人KIM-1基因实时荧光定量PCR标准质粒的构建

目的制备用于人KIM-1基因mRNA实时荧光定量PCR检测的标准品质粒。方法通过PCR扩增出目的片断,纯化PCR产物与p MD18-T载体连接,转化宿主菌E.coli DH5α,获得阳性克隆;通过PCR扩增鉴定和测序分析,确认重组质粒完整正确。提取重组质粒测定DNA浓度后,10倍倍比稀释,建立KIM-1质粒标准品。结果 KIM-1基因目的片段成功重组至p MD18-T载体上,扩增目的片段长度为131 bp,测序结果证实所构建的质粒序列与NCBI基因库KIM-1序列性一致。结论成功构建KIM-1基因实时荧光定量PCR标准品质粒。     

分子信标探针技术用于PCR检测诺卡氏菌SecA1基因

目的将诺卡氏菌属细菌的一段特异性DNA设计成分子信标探针,用于该细菌的PCR检测。方法将诺卡氏菌属细菌、戈登氏菌属细菌及红球菌属细菌菌株分别接种于脑心浸液琼脂培养基分离培养,观察其生长情况,提取菌株DNA作为扩增模板;设计诺卡氏菌属细菌基于secA1基因的特异性分子信标探针,在实时荧光定量PCR反应译体系中加入分子信标探针,PCR产物进行荧光信号检测。结果诺卡氏菌secA1基因经实时荧光定量PCR扩增后可产生阳性荧光信号,红球菌属细菌及戈登氏菌属细菌的secA1基因、阴性对照实验组及空白对照组经实时荧光定量PCR扩增后不产生荧光信号,为阴性。结论 secA1作为看家基因,是用来进行种水平的鉴定及系统进化研究非常理想的靶分子,而分子信标探针技术可以准确、快速、灵敏的进行诺卡氏菌secA1基因检测。     

人类疱疹病毒8型实时荧光定量PCR外标准品的构建

目的构建人类疱疹病毒8型(HHV-8)基因质粒标准品,以便快速、灵敏、可靠地检测与HHV-8相关疾病患者的病毒载量。方法提取HHV-8基因组DNA,以HHV-8 ORF26为目的基因设计引物,进行PCR扩增;纯化目的片段与pMD19-T Vector连接并转化到大肠杆菌中;提取重组质粒DNA,并行PCR、测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,实时荧光定量PCR(Real-time FQ-PCR)构建标准曲线。结果 HHV-8ORF26目的片段制备成功,获得稳定的重组质粒,保证了目的片段的特异性和序列完整性,标准曲线参数良好,外标准品阈值循环数(Ct)与其相应梯度稀释浓度呈良好的线性关系,扩增效率高。结论成功构建了HHV-8的Real-time FQ-PCR外标准品,可以快速检测样品中的HHV-8载量。     

肝组织中β-actin定量检测方法的建立

目的构建检测肝组织中内参基因β-actin的标准品。方法以成人外周血细胞的总RNA为模板、反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人β-actin基因相应的cDNA目的片段,以pMD18-T为载体,构建形成重组质粒,电泳、鉴定测序后,用荧光定量PCR制作标准曲线。结果外周血提取的总RNA完整性良好,构建的β-actin质粒经PCR扩增后得到1条285 bp的清晰条带,测序结果与目的片段完全一致,且质粒的原始浓度为5.0×10~(13)拷贝数/mL,倍比稀释至1.0×10~2拷贝数/mL均能得到良好的标准曲线(R~2=0.999)。结论构建β-actin基因荧光定量PCR标准质粒成功。     

SYBR Green荧光PCR检测美洲钩虫方法的建立

目的建立荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法。方法提取虫体基因组DNA、根据GenBank中美洲钩虫ITS 2序列设计特异引物,PCR扩增ITS 2序列、克隆、测序和比对。常规PCR检验引物特异性。将ITS 2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做灵敏性和重复性试验。结果构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线的吸收峰单一,实验重复性良好。结论成功构建了SYBR Green I荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法,可用于快速、准确、定量检测美洲钩虫。     

