两种载体表达人乳头瘤病毒6型L_1基因的比较

以表达融合蛋白的载体PUR288以及高效表达载体PBV221作载体,在大肠杆菌内成功地表达了我国克隆的HPV6BVL_I基因,并对表达蛋白进行免疫学鉴定,对两种载体的表达情况进行了讨论。     

重组人乳头瘤病毒16型E7抗原痘苗病毒的构建

目的 :研究人乳头瘤病毒 16型E7(HPV16E7)基因蛋白的生物学和免疫学活性。方法 :用聚合酶链反应(PCR)技术扩增并分离出HPV16E735 9bp的基因片段 ,经XhoⅠ和BglⅡ双酶切后 ,定向插入到表达质粒PJ12 0的晚期启动子P11下游。结果 :经PCR技术、双酶切分析证明HPV16E7基因已克隆到载体PJ12 0上。结论 :HPV16E7基因痘苗病毒重组体构建成功 ,为其在真核细胞的表达奠定了基础     

人乳头瘤病毒16型E7DNA疫苗的构建及其诱导特异性淋巴细胞增殖的研究

目的 :探讨人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )E7DNA疫苗诱导机体特异性细胞免疫应答的情况。方法 :采用分子克隆技术 ,构建HPV16野生型E7基因的真核表达重组体 ,将其转化大肠杆菌JM10 9进行筛选 ,通过限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析 ,证明重组质粒中目的基因插入片段及载体DNA大小、方向、插入位点均正确 ,获得HPV16E7DNA疫苗 ,将E7DNA疫苗经皮内注射免疫动物 ,MTT比色法体外检测特异性淋巴细胞增殖反应。结果 :野生型E7DNA疫苗免疫组脾淋巴细胞在体外受到E7蛋白的再次刺激后出现特异性淋巴细胞增殖反应。结论 :野生型E7DNA疫苗可诱导特异性的细胞免疫应答 ,皮内注射HPVDNA疫苗是一种简便有效的免疫接种途径     

人乳头瘤病毒18型E7蛋白基因的克隆研究

根据人乳头瘤病毒ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８的核苷酸序列，设计扩增其Ｅ７基因的特定引物，并使引物进５′端引入ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ酶切位点，用聚合酶反应扩增ＨＰＶ１８Ｅ７片段，通过ｐＵＣ１８质粒载体多聚接头的ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ双酶切位点与Ｅ７基因片段连接，构建一新的重组体，转化到大肠杆菌ＪＭ１０９，经筛选，快提质粒等鉴定，初步证实获得了ＨＰＶ１８Ｅ７基因的重组体。     

RASSF1A基因在子宫颈癌组织中的表达及其与人乳头瘤病毒-16感染的关系

目的 探讨RASSF1A mRNA在子宫颈癌组织中的表达与子宫颈癌发生、发展的作用及其与HPV-16感染的关系。方法 采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测56例子宫颈癌组织、36例子宫颈上皮内瘤样病变（CIN）组织和20例子宫颈正常组织中RASSF1A mRNA的表达;同时采用聚合酶链反应（PCR）检测子宫颈癌组织中HPV-16感染情况。结果 正常宫颈、CIN和子宫颈癌组织中的RASSF1A mRNA的表达缺失率分别为0％（0／20）、22．2％（8／36）和50．0％（28／56）。晚期（Ⅲ～Ⅳ期）宫颈癌组织中RASSF1A mRNA的表达缺失率（82．4％）明显高于其在早期（Ⅰ-Ⅱ期）宫颈癌组织中的表达缺失率（35．9％）。子宫颈鳞癌组织中RASSF1A mRNA的表达缺失率（63．3％）明显高于其在子宫颈腺癌中的表达缺失率（34．6％）（P〈0．05）。子宫颈癌组织低分化组的RASSF1A mRNA的表达缺失率（70．8％）明显高于其在中、高分化组（37．5％）中的表达缺失率。子宫颈癌组织中RASSF1A mRNA的表达缺失与HPV-16感染呈负相关（P〈0．05）,且这种关系在子宫颈腺癌中表现的更加明显。结论 RASSF1A基因的表达缺失可能在子宫颈癌的发生、发展过程起着重要的作用。     

