球形芽孢杆菌两毒蛋白基因的分别克隆及杀蚊幼活性的协同作用

将球形芽孢杆菌两毒蛋白基因分别克隆并分别在大肠杆菌及鱼腥藻中表达，经对淡色库蚊幼虫毒性测试结果表明：只表达一种毒蛋白基因的大肠杆菌或鱼腥藻对蚊幼虫无毒效，而将分别表达这两种基因的大肠杆菌或鱼腥藻等浓度混合使用时则表现出高的杀蚊活性，从而证明球形芽孢杆菌两毒蛋白基因具有明显的协同作用，其杀蚊活性与同细胞表达两种毒蛋白基因的大肠杆菌或鱼腥藻相比，结果相似，无明显差异。     

建立三种基因工程杀蚊幼蓝藻

基因工程杀蚊幼蓝藻的应用，为持续控制蚊幼虫的研究提供了新的途径。本文将携有球形芽孢杆菌晶体蛋白基因的ｐＤＣ２６穿梭质粒，通过接合转移导入多种鱼腥藻中进行表达。结果表明，所得到的基因工程藻Ａｎａｂａｅｎａｓｐ．７１２０Ａｎａｂａｅｎａｃｙｌｉｄｒｉｃａ和Ａｎａｂａｅｎａｓｕｂｔｒｏｐｉｃ对淡色库蚊幼虫具有较高的毒效，２４ｈ半数致死浓度（ＬＣ５０）分别为：３．５１×１０４细胞／ｍｌ、３．３２×１０４细胞／ｍｌ和４．３４×１０４细胞／ｍｌ，其杂合质粒在蓝藻中有很高的稳定性，具备现场应用的要求。     

生物杀虫剂球形赖氨酸芽孢杆菌的研究进展

自从20世纪60年代分离得到第1株具有杀灭蚊幼虫的细菌后,陆续出现了很多具有作为生物杀虫潜力的菌株.球形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sphaericus（又称球型芽孢杆菌Bacillus sphaericus）和苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis是目前研究最为深入,在我国应用最广泛的生物杀虫剂.本文旨在通过对以往有关L.sphaericus的研究进行总结综述,包括其关键特性、灭蚊毒素及作用机制等,为进一步研究新型无污染的生物杀虫剂产品提供研究的视角.     

苏芸金芽孢杆菌的肠毒素及其编码基因的研究

目的对苏芸金芽孢杆菌（简称Ｂｔ）种群不同亚种存在的蜡状芽孢杆菌肠毒素基因及溶血素ＢＬ进行检测，以便评估Ｂｔ对人类及高等动物潜在的致病性。方法采用多重引物ＰＣＲ技术，在同一ＰＣＲ体系同时加两对引物，ｈｂｌＡ及ｂｃｅＴ基因的扩增片段分别为１０１７ｂｐ及４２７ｂｐ，与预期的完全一致；应用ＨＢＬ羊血平板，产溶血素ＢＬ的菌株可产生非连续型溶血环。结果４５株Ｂｔ标准株中，２９株含有ｈｂｌＡ基因，占６４．４％；１５个生产用菌株及野生株中，含ｈｂｌＡ基因的菌株为１０株，占６６．６６％；含ｂｃｅＴ基因的标准株２９株，占６４．４％，含ｂｃｅＴ的Ｂｔ生产用菌株及野生株为１３株，占８６．６％。ＨＢＬ羊血平板检测结果表明：２８．８％的Ｂｔ标准株及３３．３％的Ｂｔ生产用菌株及野生株含溶血素ＢＬ。结论ｈｂｌＡ及ｂｃｅＴ基因在苏芸金芽孢杆菌中是普遍存在的，建议在遴选Ｂｔ生产菌株时，选用不含肠毒素基因或含肠毒素基因而不表达或表达水平不高的菌株     

中国株白喉杆菌白喉毒素全基因编码序列的克隆及其…

通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）从一中国株中型白喉产毒杆菌的β噬菌体基因组中克隆出１０６５碱基对的白喉毒素全基因编码序列，将ＰＣＲ产物直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ／载体系统，经有关限制性内切酶消化，核苷酸序列分析表明，成功的克隆出白喉毒素全基因编码序列。利用上下游引物中导入的Ｎｄｅ Ⅰ和ＢａｍＨ Ⅰ位点，将白喉毒素基因插入原核表达载体ＰＥＴ－３ａ，从而构建出白喉毒素表达载体ＰＥＴ／ＤＴ。以ＢＬ２１（ＤＥ３）     

