２８／９４，由广东省卫生防疫站分离，并鉴定为甲型流感病毒Ｈ３Ｎ２亚型。毒株接种于鸡胚尿囊腔增殖，收获鸡胚尿囊液后，超速离心，并用３０％～６０％的蔗糖梯度离心纯化。２．提取病毒ＲＮＡ：ＲＮＡｚｏｌＴＭ…     

培养细胞的免疫细胞化学操作体会

对培养的细胞进行免疫细胞化学反应 ,可以在培养皿内直接进行 ,亦可经树脂包埋后 ,在半薄切片上进行。本实验应用上述二种方法 ,对培养的大鼠内耳血管纹的组织细胞进行了免疫细胞化学显示。组织细胞处理 :1 )平皿培养和盖玻片上培养的大鼠内耳血管纹处组织细胞 ,经Bouin固定液固定 4h,0 .0 1 Mol/L PBS浸洗 ,0 .1 %的 Triton x- 1 0 0处理 2 0 min;2 )平皿培养的细胞经酶处理 ,离心收集 ,2 %戊二醛固定液固定 4h,经丙酮脱水与锇酸固定( - 2 0℃ )、树脂包埋、半薄切片。免疫细胞化学反应 :上述处理的细胞或切片进行免疫细胞化学反应 ,其…     

嵌合有HCV多中和抗原表位的乙肝S抗原病毒样颗粒的制备与鉴定

制备嵌合HCV多中和表位及HCV包膜蛋白E2的HBV S抗原病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),并进行鉴定、纯化和浓缩。HEK293T细胞用DMEM培养至90%密度时,将构建的重组真核表达载体pCI-MEpS、pCI-E2S用脂质体法转染HEK293T细胞,48h后在培养上清中得到自我装配的嵌合HCV多中和表位及包膜蛋白E2的HBV病毒样颗粒(VLP-MEpS,VLP-M2S)。蔗糖密度梯度离心,透析浓缩后,电化学发光法进行HBsAg定量测定、电镜分析和Western blotting鉴定。制备出的嵌合病毒样颗粒VLP-MEpS和VLP-E2S经浓缩后其HBsAg定量最高达到3×10~4 ng/mL。实验表明我们成功制备出嵌合有HCV多中和抗原表位的HBV VLP,为进一步分析诱导的中和抗体研究奠定基础。     

粉尘螨变应原部分纯化及特征鉴定

螨是引起速发型变态反应疾病的主要变应原,本文通过生化及免疫化学方法对粉尘螨变应原进行部分纯化及特征鉴定。一、纯化方法: 1.将粉尘螨粗制液经60%及90%饱和硫酸铵分级盐析,离心沉淀后,用PBS溶解,透析除盐。     

尿CEA-RIA的临床应用评价

血清与胸腹水中癌胚抗原(CEA)的检测已广泛用于临床。但尿CEA(U-CEA)的检测与实际应用尚未见报告,我们利用放射免疫分析(RIA)直接测定正常人与癌肿患者的U-CEA,并对试验影响因素及其应用价值进行了初探。材料和方法一、试剂:(一)去离子蒸馏水或经过滤的蒸馏水;(二)游离CEA血浆(NHP)、收集健康人血浆样品;测定后将低于2ng/L的CEA样品集中;也可选择使用柠檬酸盐抗凝的A型血浆,应在24h内,0～4℃温度下多次更换0.05mol/L的NaCl进行彻底透析,以3000g离心/30min除去凝集的蛋白,再检测CEA含量。只有CEA<2ng/L的血浆可用。(三)中国潍坊3V试剂盒。     