人乳头瘤病毒18型晚期基因L1的克隆及测序

人乳头瘤病毒是宫颈癌的主要致病因素，其中ＨＰＶ１８致病进程晚具侵袭性，其晚期基因Ｌ１现被有竽疫苗学研究。本实验从ＨＰＶ１８－ＰＢＲ３２２质粒中克隆ＨＰＶ１８Ｌ１片段，构建了ＨＰＶ１８Ｌ１－ＰＧＥＭ重组质粒。对Ｌ１片段峡谷端测序时发现，原始报道序列在５７０１和６８４２位置的碱基为Ｃ，而实际测序结果均为Ｇ，推断其相应三联密码子编码的氨基酸变化分别为Ｐｒｏ→Ａｒｇ，Ｐｒｏ→Ｐｒｏ。     

人乳头瘤病毒E6E7基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的:利用AdEasy系统构建人乳头瘤-16(HPV-16)E6 E7基因重组腺病毒,并通过Western Blot方法检测E6E7蛋白的表达.方法:将质粒pET-32a( )-E6E7扩增、酶切获得E6E7片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack-CMV的巨细胞病毒(CMV)启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-E6E7,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-E6E7,经人胚肾293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒Ad-E6E7;用包装后的病毒上清再次感染293细胞,提取细胞中的蛋白,通过Western Blot方法检测E6E7蛋白的表达.结果:连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAd-E6E7;经人胚肾293细胞包装,3 d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)明显表达,氯化铯梯度离心纯化最终获得6.9×1010 pfu/L滴度的重组病毒;用该滴度的Ad-E6E7重新感染人胚肾293细胞3 d后,提取细胞蛋白,Western Blot检测,E6E7有明显表达.结论:利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6E7的重组腺病毒Ad E6E7.     

HPV16L1E7的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：研究人乳头瘤病毒(HPV)的主要衣壳蛋白L1和主要的转化蛋白E7的融合基因在原核细胞中的表达，为研制HPVl6L1E7疫苗和诊断试剂盒提供依据。方法：采用聚合酶链反应(PCR)以重组质粒pUCl9UE7为模板扩增HPVl6L1E7基因片段，克隆至载体pMDl8-T中，并用限制性内切酶将HPVl6L1E7基因切下，克隆至原核表达质粒pQE30中，经IPTG诱导表达，再使用SDS-PAGE和蛋白印迹检测其抗原性和表达水平。结果：HPVl6L1E7融合蛋白能被抗HPVl6L1抗体识别，分子量为66KD，经IPTG诱导4h后，表达的HPVl6L1E7融合蛋白占菌体总蛋白量的25％以上。结论：成功构建的表达载体pOE30-L1E7可在原核表达细胞中高效表达，且表达出的HPVl6L1E7融合蛋白具有反应活性，可与HPVl6抗体发生反应。     

外源性tRNAser对人乳头瘤病毒E7基因表达的影响

目的:探讨哺乳动物细胞中特定外源性tRNAser(CGA)的表达对HPV6bE7蛋白转译的影响,为研究HPV抗原表达的机制提供实验依据。方法:提取重组真核表达质粒pSVtRNAser(含人tR-NAsercDNA的全部序列)、pcDNA3-WtE7(含野生型HPV6bE7ORF)、pcDNA3-HuE7(含优化密码人源化HPV6bE7ORF),EcoRI酶切鉴定pSVtRNAserKpnI和EcoRI双酶切鉴定pcDNA3-HuE7和pcDNA3-WtE7。将质粒DNApSVtRNAser分别与pcDNA3-WtE7或pcDNA3-HuE7混合,脂质体介导共转染COS-1细胞。转染后48h,做免疫荧光染色。结果:重组质粒酶切鉴定结果正确。免疫荧光检测显示:与野生型E7基因单独转染组相比,pSVtRNAser与pcDNA3-WtE7共转染的COS-1细胞中,E7蛋白的表达增强。pcDNA3-HuE7质粒单独转染的COS-1细胞中优化密码E7基因可获得有效表达,共转染后,荧光阳性细胞未见明显增多。Southernblot检测结果显示,在400bp处可见特异DNA条带,说明质粒pSV2tRNAser已转入COS-1细胞。结论:补充外源性pSVtRNAser对COS-1细胞中野生型HPV6bE7基因的表达有一定程度的增强作用。     