日本立克次体ompB蛋白基因的克隆及序列分析

参照立氏立克次体分子量为１２×１０４蛋白基因序列合成引物，分两段扩增日本立克次体的１２×１０~４蛋白基因，扩增ＤＮＡ的长度分别为２．５和２．６ｋｂ。含有启动子区的２．６ｋｂ片段在ｐＵＣ１９质粒中不稳定。从这段ＤＮＡ删去启动子及８５个氨基酸编码子区的扩增产物可被克隆。以这一重组质粒为载体克隆含终止密码子的２．５ｋｂ片段。序列分析表明开放阅读框架由４９５６核苷酸对组成，编码１６５２个氨基酸。日本立克次体与立氏立克次体ｏｍｐＢ基因的遗传同源性是９５．５％，表明分子量１２×１０~４可能被用于制备抗斑点热立克次体感染的亚单位疫苗。     

苏云金芽孢杆菌杀蚊新菌株LLP29对白纹伊蚊作用机理的研究

从武夷山自然保护区白玉兰叶片上分离获得1株新的苏云金芽孢杆菌菌株LLP29,内含cyt1Aa6杀蚊基因。纯化的Cyt1Aa6毒素蛋白对白纹伊蚊幼虫和C6/36细胞都有高效活性。为更好地利用该菌株对白纹伊蚊进行生物防治,本试验以白纹伊蚊敏感品系及C6/36细胞为研究对象初步研究了其作用机理。免疫荧光染色和免疫组织化学实验结果表明:Cyt1Aa6毒素蛋白主要结合于C6/36细胞膜和白纹伊蚊幼虫中肠上。     

炭疽芽孢杆菌IS605插入位点在细菌检测与基因分型中的应用研究

目的研究并分析我国炭疽芽孢杆菌(Ba)中IS605的分布,探讨以插入序列IS605检出Ba和对其进行分型的可能性。方法按照已发表的Bacillus anthracis str.‘Ames Ancestor’全基因序列全部7个位置的IS605设计引物,对90株Ba进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分析,得到了相应的分布,最终通过测序确定差异的性质。结果此次研究中90株Ba的IS605完全一致。但对5、6、7这3个位置与Ba近缘的细菌比较发现仅Ba出现阳性扩增结果。结论IS605在Ba稳定存在,研究范围内所有菌株仅5、6、7这3个位置均有插入,因此这3个位置可以作为Ba与其他芽孢杆菌识别的特征;IS605定位不适合作为Ba的分型指标。     

程序死亡蛋白1基因的克隆及原核表达

目的 克隆人程序死亡蛋白(PD-1)基因并构建PD-1蛋白的原核表达质粒,在大肠埃希菌中进行表达.方法 用RT-PCR的方法从慢性乙肝患者外周血淋巴细胞总RNA中逆转录得到PD-1基因的cDNA,构建PD-1基因的原核表达质粒,在大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达并纯化.用SDS-PAGE、DNA测序、氨基酸测序等方法对表达蛋白进行鉴定.结果 克隆到PD-1基因编码区全长序列cDNA,经DNA测序与已报道的序列同源性达99.8%.构建得到PD-1的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达,纯化获得纯度较高的PD-1蛋白.氨基酸测序证明表达蛋白的正确性.结论 成功克隆人PD-1基因,在大肠埃希菌中获得表达,得到纯化的PD-1蛋白,为进一步研究PD-1蛋白的功能及应用打下基础.     