视网膜色素上皮细胞脱离体外培养条件后细胞保存液的研究

目的 研究人视网膜色素上皮细胞(hRPE细胞)离体或脱离体外培养条件后,维持细胞活性、且延长细胞存活时间最适宜的液体.方法 将5代以上hRPE细胞(本实验室保存)按常规冷冻、复苏培养于DMEM/F12培养基添加10%胎牛血清, EGF 20μg/L 和 bFGF 20μg/L条件下,至80%以上汇合,经胰蛋白酶消化,收集细胞、计数,置于6种不同保存液中(平衡盐液、Quinn's advantage medium、生理盐水、18氨基酸液、5%葡萄糖液和人工脑脊液),用Annexin V/FITC Kit染色,利用流式细胞术(FACS)检测细胞死亡或凋亡.采用2h至8h之间3个时间点,检测hRPE细胞在6种不同细胞保存液中的细胞状态.结果 室温状态下,hRPE细胞30min内均发生坏死.4℃状态下,2h平衡盐液组凋亡率最低(0.9%);各组分别与平衡盐液组相比,显示人工脑脊液组与平衡盐液组之间存在显著差异;4h至8h,hRPE细胞凋亡率从26.74%上升至41.36%.各组总死亡率与凋亡率基本一致.结论 4℃状态下,6种溶液中,平衡盐液是维持hRPE细胞脱离培养条件后保持细胞活性,且延长细胞存活时间最适宜的溶液.     

蛇毒致急性肾功能衰竭透析前后EPO水平的改变

本文探讨蛇毒所致的急性肾功能衰竭患者产生促红细胞生成素的能力,并探讨透析对产生EPO能力的改变。 对象和方法 一、对象:蛇咬伤所致的急性肾功能衰竭31例,按其转归分为两组:Ⅰ组:经治疗后恢复病人,24例,分别于发生肾衰后不同时间内取透析(透析器为面积1.2M~2的GambroGFE12h型,用含钙1.75mmol/L的醋酸盐透析液,每次透析4小时)前后动脉血,离心取血清待测;Ⅱ组:经     

不同密度梯度离心处理后精子形态的变化

目的研究不同密度梯度法处理后精子形态的变化。方法收集55份男性精液标本,每份精液按不同处理方法分4组,A组为对照直接加生理盐水洗涤离心,B组由40%、80%两层梯度液处理精液,C组由40%、60%、80%三层梯度液处理精液,D组由40%、55%、70%、80%四层梯度液处理精液,处理后均行精子形态改良巴氏染色分析。结果 C组与D组可以显著降低精子的畸形率,差异有统计学意义（P〈0.0125）,其中D组最为显著。结论梯度液层次多对畸形精子的分离效果较好。     

抗结肠—卵巢肿瘤抗原(COTA)单克隆抗体SP-21的制备

Colon-Ovarian Tumor Antigen (COTA)最早发现于结肠和粘液性卵巢癌组织及粘液性囊肿液中。最初用于鉴定COTA的多克隆抗体是山羊抗血清。本研究建立了抗COTA鼠单克隆抗体(MAb)并与多克隆抗体进行了比较。 取裸鼠体内LS-174T肿瘤粘液,经高速离心上清液通过葡聚糖4B层析柱,收集分子量大于10,000道尔顿的组分经过滤浓缩得到纯化的COTA。用COTA免疫Balb/cj小鼠,采用     

改良白膜法制备浓缩血小板及回收率的影响因素

背景:白膜法和富含血浆法制备的浓缩血小板有无效输注发生率高和不良反应发生率高的缺点。目的:观察改良白膜法制备浓缩血小板的实验研究,分析制备浓缩血小板回收率的影响因素。方法:随机抽取126例站内采集后4-6 h的400 mL血液,随机分成改良白膜法组、白膜法组和富含血浆法组。改良白膜法采用3步离心,第1次采用次重离心,离心转速2 300 r/min,离心时间12 min,降速5,离心温度(22±2)℃;第2次采用轻离心,离心转速910 r/min,离心时间10 min,离心温度(22±2)℃;第3次离心转速2 800 r/min,离心时间12 min,离心温度(22±2)℃,离心后,挤去上层含血小板较少的血浆,袋中留30 mL血浆悬浮血小板,即为浓缩血小板。通过数据库文献检索的方法分析制备浓缩血小板回收率的影响因素。结果与结论:改良白膜法、白膜法以及富含血浆法制备的手工浓缩血小板中,制备前各组血小板总数差别无统计学意义(P0.05);富含血浆法组和改良白膜法组较白膜法组血小板回收率高,差异有显著性意义(P0.05),但富含血浆法组和改良白膜法组比较,差异无显著性意义(P0.05);白膜法组和改良白膜法组较富含血浆法组残留红细胞和残留白细胞的量少,差异有显著性意义(P0.05),白膜法组与改良白膜法组比较,差异无显著性意义(P0.05)。制备浓缩血小板的回收率受到全血量、离心转速、离心时间、离心方法等因素的影响。改良白膜法制备浓缩血小板减少红细胞和白细胞的残留量,提高了血小板的回收率,可在血液中心或中心血站推广应用。     