应用基因芯片技术检测高危型人乳头瘤病毒在宫颈癌筛查中的评价

目的 评价人乳头瘤病毒（HPV）分型基因芯片检测技术在子宫颈癌筛查中的临床价值。方法 2004年11月至2004年12月，在深圳南山区华侨城社区内15～59岁有性生活妇女中进行以人群为基础的横断面调查研究。对所有筛查妇女宫颈脱落细胞采用第二代杂交捕获技术（HC2）和基因芯片技术进行高危型HPV的检测，同时以液基细胞薄层涂片技术（1ET）行宫颈细胞学检查。对HPV阳性并且LCT≥未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞（ASCUS）或HPV阴性但LCT≥低度鳞状上皮内瘤样病变（LSIL）的妇女行阴道镜下活组织病理学检查，以病理结果作为验证两种HPV检测的参考标准。结果 共取组织标本122例。病理学结果证实该人群中无宫颈癌病例，子宫颈上皮内瘤样病变（CIN）Ⅲ级3例，CINⅡ级11例，CINⅠ级36例，慢性宫颈炎和鳞状上皮化生69例，正常宫颈3例。人群的HPV总检出率在HC2法为14．0％，基因芯片法为9．8％，HC2法HPV检出率明显高于基因芯片法（P〈0．001），二者一致性一般（Kappa=0．498）；随子宫颈病变级别升高，两种检测方法HPV阳性率均呈趋势性增加（P〈0．001和P〈0．005）。HC2法检测高危HPV对高度宫颈上皮内瘤样病变HSIL的灵敏度、特异度、准确性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比分别为100％、87．1％、87．3％、8．8％、100％、7．7和0．000；HPV分型基因芯片法以上各指标分别为78．6％、91．1％、90．9％、9．9％、99．7％、8．8和0．235。结论 第二代杂交捕获技术（HC2）高危型HPV检测仍是目前宫颈癌筛查较好的方法，基因芯片HPV分型检测除灵敏度尚需提高外，其余各指标均可与HC2法相媲美。     

人乳头瘤病毒16型L1基因乳酸杆菌表达载体的构建

目的:构建含人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1基因的乳酸杆菌分泌表达载体。方法:从培养的CasKi细胞中提取DNA为模板,经PCR得到HPV16L1衣壳蛋白基因,将其连接入乳酸杆菌分泌表达载体pVE5523质粒中,并转化入Top10菌中保存。结果:构建的HPV16L1-pVE5523重组表达载体经PCR鉴定正确;获得的目的基因片段经测序与GenBank公布的HPV16L1基因序列符合。结论:成功构建了HPV16L1-pVE5523表达载体。     

人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1基因的克隆和序列分析

目的 从已感染人乳头瘤病毒（HPV）的新鲜宫颈癌组织中获得HPV16型晚期表达基因L1，为HPV感染的检测和治疗奠定基础。方法 根据引物设计原则设计一对特异引物，并用PCR方法从宫颈癌组织中获得L1基因，用pGEM-T作为克隆物体，构建重组质粒并以双脱氧法双向测定插入片段序列，拼接出L1基因序列，自动测序验证并分析序列。结果 从西安地区1例宫颈癌临床标本克隆到的1株HPV16型L1蛋白编码序列经BLAST2．0分析与既往报道序列存在高度同蛋白编码序列经BLAST2．0分析与既往报道序列存在高度同源性。结论 构建的重组质粒为进一步研究L1蛋白的表达及其免疫学创造了条件。     

减毒沙门氏细菌为载体的人乳头瘤病毒双启动子DNA疫苗载体构建

目的 :构建一种廉价高效的防治宫颈癌的人乳头瘤病毒新型双启动子DNA疫苗。方法 :设计合成细菌厌氧诱导启动子Nir ,含有FNR顺式反应元件、RBS和真核基因Kozak元件 ,插入pTriEx真核启动子CMVIE下游 ,构建pCMVnir双启动子载体。将人乳头瘤病毒 16型L1L7,融合基因 ,插入pCMVnir,制备pCMVnirL1E7,转化减毒沙门氏细菌SL32 6 1,厌氧诱导表达 ,SDS PAGE和Westernblot分析检测Nir启动子的活性。结果 :经DNA序列和限制性内切酶鉴定分析 ,成功构建了HPV双启动子DNA疫苗载体pCMVnirL1E7,转化沙门氏细菌SL32 6 1,厌氧条件下可诱导表达HPVL1E7蛋白质。结论 :成功构建了一种与胞内寄生细菌(减毒沙门氏细菌 )匹配的双启动子DNA疫苗新型载体 ,并构建了HPV16pCMVnirL1E7新型DNA疫苗     