纤维连结蛋白启动子的克隆及转录活性的研究

目的：克隆纤维连结蛋白（FN） 启动子和检测其转录活性，并初步研究增加SV40增强子对其转录活性的影响。方法:从正常人gDNA中克隆FN启动子，驱动氯霉素乙酰转移酶报告基因表达，构建成有SV40增强子和无SV40增强子两个重组体报告载体。利用脂质体介导的转染技术导入HT1080细胞，检测各重组体的瞬时表达，确定克隆FN启动子转录活性和SV40增强子对其转录活性的影响。 结果:克隆的FN启动子在HT1080细胞中活性比SV40启动子稍强，在加入SV40增强子时活性提高了约6倍。 结论:成功的克隆FN启动子，在HT1080细胞中有活性，通过增加SV40增强子能大大提高其活性，为运用FN启动子和特异性靶细胞治疗各种遗传性疾病提供了一定基础。     

人核糖体磷酸蛋白P2基因的克隆及鉴定

利用聚合酶链式反应技术（ＰＣＲ），从人肺巨细胞癌ＰＬＡ－８０１母系细胞系统克隆化高转移细胞株Ｄ中特异性扩增Ｐ２ ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ２ ｇｅｎｅ ｃＤＮＡ），并将扩增产物克隆入ｐＧＥＭ－３Ｚ载体，获得了重组质粒ｐＭＰ２，对其中两个克隆ｐＭＰ２－１、ｐＭＰ２－２的Ｐ２ ｃＤＮＡ进行了序列分析。结果表明：ｐＭＰ２－１的Ｐ２ｃＤＮＡ序列与文献报道基本     

小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

目的 克隆小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段,制备小鼠Klotho多克隆抗体.方法 以小鼠基因组为模板进行PCR,克隆了小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因外显子Ⅳ部分序列,经BamHⅠ和NheⅠ双酶切后定向克隆到质粒pET-GST中,构建原核表达质粒pET-GST-Klotho,转化大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达.以重组GST-Klotho融合蛋白免疫家兔, 制备Klotho多克隆抗体.结果 表达产物经SDS-PAGE检测表明,在大肠埃希菌中成功表达了GST-Klotho融合蛋白,GST-Klotho融合蛋白表达量占菌体总蛋白的15 %左右;另外通过ELISA法测得抗血清抗体效价约为1∶ 10 000,Western印迹分析验证了抗体特异性.结论 GST-Klotho融合蛋白的表达和Klotho多克隆抗体的制备为进一步研究Klotho蛋白在小鼠体内的表达模式以及相关抗衰老药物的研制奠定了基础.     

金黄色葡萄球菌SPA基因的克隆、表达及纯化

目的:构建携带StaphylococcalproteinA(SPA)基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的SPA。方法:用PCR从金黄色葡萄球菌基因组中扩增SPA基因并克隆入pET32a( )载体中,在大肠杆菌BL21〈DE3〉中表达。表达产物经亲和层析进行纯化。结果:所构建的原核表达载体为高效表达载体,工程菌表达的SPA约占菌体总蛋白的40%,经亲和层析纯化后获得SPA,纯度达到99%。结论:成功地建立了制备及纯化SPA的方法,为SPA大量生产以及构建SPA融合表达体系奠定了基础。     

PEG10基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

肝癌是我国主要恶性肿瘤之一,其死亡率在所有肿瘤中居第二位.近年来随着诊疗手段的不断提高,肝癌的预后有所改善,但生存率仍很低.     

CILP-MBP基因重组蛋白的亚克隆构建及温度可溶性诱生表达

目的：构建Cartilage Intermediate Layer Protein（CILP)基因组后半部分（C2)亚克隆可溶性重组蛋白表达系统。方法：应用基因克隆技术，提取C2的3个首尾互相重叠的小片段的目的基因（C2F1，C2F2，C2F3），将其重新克隆到pMAL-eHis表达载体中，分别命名为C2F1，C2F2，C2F3-MBP，并尝试在用化学诱导（IPTC）的同时，用不同的温度（22℃，30℃，37℃）来诱导重组基因表达可溶性重组蛋白。结果：重新构建表达载体后，经过异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）化学诱导，在各种诱导温度下重组载体均可表达目的基因蛋白，但在30℃下有大量的可溶性蛋白表达，而在37℃时，重组蛋白主要以不溶性包涵体形式表达，22℃时蛋白不能被充分诱生表达。基因测序和 SDS-PAGE，Western Blot结果均表明这3种重组蛋白含有目的基因和羧基末端的6个组氨酸残基，从而为下一步的亲合层析提供了便利条件。结论：成功构建了C2部分的3个小片段的可溶性MBP融合蛋白表达载体，从而为进一步研究CILP，功能提供了重要的工具。     