铜绿假单胞菌quiP基因实时荧光定量PCR标准质粒的构建

目的：制备用于铜绿假单胞菌PAO1 quiP基因（PA1032）实时荧光定量PCR检测的质粒标准品pMD18-quiP。方法：通过PCR扩增出目的片断,纯化后连接至pMD18-T载体,转化宿主菌E.coli DH5α,获得阳性克隆,通过PCR扩增、双酶切鉴定和测序分析,确认重组质粒完整正确,大量抽提重组质粒,测定其拷贝浓度,10倍稀释成梯度标准品,并进行荧光定量PCR检测分析。结果：quiP基因目的片段成功重组至pMD18-T载体上,获得的重组质粒保持了目的片段的特异性和序列完整性。梯度浓度标准质粒的荧光定量PCR结果显示,循环阈值（Ct）与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系。结论：成功构建了quiP基因实时荧光定量PCR质粒标准品。     

TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测土拉弗朗西斯菌

目的 建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(FQ-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法 针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制作定量标准曲线,并以合成fopA基因为模板,PF、PR 为引物,研究其灵敏度、特异性和准确性。结果 构建了含fopA基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在103~107拷贝数之间有较好的线性关系。灵敏度试验表明,该方法可检测到30.6个拷贝数的重组质粒,比普通PCR灵敏度高;特异性试验表明,能选择性检测土拉弗朗西斯菌,而与其他病原菌无交叉反应,与普通菌落PCR结果一致;重复性试验表明,拷贝数为3.06×106样品5次平行试验,标准差为0.201,变异系数为0.88%。结论 本研究建立了TaqMan探针FQ-PCR快速检测技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于快速、实时、定量检测土拉弗朗西斯菌,为快速检测生物战剂级微生物建立了一种人工合成特异基因TaqMan探针实时荧光定量PCR新方法。     

内参照基因在实时荧光定量RT-PCR检测中的应用

目的 建立测定内参照β-actin表达量的实时荧光定量RT-PCR两步法检测方法.方法 根据Genbank 中人β-actin保守区域序列设计荧光PCR适用的引物和探针,构建质粒标准品建立标准曲线用于荧光PCR相对定量,检测荧光PCR方法的特异性和重复性.结果 建立了人β-actin实时荧光RT-PCR检测方法.结论 本实验建立的人β-actin表达实时荧光RT-PCR两步法检测方法特异性和重复性较好,为β-actin作为定量RT-PCR中内参照基因进行人其他功能基因和病原基因表达的定量分析奠定了基础.     

基于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法的建立

目的 本文建立一种基于样品检测的特异性好、灵敏性高的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法。方法 以哺乳动物beta-actin基因和外源重组质粒为内参,针对布鲁氏菌属特异性基因IS711,建立用于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法,并验证其敏感性、特异性及稳定性,绘制标准曲线。将该方法用于哺乳动物样品检测,并与细菌分离培养检测结果比较。结果 荧光定量PCR方法对布鲁氏菌检测有良好的特异性,3对引物对阴性对照菌均无非特异性扩增;该方法用于样品检测的最低检测限为17拷贝;内外源内参同时存在条件下,布鲁氏菌荧光定量PCR的标准曲线相关系数为R²=0.997(Y=-3.12X+40.9)。将该方法直接用于181份动物样本的检测,并与分离培养结果相比,荧光定量PCR检测阳性率为11.4%,细菌分离培养检测阳性率为9.9%,且细菌分离培养阳性样品与荧光定量PCR阳性样品中编号基本一致。结论 本文建立的荧光定量PCR检测方法灵敏性高、特异性及稳定性好,可直接应用于样品的检测,检测结果受内参基因质控。     

狂犬病病毒荧光定量RT—PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立狂犬病病毒快速检测法。方法根据狂犬病病毒核蛋白基因的保守序列分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针。构建pMD-N重组质粒,建立荧光定量RT-PCR绝对定量标准品,并对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;作重复性和特异性检验后进行临床标本的检测。结果构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.998。狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测反应的灵敏度为10个TCID_(50);5种非狂犬病病原体检测均为阴性。结论建立的狂犬病病毒的荧光定量RT- PCR检测方法快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好,可以应用于临床样品的检测。     