人乳头瘤病毒6b型重组减毒沙门菌的构建及表达

目的：构建ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１Ｅ７嵌合基因重组减毒沙门菌，为进一步粘膜免疫奠定基础。方法：用ＰＣＲ方法扩增获得ＨＰＶ６ｂ　的　Ｌ１Ｅ７　嵌合基因片段，ＴＡ　克隆后，再将Ｌ１－Ｅ７　基因克隆入ｐＴＥＴｎｉｒ１５　沙门菌表达质粒。用电转化法将重组表达质粒导入鼠伤寒减毒沙门菌Ｓ．ＢＲＤ５０９（△ａｒｏＡ，△ａｒｏＣ）中，厌氧诱导其表达，蛋白样品做ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　凝胶电泳　和ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析。结果：用ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ双酶切重组表达质粒ｐＴＥＴｎｉｒ１５６ｂＬ１Ｅ７可释放２３８９ｂｐ和１５５４ｂｐ两片段，结果与预计相符。ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果显示，重组沙门菌在约５６ＫＤ处有明显特异蛋白条带，而对照菌则无。结论：该重组沙门菌能特异地表达ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１－Ｅ７　融合蛋白，人乳头瘤病毒ＨＰＶ６ｂ　Ｌ１－Ｅ７重组减毒沙门菌构建成功。     

人4-1BB-hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建

目的：构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体。方法：ＰＣＲ扩增人４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ基因片段，用ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔＩ酶切４１ＢＢ胞膜外区，ＰｓｔＩ　、ＥｃｏＲ　Ｉ　酶切ｈＩｇＧ１Ｆｃ　，ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ　酶切ｐＣＤＮＡ３，纯化后的酶切产物经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，ＰＣＲ及测序鉴定。结果：连接反应产物转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选出多个阳性克隆；分别以针对４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ的引物进行ＰＣＲ扩增，电泳后观察到一５５８ｂｐ、７０８ｂｐ的特异性条带，与４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ相符，提示构建成功。进一步测序分析证明克隆在ｐＣＤＮＡ３　质粒中的４１ＢＢ和ｈＩｇＧ１Ｆｃ序列和读码框架正确，无基因突变。结论：成功构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体，为表达４１ＢＢ融合蛋白奠定基础。     

人乳头瘤病毒11型主要衣壳蛋白L1基因的克隆及序列分析

目的 从临床尖锐湿疣标本克隆人乳头瘤病毒（HPV）11型主要衣壳蛋白L1基因,进行序列测定及序列分析比较,以为研究该临床病毒株的免疫原性及流赞美同学奠定基础。方法 以临床尖锐湿疣标本总DNA为模板,用L1基因保守区简并引物以PCR方法分段扩增衣壳蛋白L1基因在部,重组入pGEM-3zf(-)质粒载体,以双脱氧法双向测定插入片段序列,拼接出L1基因序列,通过BLAST2.0与已报道序列进行比较。结果 从西安地区一尖锐湿疣临床标本克隆到的一株HPV11型L1蛋白编码序列与一文献报道大部分相同,但有些位点有点突变,结论 构建的pGEM-3zf(-)重组质粒为进一步通过杂交、体内分段表达等手段研究研究该株病毒L1蛋白的免疫学和流行病学性质创造了条件。     

反义cortactin基因真核重组质粒的构建及鉴定

目的:构建一个包含人皮层肌动蛋白(cortactin)反义基因的全部功能区的重组真核表达载体pcDNA3.0/cortactin,为进一步研究人皮层肌动蛋白对人肝癌细胞的转移影响的研究奠定基础. 方法: Trizol试剂法提取体外培养的人肝癌高转移细胞株MHCC97总RNA,经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的片段,PCR产物及真核表达载体分别双酶切后进行连接,并转化入大肠杆菌Ecoli.Dh5α扩增以获得重组载体. 结果: RT-PCR获得预期大小的特异性DNA片段,经PCR、双酶切鉴定及测序证实已将人皮层肌动蛋白基因cDNA片段正确的反向插入真核表达载体中. 结论: 成功获得反义pcDNA3.0/cortactin重组质粒.