抗人精浆蛋白单抗κ链基因的克隆及其在HeLa细胞的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白单抗（mAb)κ链基因，并将其转染到HeLa细胞进行表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白mAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA，用RT－PCR法获取κ链cDNA。将其克隆入真核表达载体pcDNA3，用脂质体转染法转染HeLa细胞，并用免疫荧光染色法检测κ链的表达。结果从分泌抗人精浆蛋白的鼠mAb杂交瘤细胞系E4B7中克隆了κ链基因。序列测定表明，Vκ属于鼠免疫球蛋白XⅢ家族。以含κ链基因的真核表达载体pcDNA3-E4B7κ转染HeLa细胞后，在HeLa细胞中检测到了κ链的表达。结论 获得了序列正确的κ链基因，并在HeLa细胞中成功地表达，为进一步构建和表达Fab段打下了良好基础。     

小鼠PGRP-L编码区基因的克隆及序列分析

目的：获得小鼠长型肽聚糖识别蛋白（mPGRP—L）全长编码区基因。方法：采用RT—PCR技术，从BALB／c鼠肝组织总RNA中扩增PGRP-L编码区基因片段，将其插入pUCm-T载体，以PCR和测序进行鉴定。结果：从BALB／c小鼠肝脏cDNA中，分别以Primer—F和Primer—R1、Primer—F1和Primer—R为引物对进行PCR，扩增得到约1050bp的上游基因片段和约540bp的下游基因片段。以纯化的上、下游片段为模板，Primer—F和Primer—R为引物进行PCR，扩增获得约16aHDbp的DNA片段，并将其克隆至pMD18-T载体获得重组质粒pMD18-mPGRP-L。鉴定结果表明，mPGRP—L编码区基因全长1593bp，与GenBank中mPGRP—LcDNA比较仅2个位置的核苷酸不同，两者的同源性为99．87％。结论：成功地克隆了mPGRP—L的cDNA，为mPGRP—L分子的研究奠定了一定基础。     

"牵引丝蛋白基因"单体六聚物的克隆与原核表达

目的克隆与原核表达“牵引丝蛋白基因”单体六聚物,为开展具有不同长度系列的“牵引丝蛋白基因”单体多聚物的功能研究奠定基础。方法以“牵引丝蛋白基因”单体为基础,利用同尾酶聚合法构建含“牵引丝蛋白基因”单体六聚物的重组克隆质粒pUC18-6 S和重组原核表达质粒pET-28 a( )-6S。将pET-28 a( )-6 S转化至大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞感受态菌中,利用IPTG进行诱导。结果重组克隆质粒pUC18-6 S和重组原核表达质粒pET-28 a( )-6 S的测序结果与预期设计序列相同;SDS-PAGE结果发现,目的基因以包涵体的形式表达;薄层扫描分析结果表明,6 S蛋白的表达量约占菌体总蛋白的19%。结论克隆获得了“牵引丝蛋白基因”单体六聚物的重组克隆质粒和重组表达质粒,且重组表达质粒在原核系统中以包涵体的形式表达6 S蛋白。     

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的：克隆人LIGHT胞外区基因（hsLIGHT），构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT，将其克隆人原核表达质粒pGEX-4T-2，构建其重组表达质粒pGEX-4T-2／hsLIGHT，以不同浓度IPTG诱导表达，于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果：经RT-PCR扩增获得的hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致；SDS-PAGE和Westernblot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47000的蛋白，与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌E-coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT，为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。     

HIV-1蛋白酶基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的为了研究HIV-1蛋白酶的生物学活性,制备HIV-1 PR蛋白及其特异性抗体。方法用PCR方法扩增编码PR的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并表达HIV-1 PR蛋白,用His抗体为一抗做Western blot鉴定目的蛋白。以纯化的目的蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),免疫细胞化学法检测抗体滴度及其特异性。结果原核表达载体pET28 a(+)-PR成功构建,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到的PR蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确。用纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论得到纯化的HIV-1PR蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白PR,为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。