不同性状胸腹水放置时间和取样部位对细胞学检查结果的影响

目的:观察不同性状(血性及淡黄色)胸腹水放置不同时间及不同取样部位对细胞学检查的影响。方法:收集2010年3月～7月住院病人的胸腹水356例(血性胸腹水144例、淡黄色胸腹水212例),对每份标本在细胞学检查前分别于室温下放置1h、2h、3h后离心,血性胸腹水取红细胞上层灰白色部分及管底层物分别制片,淡黄色胸腹水取管底沉淀物制片,干燥、固定后瑞-姬染色,测定细胞变异率、有核细胞数和肿瘤细胞检出率。结果:血性胸腹水1h、2h、3h的细胞变异率分别为6.31%、17.44%、28.58%,前者明显低于后二者(P<0.01);红细胞底层的有核细胞数(14.00±5.00)明显低于红细胞上层(57.00±6.00)(P<0.01);红细胞底层肿瘤细胞检出率(9.03%)明显低于红细胞上层(19.44%)(P<0.05)。淡黄色胸腹水1h、2h、3h的细胞变异率分别为5.19%、16.12%、28.43%,三者有统计学差异(P<0.01),肿瘤细胞检出率(11.32%、14.15%、18.87%),1h与2h比较无统计学差异(P>0.05),但1h与3h比较有统计学意义(P<0.05)。结论:胸腹水细胞学检查应及时送检、离心、制片,血性胸腹水离心后选择红细胞上层、淡黄色胸腹水离心后取管底沉淀物制片,可提高肿瘤细胞检出率及诊断准确性。     

骨髓间充质干细胞经大鼠冠状动脉内移植的可行性

目的 研究骨髓间充质干细胞经冠状动脉内移植的安全性及可行性.方法 左侧开胸结扎SD大鼠左冠状动脉,2周后取心脏建立Langerndorff模型.将CM-DiI标记的骨髓间充质干细胞悬液注入主动脉根部,同时收集右心房回流的液体,离心后通过流式细胞仪计数细胞数量.观察是否有细胞经冠状静脉回流及数量比例.并在不同时间测LVSP、LVDP、±dp/dt、心率,评价其安全性.在体实验中取心梗后2周的大鼠,经左心室-主动脉途径将细胞悬液注射到临时阻断的主动脉根部,分别在移植后1及24 h和1及4周取材观察细胞在心脏内的位置及细胞的迁移情况.结果 离体实验发现经冠状动脉内注射骨髓间充质干细胞90%以上的细胞在心肌组织内存留,移植后LVSP、LVDP、±dp/dt、心率没有明显变化.在体内实验中发现细胞移植后早期大部分细胞分布在心外膜下心肌组织内,在心内膜下组织内较少细胞分布,而且大部分细胞在正常心肌组织内,只有少量在心梗区域.而在细胞移植后1～4周存活的细胞多在心肌梗死及交界区组织内,在正常组织内很少有移植细胞存在.结论 经冠状动脉途径进行细胞移植是安全可行的.     

鼠IgM类单克隆抗体的纯化

本文介绍一种采用常规蛋白质分离提取技术,来纯化IgM类单克隆抗体的方法。将腹水经10000g离心5min,弃沉淀。用pH8.0、20mmol Tris溶液调蛋白浓度至10～12mg/ml。在4℃搅拌中加入45％饱和度硫酸铰,4℃放置1h,10000g离心15min,沉淀重悬于pH8.0 100mmol Tris-150mmolNaCl中,并对该溶液透析。将样品通过Ul-