采用荧光定量RT-PCR法检测超极化激活环核苷酸门控阳离子通道

目的 建立用SYBR Green荧光染料检测超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（HCN4）的实时定量RT-PCR方法。方法 提取窦房结细胞的总RNA,反转录成cDNA后,应用RT-PCR法检测HCN4的表达,通过琼脂糖凝胶回收PCR产物并构建重组质粒,用梯度稀释的质粒模板建立荧光定量RT-PCR法检测HCN4的标准曲线,并检测心脏组织中HCN4的表达水平。结果 成功构建了质粒重组子,并建立用SYBR Green荧光染料在RNA水平检测HCN4通道的标准曲线,相关系数为0.997重复6次实验组内和组间变异系数均<1.0％。心脏组织中窦房结HCN4表达量最高,心室表达量最低。结论 基于SYBR Green荧光染料建立的定量RT-PCR体系敏感性高,线性范围广,重复性好,可快速准确地检测HCN4的表达。     

白念珠菌mp65基因真核质粒的构建及免疫原性研究

目的构建以白念珠菌甘露糖蛋白65(MP65)编码基因mp65为目的基因真核重组表达质粒,并对其免疫原性进行分析。方法PCR法自白念珠菌标准菌株ATCC64550中获取mp65基因,分别插入真核表达载体pcDNA3.1中,将真核表达经质粒大抽提并定量后免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗体产生水平,流式检测细胞免疫。结果PCR法克隆出全长为1140bp的mp65基因,构建出pcDNA3.1-mp65真核表达质粒,pcDNA3.1-mp65免疫小鼠能诱导产生效价为1∶800的IgG抗体,同时诱导CD4+T和CD8+T细胞百分含量增高。结论白念珠菌真核表达质粒pcDNA3.1-mp65成功构建并能诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫。     

纳米磁分离法结合实时荧光定量PCR检测恶性疟原虫的研究

目的 目的 建立恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测方法, 快速准确地检测恶性疟原虫, 为输入性恶性疟 防控提供技术支持。方法 方法 根据恶性疟原虫基因组18S rRNA保守区序列, 设计并合成引物和探针; 构建质粒标准品, 拟 合标准曲线, 采用纳米磁分离法提取核酸, 建立恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测法, 并进行该方法的灵敏 度和特异性评价。结果 结果 与常规法 （镜检法和快检法） 相比, 该方法检测恶性疟原虫更加灵敏, 并具有良好的特异性, 在 （2.5×101 ~ 2.9×108 ）copies/ml拷贝数范围内循环阈值 （Ct值） 与质粒标准品拷贝数的对数值之间存在良好的线性关系 （R2 = 0.999）; 应用该方法从非洲维和部队13名归国人员中检出1例低水平恶性疟原虫感染者, 而常规法 （镜检法和快检 法） 未检出。结论 结论 该方法能够快速准确地检测恶性疟原虫, 在口岸低密度恶性疟原虫感染者的检测中具有很大的应用 价值。     

间日疟原虫荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

目的　建立间日疟原虫荧光定量聚合酶链式反应 (FQ -PCR)检测方法 ,为快速、准确定量检测间日疟原虫奠定基础。方法　根据间日疟原虫SSURNA基因序列 ,设计并合成引物和荧光标记探针 ,将PCR扩增的间日疟原虫SSURNA基因片段克隆入载体 ,对重组质粒进行筛选、鉴定后 ,作为阳性模板 ,用于标准曲线的判定和样品检测。结果　应用重组质粒制作的定量曲线 ,循环阈值与模板浓度具有良好的线形关系 ,12 7份疟区血样和 30份正常血样的检测 ,显示此法有较高的灵敏度和特异度 ,定量检测结果与镜检感染率呈直线相关 ,相关系数为 0 95 9。结论　建立了间日疟原虫的荧光定量PCR检测方法     

牛分枝杆菌Mb2277蛋白的表达及其反应原性初步研究

目的构建牛分枝杆菌Mb2277基因的原核表达载体,获得高纯度的融合表达蛋白,并对其表达产物的免疫原性进行初步研究。方法根据GenBank提供的M.bovisMb2277基因序列设计引物。以牛分枝杆菌(93006)DNA为模板,通过PCR方法扩增出Mb2277基因片段,以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切PCR产物和pET28a(+),后将纯化的Mb2277基因克隆至pET28a(+)中,构建出原核表达质粒,再转化到E.coliBL21(DE3)表达菌株中,IPTG诱导后,收集菌体进行SDS-PAGE,进一步利用Western Blot对表达产物的反应原性进行研究。结果获得了牛结核分枝杆菌Mb2277原核表达质粒,IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见约25ku蛋白表达条带,Western Blot结果显示,表达产物与兔抗分枝杆菌抗体具有反应性。结论该蛋白具有较强的反应原性。     

Investigation of varicella-zoster virus infection by polymerase chain reaction in the immunocompetent host with acute varicella.

A polymerase chain reaction (PCR) method developed to detect varicella zoster virus (VZV) in clinical samples is based on amplifying sequences of viral gene 31, the coding region for glycoprotein II. Its sensitivity was evaluated by amplification from plasmid VZV DNA containing VZV gene 31; 45 copies were detected in 1 microgram of human DNA. In testing within 24 h after the onset of varicella exanthem, 21 (75%) of 28 lesion samples were positive by VZV PCR, whereas VZV was isolated from only 21% by a standard tissue culture method. Only 1 (3.3%) of 30 samples of oropharyngeal secretions but peripheral blood mononuclear cells from 8 (67%) of 12 patients were positive. The sensitivity and specificity of the VZV PCR method indicates its usefulness for investigating the pathogenesis of VZV infection. Direct contact with cutaneous lesions rather than respiratory secretions may be the most important route of VZV transmission from healthy individuals with acute varicella.     

尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH和fimC基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建以尿路致病性大肠杆菌(UPEC)Ⅰ型菌毛编码基因fimH和fimC为目的基因的原核重组表达质粒,诱导其在E.coliBL-21中表达,并对其免疫原性进行分析。方法PCR法自UPEC标准菌株J96获取fimH和fimC基因,分别插入原核表达载体pGEX-4T-2;将重组表达质粒转染感受态E.coliBL-21,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE和Westernblot鉴定并纯化目的蛋白fimH和fimC蛋白,定量后免疫BALB/c小鼠,动态检测抗体产生水平。结果PCR法克隆出全长为903bp的fimH和720bp的fimC基因,构建的原核表达质粒pGEX-4T-2-fimH及pGEX-4T-2-fimC经诱导可分别表达出60KD和48KD左右的GST融合蛋白;蛋白经纯化后免疫动物能诱导产生高效价的IgG抗体。结论成功获取了UP-ECⅠ型菌毛基因fimH和fimC,所构建的原核表达质粒在BL-21中成功表达;fimH有免疫原性。     

以HBc颗粒为呈现载体的猪囊虫疫苗的构建及其免疫学研究

目的构建以HBc为载体的带有三个猪囊虫抗原表位(n1,n2,n3)的重组融合表达质粒pET-Δc-3n,表达出融合蛋白并纯化,通过免疫小鼠研究其体液免疫效果。方法用PCR法将三个猪囊虫表位分别插入HBc序列的第78-79位之间以及149位之后,再将该序列克隆入pET28a载体中,构建重组表达质粒,用大肠杆菌BL21作宿主菌表达出融合蛋白,并命名为PCCE,纯化后免疫小鼠,检测小鼠的体液免疫应答。用绦虫卵攻击免疫小鼠,并观察疫苗的保护作用。结果测序结果表明重组质粒构建成功,SDSPAGE显示融合蛋白表达正确,并有多聚体形成现象,ELISA检测到高滴度抗体。小鼠体内绦虫卵攻击试验表明疫苗PCCE的相对保护率为89%。结论以HBc为呈现载体的猪囊虫疫苗被成功表达和纯化,该疫苗能诱导较强的体液免疫反应,免疫小鼠对绦虫卵攻击具有较好的免疫保护作用。提示该疫苗PCCE可能具有预防囊虫病的潜在价值。